[국내논문]감자 정아 동결보존과정에서 AFP 처리 시 저온관련 유전자의 발현양상 Expression pattern of low-temperature-related genes by the treatment of AFP in the cryopreservation of potato shoot tips원문보기
기내배양한 감자에 1일, 2일, 3일간 저온처리 후 저온관련 유전자의 발현양상을 조사하였다. 저온 처리 기간이 늘어날수록 PPI1, CI21B유전자의 발현양은 증가하였고, CBF4, CI21A 유전자의 발현양은 감소하였다. 또한 CI21A와 CI21B유전자의 잎, 줄기, 괴경에서 명 처리와 암 처리 기간별로 저온 처리기간에 따른 유전자의 발현의 차이를 보았다. 이에 근거하여 감자 정아의 동결과정 중에서 LS단계와 PVS2 단계에서 AFP를 농도별로 처리하였다. 그 결과, 저온처리 기간이 늘었을 때의 유전자 발현양상과 AFP 특정 농도에서의 발현 양상이 동일하였다. LS단계에서는 1,500 ng/ml AFP 처리와, PVS2단계에서 500 ng/ml AFP 처리가 감자 정아의 초저온동결보존에 효과적이라는 것을 유전자의 발현 양상으로 확인하였다.
기내배양한 감자에 1일, 2일, 3일간 저온처리 후 저온관련 유전자의 발현양상을 조사하였다. 저온 처리 기간이 늘어날수록 PPI1, CI21B유전자의 발현양은 증가하였고, CBF4, CI21A 유전자의 발현양은 감소하였다. 또한 CI21A와 CI21B유전자의 잎, 줄기, 괴경에서 명 처리와 암 처리 기간별로 저온 처리기간에 따른 유전자의 발현의 차이를 보았다. 이에 근거하여 감자 정아의 동결과정 중에서 LS단계와 PVS2 단계에서 AFP를 농도별로 처리하였다. 그 결과, 저온처리 기간이 늘었을 때의 유전자 발현양상과 AFP 특정 농도에서의 발현 양상이 동일하였다. LS단계에서는 1,500 ng/ml AFP 처리와, PVS2단계에서 500 ng/ml AFP 처리가 감자 정아의 초저온동결보존에 효과적이라는 것을 유전자의 발현 양상으로 확인하였다.
The expression profiles of low-temperature-related genes were examined in in vitro potatoes exposed to a cold condition for 1-3 days. The expression levels of PPI1 and CI21B genes were lineraly elevated from day 1 to day 3, while the opposite trend was observed for CBF4 and CI21A. In addition, the e...
The expression profiles of low-temperature-related genes were examined in in vitro potatoes exposed to a cold condition for 1-3 days. The expression levels of PPI1 and CI21B genes were lineraly elevated from day 1 to day 3, while the opposite trend was observed for CBF4 and CI21A. In addition, the expression of the genes CI21A and CI21B varied, along with specific tissues (leaf, stem, and tuber) and the treatment periods. Therefore, potato shoot tips were cryopreserved with LS and PVS2 containing different oncentrations of AFP. It can thus be inferred that the presence of AFP in LS and PVS2 was likely to elevate expression pattern of the genes. Furthermore, the concentration of AFP (1,500 ng/ml for LS and 500 ng/mg for PVS2) was the best for the cryopreservation of potatoes.
The expression profiles of low-temperature-related genes were examined in in vitro potatoes exposed to a cold condition for 1-3 days. The expression levels of PPI1 and CI21B genes were lineraly elevated from day 1 to day 3, while the opposite trend was observed for CBF4 and CI21A. In addition, the expression of the genes CI21A and CI21B varied, along with specific tissues (leaf, stem, and tuber) and the treatment periods. Therefore, potato shoot tips were cryopreserved with LS and PVS2 containing different oncentrations of AFP. It can thus be inferred that the presence of AFP in LS and PVS2 was likely to elevate expression pattern of the genes. Furthermore, the concentration of AFP (1,500 ng/ml for LS and 500 ng/mg for PVS2) was the best for the cryopreservation of potatoes.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구는 감자의 초저온 동결보존 기술을 향상시키기 위하여 액체질소에 침지하기 전 전처리 단계에서 다양한 농도의 AFP를 처리하여 저온관련 유전자의 발현양상을 비교 분석하여 초저온 동결보존 시 적정 AFP의 농도를 규명하고자 실험을 수행하였다.
