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문제 정의
- 본 연구는 전통 메주로부터 분리하여 항진균 활성을 보인 B. subtilis SN7이 생성한 조항균 물질(Lee 2014)의 생체 내 안전성 확보를 위한 기초자료를 얻기 위하여 유전독성학적 안정성 평가를 실시하였다.
제안 방법
- 3일 동안 5 mL 배양액에 4×103 CHL 세포를 배양하여 시험물질과 양성대조물질인 motocycin(0.05 μg/mL)을 농도별로 전처리하였다.
- 냉각한 고정액(메탄올:빙초산 = 3:1)을 넣어 수차례 원심분리하여 상징액을 제거하고, 세포 부유액은 slide glass에서 염색체 표본을 제작하였다. 5%(v/v) Gimesa 용액으로 5분 간 염색 후, 수세, 건조한 다음 생세포계수기(BECKMAN COULTER, Indianapolis, IN, USA)로 세포수를 측정하였다. 관찰 세포 수의 결과는 각 농도군당 100개 이상(용량 당 200개)을 중기상으로 해석하였으며, 분열중기 세포의 선택 기준은 구조이상과 수적이상으로 나누어 판정하였다.
- HCL 세포를 이용한 염색체 이상시험과 소핵시험은 Scheffe 다중검정과 Dunnett’s T3를 실시하였다.
- 5%(v/v) Gimesa 용액으로 5분 간 염색 후, 수세, 건조한 다음 생세포계수기(BECKMAN COULTER, Indianapolis, IN, USA)로 세포수를 측정하였다. 관찰 세포 수의 결과는 각 농도군당 100개 이상(용량 당 200개)을 중기상으로 해석하였으며, 분열중기 세포의 선택 기준은 구조이상과 수적이상으로 나누어 판정하였다. 판정기준은 음성은 시험물질 처리군 중 구조이상세포 및 수적이상세포의 출현 빈도가 5% 미만일 것, 의양성은 시험물질 처리군 중 1 개 농도이상에서 구조이상세포 또는 수적이상세포의 출현빈도가 5% 이상과 10% 미만일 것, 양성은 시험물질 처리군 중 1 개 농도 이상에서 구조이상세포 또는 수적이상 세포의 출현빈도가 10% 이상이며, 용량의존적인 증가 경향이 인정되어진 것으로 최종 판정하였다.
- 075M KCl 용액 4 mL에 넣은 다음 수욕상(37℃, 15분)에서 저장 처리하였다. 냉각한 고정액(메탄올:빙초산 = 3:1)을 넣어 수차례 원심분리하여 상징액을 제거하고, 세포 부유액은 slide glass에서 염색체 표본을 제작하였다. 5%(v/v) Gimesa 용액으로 5분 간 염색 후, 수세, 건조한 다음 생세포계수기(BECKMAN COULTER, Indianapolis, IN, USA)로 세포수를 측정하였다.
- 05 μg/mL)을 농도별로 전처리하였다. 단시간 처리법(6시간)은 대사활성계 미적용(S9-) 혹은 적용(S9+) 두 처리 조건으로 실시하였으며, 연속처리법(24시간)은 대사활성계 미적용(S9-)인 경우만 실시하였다. 시험물질을 6시간 혹은 24시간 전처리한 후, 새로운 배양액으로 18시간 다시 배양하였다.
- 단시간처리법(6시간) 시험결과 음성으로 판정이 되었기 때문에 연속처리법(24시간 처리)을 실시하였다(Table 5). S9 mix 미적용(S9- mix) 연속처리법에 의한 염색체 이상시험 결과도 시험물질 처리군은 시험적용 용량인 1250∼5,000 μg/mL의 범위에서 침전이 나타나지 않았다(Table 5).
