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문제 정의
- 따라서 대식세포의 사멸이 혈관세포의 활성산소 생성에 어떤 영향을 미치는지 파악하기 위해 혈관세포의 활성산소를 대식세포의 사멸농도에 따라 측정해보았다. 대조군의 ROS Level을 1 ± 0.
- 따라서 본 연구에서는 미세유체시스템을 이용하여 동맥경화미세환경을 모사하고, 사멸한 대식세포가 혈관세포에게 어떠한 방식으로 영향을 미치는지 알아내고자 한다. 이를 위해 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS)와 Vascular EndothelialCadherin(VE-cadherin)을 가시화하여 대식세포의 사멸이 혈관세포에게 어떤 영향을 주고, 그들의 구조적, 기능적 특징에 관여하는 단백질의 발현과 활성산소(ROS) 발생 등에 어떤 변화가 생기는지 관찰하였다.
- 이 단백질은 혈관사이에 존재하는 cadherin들 중 가장 대표적이며, 직접적인 혈관의 투과성에 관여하여 백혈구와 암세포 등의 관외유출(extravasation) 조절에 중요한 역할을 하기도 한다[10]. 이렇게 중요한 역할을 담당하는 VE-cadherin의 발현에 대식세포의 사멸이 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 대식세포의 사멸 농도별 VE-cadherin의 밝기를 측정해보았다. VE-cadherin은 조성해준 RAW 264.
제안 방법
- 3일간의 실험군과 대조군 컨디션을 조성한 후 HUVECs의 몇가지 변화를 관찰하기 위해 세포의 염색을 진행하였다. 먼저 HUVECs의 활성산소(ROS) 발생을 관찰하기 위해 CM-H2DCFDA(Invitrogen) 용액(5.
- HUVECs이 가득 찬 후에는 대식세포의 사멸을 모사하기 위해 준비해 두었던 농도 별 사멸 대식세포와 배양액을 항온 수조(37℃)에 데워 HUVECs이 존재하는 반대편 미디어채널에 12시간 간격으로 주입하였다. 그 후, 3일간 배양하며 활성산소(ROS)와 세포의 수, VE-cadherin 등을 정량화 하였다.
- RAW 264.7의 배양액은 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)에 10%의 Fetal Bovine Serum(FBS)과 Antibiotic-Antimycotic 100x(Anti/Anti)를 1% 첨가하여 만들어 이용하였고, HUVECs은 EGM-2 Bullet Kit(Lonza)에 Anti/Anti를 1% 첨가하여 배양액을 제조하였다.
- RAW 264.7이 배양접시에 70∼80% 차면, scraper를 이용하여 세포를 때어 낸 후 트리판블루(trypan blue) 에세이를 통해 살아 있는 세포의 수를 측정하였다.
- 78 µg/ml)을 이용하여 세포 내부의 ROS를 염색하였다. 각 실험군과 대조군의 미디어채널의 미디어를 제거한 후 살아 있는 세포에게 CM-H2DCFDA 용액을 주입하여 1시간 동안 세포 인큐베이터(37˚C, 5% CO2)에 넣어 둔 후 두 번의 PBS washing을 통해 달라붙지 않은 염료를 제거하였다. 다음으로 HUVECs의 접합(junction)의 완전성(integrity)을 관찰하기 위해 투과성(permeability) 등의 기능적 특성에 중요한 역할을 하는 단백질인 VE-cadherin과 세포의 수를 측정하기 위해 핵의 염색을 진행하였다.
- 1% Triton X100 용액을 이용하여 permeabilizatiion을 진행하였다. 그 후 VE-cadherin의 면역염색을 위해 3% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액을 두시간 처리하여 blocking을 진행하였고, 이 후 VE-cadherin은 rabbit polyclonal antibody(Enzo-lifescience)를 3% BSA 용액에 1:100으로 희석하여 1차 염색을 진행하고, 이어 형광 표지 된 goat anti-rabbit 2차 항체(Abcam)를 이용하여 염색을 진행하였다. 2차 항체와 함께 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Invitrogen)도 1:1000으로 희석하여 같이 주입하여 핵의 염색도 같이 이루어졌다.
- HUVECs이 가득 찬 후에는 대식세포의 사멸을 모사하기 위해 준비해 두었던 농도 별 사멸 대식세포와 배양액을 항온 수조(37℃)에 데워 HUVECs이 존재하는 반대편 미디어채널에 12시간 간격으로 주입하였다. 그 후, 3일간 배양하며 활성산소(ROS)와 세포의 수, VE-cadherin 등을 정량화 하였다.