제안 방법
AFP 처리 후 저온관련 유전자를 screening 하기 위하여 마디배양을 통하여 얻은 기내 식물체를 기본식물로 하여 생산한 씨감자 1세대 괴경을 온실에 파종하여 4주간 배양시킨 다음 4°C 저온 하에서 광도 37 µmol･m-2･s-1, 16시간 일장으로 1일, 2일, 3일 처리하고 잎, 줄기, 괴경에서 저온관련 유전자의발현 여부를 조사하였다.
2M sucrose 가 첨가된 washing solution에 옮겨 60 rpm, 20분 진탕배양 후 RNA 추출에 사용하였다. AFPs (A/F Protein Inc., Waltham,MA, USA)는 LS와 PVS2 단계에 각각 0 ng/ml, 500 ng/ml, 1,000ng/ml, 1,500 ng/ml, 2,000 ng/ml 씩 첨가하였다.
First-strand cDNA는High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 반응 조건은 30°C 10분, 42°C 30분, 99°C 5분 동안 1cycle 로 수행하였다.
RT-PCR은 cDNA 2 ul (1ng/ul), foward primer 10 pmol, reverse primer 10 pmol, PCRreaction mixture (Solgent, Korea) 15 ul, RNase free water를 넣어총 30 ul로 맞춰 95°C 2분(1 cycle) → 95°C 30초, 59°C 30초, 72°C 10초(30 cycle) → 72°C 5분(1 cycle)로 수행 후, SNA 50ul/l를 첨가 한 2% agarose gel에 로딩 시켰다.
Real-time PCR은 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 2X SYBR Green PCR master mixture10 ul, 2 pmol forward primer, 2 pmol reverse primer, cDNA 2 ul(100 ng/ul)를 혼합하고 RNase free water로 총 20 ul로 맞추었다.반응조건은 holding stage (95°C, 10분, 1 cycle) → cycling stage(95°C, 30초 / 59°C, 30초 / 72°C, 15초, 40 cycles) → melt curve stage (95°C, 15초 / 59°C, 30초 / 95°C, 15초)로 StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 사용하였으며, StepOne Software v2.
기내배양한 감자에 1일, 2일, 3일간 저온처리 후 저온관련 유전자의 발현양상을 조사하였다. 저온 처리 기간이 늘어날수록 PPI1, CI21B유전자의 발현양은 증가하였고, CBF4, CI21A유전자의 발현양은 감소하였다.
저온 처리 기간이 늘어날수록 PPI1, CI21B유전자의 발현양은 증가하였고, CBF4, CI21A유전자의 발현양은 감소하였다. 또한 CI21A와 CI21B유전자의 잎, 줄기, 괴경에서 명 처리와 암 처리 기간별로 저온 처리기간에 따른 유전자의 발현의 차이를 보았다. 이에 근거하여 감자 정아의 동결과정 중에서 LS단계와 PVS2 단계에서 AFP를 농도별로 처리하였다.
또한 CI21A와 CI21B유전자의 잎, 줄기, 괴경에서 명 처리와 암 처리 기간별로 저온 처리기간에 따른 유전자의 발현의 차이를 보았다. 이에 근거하여 감자 정아의 동결과정 중에서 LS단계와 PVS2 단계에서 AFP를 농도별로 처리하였다. 그 결과, 저온처리 기간이 늘었을 때의 유전자 발현양상과 AFP 특정 농도에서의 발현 양상이 동일하였다.