- 2009), 세균을 이용한 복귀돌연변이시험에서 검출하기 어려운 물질도 양성으로 나타나기 때문에 복귀돌연변이시험의 보충시험 방법으로 많이 사용하고 있다(Dean & Danford 1984). 따라서 본 연구에서도 Chinese hamster 유래의 lung cell을 이용하여 직접법(S9-)과 대사활성법(S9+)으로 부분 정제한 고초균(B. subtilis SN7) 조항균 물질의 염색체 이상시험을 실시하였다. 본 시험에 앞서 예비시험을 실시하였는데, 시험물질 처리군은 모든 농도에서(1250, 2500, 5000 μg/mL) 침전이 확인되지 않았다.
- 2008). 따라서 본 연구에서도 부분 정제한 고초균(B. subtilis SN7)의 조항균 물질을 수컷 ICR계통 마우스에 투여하여 소핵시험을 실시하였다. 시험물질 처리군과 음성대조군(멸균 증류수)는 임상 적용 예상 경로인 단회 경구 투여하였고, 양성대조군(CPA)은 복강 투여하였다.
- 최종 투여 후 24시간이 경과한 다음 마우스 골수로부터 채취한 혈액5 μL를 acridine orange 용액 40 μg/mL을 도포하여 공기 중에 건조시킨 slide glass에 떨어뜨리고, cover glass로 덮어 세포를 고정하였다(Hayashi 1991). 마우스 1마리당 2,000개의 망상적혈구(polychromatic erythrocyte, PCE)를 형광현미경 하에서 관찰하여 그중에서 초록색 형광을 띠는 소핵을 가진 망상적혈구(micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)를 측정하여 소핵생성 빈도를 계산하였다.
- 메주로부터 분리한 부분 정제한 고초균(B. subtilis SN7) 조항균 물질의 유전독성학적 안전성을 검토하기 위하여 세균을 이용한 복귀돌연변이 시험, CHL 세포를 이용한 염색체 이상시험 및 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 시험물질은 시험적용 용량인 312.
- 메주로부터 분리한 부분 정제한 고초균(B. subtilis SN7) 조항균 물질의 유전학적 안정성을 평가하기 위하여 먼저 세균을 이용한 돌연변이 유발성을 시험하였다(Table 1). 사용된 균주는 TA98, TA100, TA1535, TA1537 및 WP2uvrA이었으며, 이들 균주에 대한 복귀돌연변이 집락수를 조사하였다.
- Preincubation을 실시한 후, top agar 2 mL 넣어 혼합하여 VogelBonner medium glucose agar plate에 중층한 다음 37℃, 48시간 배양을 하였다. 배양 후 복귀돌연변이 콜로니 집락수를 계측하였으며, 육안과 현미경으로 시험물질의 침전, 분출, 균의 생육저해를 관찰하였다.
- 부분 정제한 고초균(Bacillus subtilis SN7) 조항균물질의 염색체이상시험은 Chinese hamster lung(CHL) fibroblast를 이용하여 실시하였다(Ishidate et al. 1981; Dean & Danford 1984).
- subtilis SN7)의 조항균 물질을 수컷 ICR계통 마우스에 투여하여 소핵시험을 실시하였다. 시험물질 처리군과 음성대조군(멸균 증류수)는 임상 적용 예상 경로인 단회 경구 투여하였고, 양성대조군(CPA)은 복강 투여하였다. 예비실험 결과 시험물질 처리군은 시험적용용량인 500∼2000 mg/kg의 범위에서 마우스에 경구투여 후 약 24시간에 골수세포를 수거하여 소핵유발을 평가하였는데, 음성대조군에 비하여 유의차가 없었으며, 부검 당일까지 사망동물도 없었다.
- 시험물질은 시험당일 멸균된 3차 증류수에 용해하여 사용하였다. 시험물질, 양성대조물질 및 양성대조물질은 24시간 간격으로 2회 경구 투여하였다. 최종 투여 후 24시간이 경과한 다음 마우스 골수로부터 채취한 혈액5 μL를 acridine orange 용액 40 μg/mL을 도포하여 공기 중에 건조시킨 slide glass에 떨어뜨리고, cover glass로 덮어 세포를 고정하였다(Hayashi 1991).