- 각 실험군과 대조군의 미디어채널의 미디어를 제거한 후 살아 있는 세포에게 CM-H2DCFDA 용액을 주입하여 1시간 동안 세포 인큐베이터(37˚C, 5% CO2)에 넣어 둔 후 두 번의 PBS washing을 통해 달라붙지 않은 염료를 제거하였다. 다음으로 HUVECs의 접합(junction)의 완전성(integrity)을 관찰하기 위해 투과성(permeability) 등의 기능적 특성에 중요한 역할을 하는 단백질인 VE-cadherin과 세포의 수를 측정하기 위해 핵의 염색을 진행하였다. 이를 위해 먼저 4% paraformaldehyde를 이용하여 세포 고정을 진행한 후, 바로 0.
- 동맥경화의 미세환경을 모사하며, 대식세포의 사멸이 혈관세포에게 미치는 영향을 분석하기 위하여 polydimethylsiloxane(PDMS) 기반의 미세유체 칩을 soft-lithography공정을 통해 제작하였다. 미세 유체칩의 구성은 가운데 하이드로겔 채널과 겔을 표면장력으로 가두기 위한 미세기둥, 그리고 겔채널 양쪽에 미디어를 채우기 위한 채널이 존재한다(Fig.
- 얻어진 ROS와 VE-cadherin 이미지는 Image J(NIH) 소프트웨어를 통해 밝기를 정량화 하였다. 또한 DAPI를 통한 세포의 핵 이미지를 통해 단위 면적당 세포의 수를 측정하였다. 세포의 수를 측정할 때에는 직접 개발한 Python 영상처리 프로그램을 이용하였다(Fig.
- 먼저 HUVECs의 활성산소(ROS) 발생을 관찰하기 위해 CM-H2DCFDA(Invitrogen) 용액(5.78 µg/ml)을 이용하여 세포 내부의 ROS를 염색하였다.
- 7이 배양접시에 70∼80% 차면, scraper를 이용하여 세포를 때어 낸 후 트리판블루(trypan blue) 에세이를 통해 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 세포의 수를 측정한 후 배양액을 세포와 섞어 다양한 농도(0(대조군), 0.5 M, 1 M, 2 M, M = 106 cells/ml)의 세포 현탁액(cell suspension)을 제작하였다. 제작된 세포 현탁액을 분주한 후 254 nm의 파장과 400 µW/cm2의 조사력을 갖는 자외선 핸드램프를 이용하여 40 J/m2의 자외선을 조사하였다.
- 소수성을 복원시킨 후 미세유체칩의 가운데에 존재하는 하이드로겔채널에 2.5 mg/ml의 fibrin gel을 주입하여 실제 혈관을 둘러싸고 있는 extracellular matrix(ECM)을 모사하였다. Fibrin gel을 겔화(gelation)시킨 후 한쪽 미디어채널에 HUVECs을 2 M의 농도로 60 µl 주입하고, 두시간 정도 후 세포가 달라붙은 것을 확인 하고, 배양액을 갈아주었다.
- 염색을 마친 후 대조군과 실험군 모두 같은 현미경 노출 값을 주어 이미징을 하여 ROS와 VE-cadherin, 세포의 핵 이미지들을 얻었다. 얻어진 ROS와 VE-cadherin 이미지는 Image J(NIH) 소프트웨어를 통해 밝기를 정량화 하였다. 또한 DAPI를 통한 세포의 핵 이미지를 통해 단위 면적당 세포의 수를 측정하였다.
- 염색을 마친 후 대조군과 실험군 모두 같은 현미경 노출 값을 주어 이미징을 하여 ROS와 VE-cadherin, 세포의 핵 이미지들을 얻었다. 얻어진 ROS와 VE-cadherin 이미지는 Image J(NIH) 소프트웨어를 통해 밝기를 정량화 하였다.
- 다음으로 HUVECs의 접합(junction)의 완전성(integrity)을 관찰하기 위해 투과성(permeability) 등의 기능적 특성에 중요한 역할을 하는 단백질인 VE-cadherin과 세포의 수를 측정하기 위해 핵의 염색을 진행하였다. 이를 위해 먼저 4% paraformaldehyde를 이용하여 세포 고정을 진행한 후, 바로 0.1% Triton X100 용액을 이용하여 permeabilizatiion을 진행하였다. 그 후 VE-cadherin의 면역염색을 위해 3% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액을 두시간 처리하여 blocking을 진행하였고, 이 후 VE-cadherin은 rabbit polyclonal antibody(Enzo-lifescience)를 3% BSA 용액에 1:100으로 희석하여 1차 염색을 진행하고, 이어 형광 표지 된 goat anti-rabbit 2차 항체(Abcam)를 이용하여 염색을 진행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 미세유체시스템을 이용하여 동맥경화미세환경을 모사하고, 사멸한 대식세포가 혈관세포에게 어떠한 방식으로 영향을 미치는지 알아내고자 한다. 이를 위해 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS)와 Vascular EndothelialCadherin(VE-cadherin)을 가시화하여 대식세포의 사멸이 혈관세포에게 어떤 영향을 주고, 그들의 구조적, 기능적 특징에 관여하는 단백질의 발현과 활성산소(ROS) 발생 등에 어떤 변화가 생기는지 관찰하였다. 이를 통해 앞으로 동맥경화증의 정확한 원인을 규명하는데 도움이 되었으면 한다.