정단배양에 사용된 배지는 MS 기본배지(Murashige and Skoog 1962)에 3% (w/v) sucrose, 0.75% plant agar를 첨가하여 pH 5.7로 조절한 후, 121°C/1 bar에서 20분간 멸균하여 사용하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 감자(Solanum tuberosum L.)는 수미(Superior)품종을 사용하였으며, MS호르몬 무첨가 배지에서 4주 간격으로 마디배양 한 식물체에서 분리한 정단부위를 엽원기 4~5매를 포함시켜 동결본존을 위한 실험재료로 사용하였다.
초저온동결보존을 위하여 2 ~ 3 mm 크기의 정아를 10개 채취하여 MS기본배지에 0.3 M sucrose가 첨가된 pre-culturesolution에 넣고 60 rpm 속도로 24시간 진탕배양하였다. Preculture 후 정아를 MS기본배지에 0.
이론/모형
RNA 추출은 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany) 방법에 따라 추출하였고, 추출된 RNA는 UV spectrophotometer nano2000 프로그램을 사용하여 정량하였다. First-strand cDNA는High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 반응 조건은 30°C 10분, 42°C 30분, 99°C 5분 동안 1cycle 로 수행하였다.
성능/효과
저온 관련 유전자 중 CI21A, CI21B유전자의 잎, 줄기, 괴경에서 명 처리와 암 처리 기간별 유전자 발현 양상은 Figure 3과 같다. CI21A유전자는 저온 처리 기간이 경과할수록 모든 조직에서 발현양이 감소하였으며 잎과 줄기에서는 명 처리시 더 많이 발현되었고, 괴경에서는 암 처리시 더 많은 양이 발현되었다. 괴경에서 유전자 발현양 감소율은 명 처리에 비해 암 처리가 더 컸으며 또한 잎과 괴경에 비하여 줄기에서 발현양이 현저히 많았다.
2005). CI21B 유전자는 저온 처리 기간이 경과할수록 부위별 발현양이 늘었고 잎과 줄기에서는 저온 5일째 급격히 많이 발현되었다. 괴경에서는 저온 초기에는 암처리가 더 많이 발현하지만, 저온 5일째 명 처리에서 급격히 발현양이 증가하였다.
초저온동결보존 과정에서 LS와 PVS2 처리 단계에 AFP를 농도별로 처리하고 저온관련 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과, 4°C 저온 처리한 정아의 유전자 발현 양상과 LS와 PVS2의 AFP 특정 농도에서의 저온 관련 유전자 발현 양상이 같은 것으로 나타났다. LS에서 AFP 1,500 ng/ml을 처리했을 때, PPI1과 CI21B 유전자의 발현양은 크게 증가하였으나, CBF4, CI21A 유전자는 발현량이 다소 미미하였다(Fig. 4). PVS2에서는 AFP 500ng/ml을 처리했을 때, PPI1과 CI21B 유전자의 발현양은 증가하였으며, CBF4, CI21A유전자는 발현양은 상대적으로 적었다(Fig.
감자 정아의 저온처리 시 저온관련 유전자의 발현양을 조사한 결과(Figs. 1, 2), 저온처리 기간이 길어질수록 저온관련 유전자 중 PPI1, CI21B유전자의 발현양은 증가하였으나 CBF4, CI21A 유전자의 발현양은 감소하였다. PPI1 유전자는 플라즈마 막 양성자 펌프로 감자 정아와 화아에서 많이 발현되며, 저온 스트레스를 받으면 점차 늘어나며 48시간에 급속도로 늘어나는 것을 확인하였고, 토마토에서도 저온 스트레스를 받을수록 발현양이 증가하는 것으로 알려져 있다(Garcíaet al.
CI21A유전자는 저온 처리 기간이 경과할수록 모든 조직에서 발현양이 감소하였으며 잎과 줄기에서는 명 처리시 더 많이 발현되었고, 괴경에서는 암 처리시 더 많은 양이 발현되었다. 괴경에서 유전자 발현양 감소율은 명 처리에 비해 암 처리가 더 컸으며 또한 잎과 괴경에 비하여 줄기에서 발현양이 현저히 많았다.