- 시험물질에 대한 농도 설정을 위한 예비 실험은 최고 농도인 5000 μg/plate를 공비 2로 5단계 농도(312.5, 625, 1250, 2500, 5000 μg/plate)로 각각의 균주에 처리하였다.
- 시험물질의 농도는 최고 농도인 5000 μg/mL로부터 공비 2로 3단계(1250, 2500, 5000 μg/mL)로 설정하였다.
- 자외선으로 멸균시킨 정제수와 멸균된 실험동물용 사료를 자유 급여하였다. 실험군당 5마리를 사용하였으며, 시험물질 투여 용량은 예비시험을 바탕으로 경구 투여 가능 최고 농도인 2000 mg/kg B.W.로부터 공비 2로 3단계 농도(500, 1000, 2000 mg/kg B.W.)를 설정하였다. 음성대조물질은 멸균된 3차 증류수, 양성대조물질은 cyclophosphamide monohydrate(70 mg/kg B.
- 특정 병원균 부재(SPF) 7주령된 수컷 Imprinting Control Region(ICR) 계통 마우스 30마리를 ㈜오리엔트바이오(Gapyeong, Korea)로부터 구입하였다. 실험동물은 1주일간의 적응기간을 거친 후, 일반 증상과 체중을 측정한 다음 폴리카보네이트 케이지에 넣어서 SPF구역에서 사육하였다. 자외선으로 멸균시킨 정제수와 멸균된 실험동물용 사료를 자유 급여하였다.
- 5, 625, 1250, 2500, 5000 μg/plate)로 각각의 균주에 처리하였다. 직접법과 S-9 혼합액을 이용한 대사활성법으로 수행하였으며, 최고 농도까지 시험물질에 의한 독성이 나타나지 않았다. 따라서 본 시험에서도 동일한 농도를 사용하였다.
- 처리 종료 2시간 전에 colcemid를 최종 농도 0.2 μg/mL이 되도록 첨가하여 분열중기세포를 축적하였다.
대상 데이터
- 메주로부터 분리한 항진균 활성이 있는 균주인 B. subtilis SN7 1%를 TSB(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 액체배지에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕 상태에서 배양하였다. 배양액 1%를 TSB 액체배지에 다시 접종하여 37℃, 24시간 동안 본 배양을 실시하였다.
- 본 시험은 식품의약품안전처 독성시험기준(Ministry of Food and Drug Safety, 2014)을 준하여 실시하였으며, 사용된 균주는 Salmonella typhimurium의 histidine 요구성 균주(TA98, TA100, TA1535, TA1537)와 Escherichia coli의 tryptophan 요구성 균주(WP2uvrA)로 총 5균주를 이용하였다. 시험물질은 시험 당일 멸균증류수로 농도별로 희석하여 용시 제조하여 사용하였으며, 음성대조군은 멸균증류수, 양성대조군은 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide(AF-2), 2-aminoanthracene(2-AA), 9-aminocridine(9-AA) 및 sodium azide(NaN3)이였다.
- subtilis SN7) 조항균 물질의 유전학적 안정성을 평가하기 위하여 먼저 세균을 이용한 돌연변이 유발성을 시험하였다(Table 1). 사용된 균주는 TA98, TA100, TA1535, TA1537 및 WP2uvrA이었으며, 이들 균주에 대한 복귀돌연변이 집락수를 조사하였다.
- 본 시험은 식품의약품안전처 독성시험기준(Ministry of Food and Drug Safety, 2014)을 준하여 실시하였으며, 사용된 균주는 Salmonella typhimurium의 histidine 요구성 균주(TA98, TA100, TA1535, TA1537)와 Escherichia coli의 tryptophan 요구성 균주(WP2uvrA)로 총 5균주를 이용하였다. 시험물질은 시험 당일 멸균증류수로 농도별로 희석하여 용시 제조하여 사용하였으며, 음성대조군은 멸균증류수, 양성대조군은 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide(AF-2), 2-aminoanthracene(2-AA), 9-aminocridine(9-AA) 및 sodium azide(NaN3)이였다. 복귀돌연변이시험은 유전독성에 대한 민감도가 비교적 높은 pre-incubation방법으로 실시하였다(Ames et al.