- 제작된 세포 현탁액을 분주한 후 254 nm의 파장과 400 µW/cm2의 조사력을 갖는 자외선 핸드램프를 이용하여 40 J/m2의 자외선을 조사하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 두가지의 세포주가 이용되었다. 대식세포의 사멸을 모사하기 위해서는 RAW 264.7(ATCC)이라는 쥐의 혈액으로부터 채취한 대식세포의 세포주를 사용하였고, 혈관세포는 Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVECs, Lonza)를 이용하였다.
- 본 연구에서는 두가지의 세포주가 이용되었다. 대식세포의 사멸을 모사하기 위해서는 RAW 264.
데이터처리
- 이렇게 중요한 역할을 담당하는 VE-cadherin의 발현에 대식세포의 사멸이 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 대식세포의 사멸 농도별 VE-cadherin의 밝기를 측정해보았다. VE-cadherin은 조성해준 RAW 264.7의 사멸농도가 높을 수록, 그 밝기가 낮아지는 경향을 확인하였고 (Fig. 3A), 실제 통계분석을 통해서 사멸 농도별 VE-cadherin의 밝기를 분석하였다(Fig. 3B). 대조군의 VE-cadherin intensity를 1 ± 0.
성능/효과
- 대조군의 VE-cadherin intensity를 1 ± 0.023 (standard error mean, a.u.)으로 하였을 때, 0.5 M의 실험군에서는 0.829 ± 0 .017, 1 M에서는 0.798 ± 0.037, 2 M에서는 0.551 ± 0.013의 분석결과를 얻을 수 있었다.
- 미세유체소자를 활용한 동맥경화 모사 환경에서 대식세포의 사멸은 HUVECs의 증식을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 HUVECs의 완전성에 관여하는 부착 단백질 인 VE-cadherin의 수준이 감소시키고, 혈관벽에 염증 세포의 부착과 침투를 촉진시키고 내막에서의 염증을 유도하는 ROS의 수준이 증가시켰다. 이것은 동맥경화가 낮은 VE-cadherin 수준의 부위에서 우선적으로 발생한다는 임상적 관찰과 일치한다[13].
- 또한, RAW 264.7의 사멸농도가 높을수록 혈관 세포의 수가 줄어드는 것을 확인하기 위하여 직접 개발한 영상처리 프로그램을 통해 단위 면적당 혈관세포의 핵의 수를 측정해본 결과, 대조군에서는 1822 ± 14 (standard error mean, 개/mm2)의 값이 계산되었고, 0.5 M에서는 1590 ± 20 개/mm2, 1 M에서는 1257 ± 27 개/mm2, 2 M에서는 1130 ± 31 개/mm2의 결과를 얻었다.
- 미세유체소자를 활용한 동맥경화 모사 환경에서 대식세포의 사멸은 HUVECs의 증식을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 HUVECs의 완전성에 관여하는 부착 단백질 인 VE-cadherin의 수준이 감소시키고, 혈관벽에 염증 세포의 부착과 침투를 촉진시키고 내막에서의 염증을 유도하는 ROS의 수준이 증가시켰다.
- 5 M에서는 1590 ± 20 개/mm2, 1 M에서는 1257 ± 27 개/mm2, 2 M에서는 1130 ± 31 개/mm2의 결과를 얻었다. 이를 통해 RAW 264.7의 사멸농도가 높을 수록 혈관을 이루는 혈관세포의 수와 혈관의 접합 및 완전성에 중요한 역할을 하는 VE-cadherin 밝기 모두 감소하는 경향을 확인할 수 있었다 (Fig. 3C).
- 31의 결과를 얻었다. 이를 통해 대식세포의 사멸농도가 증가함에 따라 혈관세포의 활성산소의 밝기도 높아짐을 확인하였다 (Fig. 4).
후속연구
- 이것은 동맥경화가 낮은 VE-cadherin 수준의 부위에서 우선적으로 발생한다는 임상적 관찰과 일치한다[13]. 이러한 연구결과는 앞으로 대식세포의 사멸 시 방출되는 다양한 생화학적 물질을 추가하며 물리적 환경을 모사하는 동맥경화 미세유체 시스템 개발 및 동맥경화증의 원인 규명을 위해 활용될 수 있을 것으로 전망한다.
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