이에 근거하여 감자 정아의 동결과정 중에서 LS단계와 PVS2 단계에서 AFP를 농도별로 처리하였다. 그 결과, 저온처리 기간이 늘었을 때의 유전자 발현양상과 AFP 특정 농도에서의 발현 양상이 동일하였다. LS단계에서는 1,500 ng/ml AFP 처리와, PVS2단계에서 500 ng/ml AFP 처리가 감자 정아의 초저온동결보존에 효과적이라는 것을 유전자의 발현 양상으로 확인하였다.
1997). 본 실험 결과에서는 CI21A유전자의 발현양은 저온처리 기간이 길어질수록 줄어들었고, 그와 반대로 CI21B 유전자는 저온처리 기간이 길어질수록 발현양이 증가하였다. 이는 2개의 유전자가 33% 다른 아미노산 sequence 차이로 인해 같은 처리에서 다른 유전자 발현 양상을 보이는 것으로 판단된다.
2000) 하는 결과와 본 실험 결과와 일치하였다. 이상의 결과를 종합해볼 때 감자 유전자원을 동결보존하기 위하여 동결보존 과정 중 LS 단계에서 AFP 1,500ng/ml 와 PVS2 단계에서 AFP 500ng/ml 처리하는 것이 저온관련 유전자 발현을 촉진시켜 초저온동결보존 후 식물체 재생에 보다 효과적일 것으로 판단된다.
기내배양한 감자에 1일, 2일, 3일간 저온처리 후 저온관련 유전자의 발현양상을 조사하였다. 저온 처리 기간이 늘어날수록 PPI1, CI21B유전자의 발현양은 증가하였고, CBF4, CI21A유전자의 발현양은 감소하였다. 또한 CI21A와 CI21B유전자의 잎, 줄기, 괴경에서 명 처리와 암 처리 기간별로 저온 처리기간에 따른 유전자의 발현의 차이를 보았다.
초저온동결보존 과정에서 LS와 PVS2 처리 단계에 AFP를 농도별로 처리하고 저온관련 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과, 4°C 저온 처리한 정아의 유전자 발현 양상과 LS와 PVS2의 AFP 특정 농도에서의 저온 관련 유전자 발현 양상이 같은 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
초저온동결보존법의 주요메커니즘은 무엇인가?
이러한 문제점을 해결하고 유전자원을 장기 저장할수 있는 가장 효율적인 방법은 액체질소를 활용한 초저온 동결보존법이다(Steponkus 1985; Stushnoff 1985). 초저온동결보존법은 저온에서 동결보호제가 세포 내 수분을 감소시켜 결빙을 줄이고 용질의 농도를 높여 생존율을 높이는 것이 주요메커니즘이다(Finkle et al. 1985; Withers 1985).
AFP의 장점은 무엇인가?
1993). AFP는 저온에 의해 유도되는 세포막의 손상을 보호 할 수 있고(Yeh and Feeney1996; Madura et al. 2000), 이는 생체 내에서 얼음결정의 생성및 재결정화를 억제하여 세포의 손상을 막아 생물체들이 생존할 수 있게 해준다(Davies and Sykes 1997; Davies et al. 2002;D'Amico et al.
액체질소를 활용한 초저온 동결보존법으로 해결할 수 있는 문제는 무엇인가?
1989). 하지만 영양번식 방법을 이용할 경우에는 비용과 노력이 많이 들고 바이러스나 세균및 해충에 노출될 가능성이 크며 또한 자연재해로 인한 유전자원의 손실 가능성과 재배 환경에 제약이 따른다(Seo et al.2005).