- )를 사용하였다. 시험물질은 시험당일 멸균된 3차 증류수에 용해하여 사용하였다. 시험물질, 양성대조물질 및 양성대조물질은 24시간 간격으로 2회 경구 투여하였다.
- )를 설정하였다. 음성대조물질은 멸균된 3차 증류수, 양성대조물질은 cyclophosphamide monohydrate(70 mg/kg B.W.)를 사용하였다. 시험물질은 시험당일 멸균된 3차 증류수에 용해하여 사용하였다.
- 특정 병원균 부재(SPF) 7주령된 수컷 Imprinting Control Region(ICR) 계통 마우스 30마리를 ㈜오리엔트바이오(Gapyeong, Korea)로부터 구입하였다. 실험동물은 1주일간의 적응기간을 거친 후, 일반 증상과 체중을 측정한 다음 폴리카보네이트 케이지에 넣어서 SPF구역에서 사육하였다.
데이터처리
- 결과는 평균과 표준편차(mean ± standard deviation)로 나타냈으며, p<0.05인 경우에 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 본 실험에서 얻은 결과는 SPSS 19.0 P/C package를 이용하여 통계처리를 실시하였다. 결과는 평균과 표준편차(mean ± standard deviation)로 나타냈으며, p<0.
성능/효과
- ICR 마우스 망상적혈구를 이용한 소핵 유발성 유무를 검토한 결과는 시험적용 용량인 500∼2,000 mg/kg의 범위에서 시험물질 투여로 사망동물이 확인되지 않았다.
- S9 mix 미적용(S9- mix) 혹은 S9 mix 적용(S9+ mix) 단시간 처리법(6시간), S9 mix 미적용(S9- mix) 연속처리법 (24시간 처리)으로 시료물질을 시험적용 용량인 1250∼5,000 mg/kg의 범위로 처리한 후 MTT 분석을 실시하였다 그 결과, 모든 시험법에서 50 % 이상의 세포증식 억제능이 관찰되지 않아 IC50은 산출하지 않았다(Table 2).
- 0%로 나타났다. S9 mix 미적용(S9- mix) 혹은 S9 mix 적용(S9+ mix) 단시간 처리법(6시간)에서 음성대조군은 구조이상 세포 및 수적이상 세포의 출현빈도는 5% 미만이였고, 양성대조군은 구조이상 세포의 출현빈도는 10% 이상 이었다.
- 개체 당 2000개 이상의 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 음성대조군 0.06 ± 0.04%, 500 mg/kg 투여군 0.02 ±0.0%, 1,000 mg/kg 투여군 0.02 ± 0.03%, 2,000 mg/kg 투여군 0.05 ± 0.04%, 양성대조군 3.88 ± 0.43%로 나타났다.
- 0 범위로 나와 통계적인 유의차가 없었으며, 핵내배화도 관찰되지 않았다. 그러나 양성대조군은 음성대조군과 시험물질 처리군에 비하여 이상중기상의 빈도가 통계적으로 유의하게 증가되었다. 표본관찰 결과를 살펴보면, S9 mix 미적용(S9-mix)하였을 경우 염색체 구조이상세포의 출현빈도는 시험물질 처리군의 시험적용 용량인 1250, 2500 및 5000 μg/mL 농도에서 각각 0.
- 0 범위로 나와 통계적인 유의차가 없었으며, 핵내배화도 관찰되지 않았다. 그러나 양성대조군은 음성대조군과 시험물질 처리군에 비하여 이상중기상의 빈도가 통계적으로 유의하게 증가되었다. 표본관찰 결과를 살펴보면, S9 mix 미적용(S9-mix)하였을 경우 염색체 구조이상세포의 출현빈도는 시험물질 처리군의 시험적용 용량인 1250, 2500 및 5000 μg/mL 농도에서 각각 0.
- 시험물질 처리군은 음성대조군에 비해 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도가 증가하는 경향이 관찰되지 않았으며, 통계적으로 유의차도 없었다. 그러나 양성대조군은 음성대조군에 비해 소핵 출현빈도가 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 세포독성 지표인 PCE/(PCE+NCE) 비율도 측정하였는데, 그 결과 음성대조군 56.
- 대사활성계 미적용(S9- mix) 혹은 적용(S9+)한 결과, 두 처리 조건에서 음성대조군과 시험물질 처리군은 이상중기상과 염색체 이상의 빈도가 0∼1, polyploid의 빈도는 0.0 범위로 나와 통계적인 유의차가 없었으며, 핵내배화도 관찰되지 않았다.
- 돌연변이성을 판정할 경우 보통 음성대조군의 복귀변이 집락수 2배 이상일 경우 양성으로 제시하는데(Ames et al. 1975; Maron & Ames 1983), 본 연구에서 양성대조군의 복귀돌연변이 집락수가 현저하게 증가하였으므로 본 시험이 적합하게 수행된 것을 알 수 있었다.
- 음성대조군의 집락은 자연 복귀돌연변이에 의해 형성되는 것이라 하였다(Maron & Ames 1983). 또한 대사활성계의 적용 유무와 상관없이 시험물질 처리군에서 침전도 확인되지 않았으며, 시험물질과 S9 mix의 무균시험 결과도 세균과 곰팡이의 오염이 관찰되지 않아 무균성을 확인하였다. 그러나 양성대조군의 복귀돌연변이 집락수는유의하게 증가하였다.
- 모든 조건과 농도에서도 시험물질 처리군이 음성대조군에 비하여 복귀돌연변이 콜로니수가 증가하지 않았다. 또한 음성대조군의 복귀변이 집락수도 본 시험에 사용된 균주인 TA98, TA100, TA1535, TA1537 및 WP2uvrA의 복귀변이 집락수의 범위 내에서 나타났다. 김치에서 분리한 항진균 활성이 있는 유산균인 L.
- 본 시험결과(Table 6) 모든 시험군에서 부검 당일까지 사망동물은 없었으며, 투여 시와 부검시의 체중을 비교한 결과 시험물질 투여군은 음성대조군에 비해 통계적인 유의성이 없었다. 개체 당 2000개 이상의 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 음성대조군 0.
- 세포독성 지표인 PCE/(PCE+NCE) 비율도 측정하였는데, 그 결과 음성대조군 56.01 ± 1.61%, 500 mg/kg 투여군 56.78 ± 1.02%, 1,000 mg/kg 투여군 55.31 ± 1.48%, 2,000 mg/kg 투여군 58.98±4.77%, 양성대조군 57.35 ± 2.25% 및 45.58 ± 0.94%로 나타났다.
- 43%로 나타났다. 시험물질 처리군은 음성대조군에 비해 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도가 증가하는 경향이 관찰되지 않았으며, 통계적으로 유의차도 없었다. 그러나 양성대조군은 음성대조군에 비해 소핵 출현빈도가 통계학적으로 유의하게 증가하였다.
- 94%로 나타났다. 시험물질 투여군은 음성대조군에 비해 PCE/(PCE+NCE) 비율이 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 양성대조군은 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 낮은 경향이었다. 따라서 부분 정제한 고초균(Bacillus subtilis SN7)의 조항균 물질은 마우스 골수세포에 소핵을 유발하지 않는 것으로 사려된다.
- 시험물질은 시험적용 용량인 312.5∼5,000 μg/plate 농도 범위에서 세균(TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA)에 대한 복귀변이 콜로니 수를 관찰한 결과, 대사활성계 도입 유무와 상관없이 모든 시험균주에 대하여 시험물질 처리군은 음성대조군에 비해 복귀돌연변이 콜로니 수가 농도 의존적으로 증가하지 않았다.