참고문헌 (30)
Arav A, Rubinsky B, Fletcher G, Seren E (1993) Cryogenic protection of oocytes with antifreeze proteins. Molecular reproduction and development 36:488-493
Carvallo MA, Pino M-T, Jeknic Z, Zou C, Doherty CJ, Shiu S-H, Chen TH, Thomashow MF (2011) A comparison of the low temperature transcriptomes and CBF regulons of three plant species that differ in freezing tolerance: Solanum commersonii, Solanum tuberosum, and Arabidopsis thaliana. Journal of experimental botany 62:3807-3819
Davies PL, Baardsnes J, Kuiper MJ, Walker VK (2002) Structure and function of antifreeze proteins. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences 357:927-935
Ekins S, Murray G, Hawksworth G (1996) ULTRASTRUCTURAL AND METABOLIC EFFECTS AFTER VITRIFICATION OF PRECISION-CUTRAT LIVER SLICES WITH ANTIFREEZE PROTEINS. Cryo-letters 17:157-164
Garcia MNM, Pais SM, Tellez-Inon MT, Capiati DA (2011) Characterization of StPPI1, a proton pump interactor from Solanum tuberosum L. that is up-regulated during tuber development and by abiotic stress. Planta 233:661-674
Jeon SM, Naing AH, Park KI, Kim CK (2015) The effect of antifreeze protein on the cryopreservation of chrysanthemums. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 123:665-671
Karimi M, Ebadi A, Mousavi SA, Salami SA, Zarei A (2015) Comparison of CBF1, CBF2, CBF3 and CBF4 expression in some grapevine cultivars and species under cold stress. Scientia horticulturae 197:521-526
Lee Y-J, Jeong J-C, Yoon Y-H, Hong S-Y, Kim S-J, Jin Y-I, Nam J-H, Kwon O-K (2012) Evaluation of Quality Characteristics and Definition of Utilization Category in Korean Potato (Solanum tuberosum L.) Cultivars. Korean Journal of Crop Science 57:271-279
Lizarraga R, Huaman Z, Dodds JH (1989) In vitro conservation of potato germplasm at the International Potato Center. American Journal of Potato Research 66:253-269
Madura JD, Baran K, Wierzbicki A (2000) Molecular recognition and binding of thermal hysteresis proteins to ice. Journal of Molecular Recognition 13:101-113
Mustafa RM, Abeer MA, James G,Song JY, Benildo GR (2005) The OsLti6 genes encoding low-molecular-weight membrane proteins are differentially expressed in rice cultivars with contrasting sensitivity to low temperature. Gene 344:171-180
Nicot N, Hausman J-F, Hoffmann L, Evers D (2005) Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. Journal of experimental botany 56:2907-2914
Pertaya N, Marshall CB, Celik Y, Davies PL, Braslavsky I (2008) Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: basal plane affinity confers hyperactivity. Biophysical journal 95:333-341
Sakai A, Kobayashi S, Oiyama I (1990) Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasiliensis Tanaka) by vitrification. Plant Cell Reports 9:30-33
Schneider A, Salamini F, Gebhardt C (1997) Expression patterns and promoter activity of the cold-regulated gene ci21A of potato. Plant physiology 113:335-345
Seo H-W, Yi J-Y, Park Y-E, Cho J-H, Hahm Y-I, Cho H-M (2005) Cloning of coat protein gene from Korean isolate potato leafroll virus (PLRV) and introduction into potato (Solanum tuberosum). Journal of Plant Biotechnology 32:243-250
Steponkus PL (1985) Cryobiology of isolated protoplasts: applications to plant cell cryopreservation. Cryopreservation of plant cells and organs CRC Press, Boca Raton:49-60
Stushnoff C (1985) The potential use of in vitro storage for temperate fruit germ-plasm: a status report. In, IBPGR
Wang J, Bian H, Zhang Y, Cheng H (2000) The dual effect of antifreeze protein on cryopreservation of rice (Oryza sativa l.) embryogenic suspension cells. Cryo letters 22:175-182
Withers LA (1985) Cryopreservation of cultured cells and meristems. Cell culture and somatic cell genetics of plants 2:253-316
Xiao H, Tattersall EA, Siddiqua MK, Cramer GR, Nassuth A (2008) CBF4 is a unique member of the CBF transcription factor family of Vitis vinifera and Vitis riparia. Plant, cell & environment 31:1-10
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.