- 다염성 적혈구의 출현 빈도와 비율 평균치는 시험물질 투여군과 음성대조군은 유의적인 차이가 없어 소핵이 유발되지 않았으며, historical background data 범위 내에 존재하였다. 양성대조군은 다염성 적혈구의 출현 빈도와 비율 평균치가 음성대조군에 비하여 유의한 차이를 보였다. 이상의 결과에서 부분 정제한 고초균(B.
- 예비실험 결과 시험물질 처리군은 시험적용용량인 500∼2000 mg/kg의 범위에서 마우스에 경구투여 후 약 24시간에 골수세포를 수거하여 소핵유발을 평가하였는데, 음성대조군에 비하여 유의차가 없었으며, 부검 당일까지 사망동물도 없었다.
- 예비실험을 통하여 시험물질 처리군은 최고 농도인 5000 μg/plate 까지 대사활성계 미적용(S9-) 혹은 적용(S9+)의 모든 처리 조건에서 생육저해가 나타나지 않았으며, 복귀돌연변이 콜로니수도 음성대조군과 비교 시 증가하지 않았으며, 대사활성계의 적용 유무에 관계없이 plate 위에 침전도 확인되지 않았다.
- 음성대조군과 시험물질 처리군은 이상중기상과 염색체 이상의 빈도가 0∼1, polyploid의 빈도는 0.0 범위로 나와 통계적인 유의차가 없었으며, 핵내배화도 관찰되지 않았다.
- 0%이였다. 음성대조군의 구조이상 세포와 수적이상 세포의 출현빈도는 5% 미만, 양성대조군의 구조이상세포의 출현빈도는 10% 이상으로 나타났다. 이상의 결과 부분 정제한 고초균(Bacillus subtilis SN7)의 조항균물질은 유의할 만한 염색체이상이 나타나지 않았다.
- 음성대조군의 구조이상 세포와 수적이상 세포의 출현빈도는 5% 미만, 양성대조군의 구조이상세포의 출현빈도는 10% 이상으로 나타났다. 이상의 결과 부분 정제한 고초균(Bacillus subtilis SN7)의 조항균물질은 유의할 만한 염색체이상이 나타나지 않았다.
- 양성대조군은 다염성 적혈구의 출현 빈도와 비율 평균치가 음성대조군에 비하여 유의한 차이를 보였다. 이상의 결과에서 부분 정제한 고초균(B. subtilis SN7)의 조항균 물질은 유전독성이 없는 것으로 나타났다.
- 5∼5,000 μg/plate 농도 범위에서 세균(TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA)에 대한 복귀변이 콜로니 수를 관찰한 결과, 대사활성계 도입 유무와 상관없이 모든 시험균주에 대하여 시험물질 처리군은 음성대조군에 비해 복귀돌연변이 콜로니 수가 농도 의존적으로 증가하지 않았다. 콜로니 수의 음성 및 양성 대조치는 적정 범위 내에 있었으며, 양성대조군은 콜로니 수가 대사활성계 도입 유무와 상관없이 모든 균주에 대해서 유의하게 증가하였다. 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상시험에서 시험물질은 1,250∼5,000 mg/mL의 시험적용 용량에서 대사활성화계 유무와 시간에 상관없이 염색체 구조이상과 수적이상 세포의 출현빈도는 5% 미만이여서 염색체 이상 유발능이 나타나지 않았다.
- 관찰 세포 수의 결과는 각 농도군당 100개 이상(용량 당 200개)을 중기상으로 해석하였으며, 분열중기 세포의 선택 기준은 구조이상과 수적이상으로 나누어 판정하였다. 판정기준은 음성은 시험물질 처리군 중 구조이상세포 및 수적이상세포의 출현 빈도가 5% 미만일 것, 의양성은 시험물질 처리군 중 1 개 농도이상에서 구조이상세포 또는 수적이상세포의 출현빈도가 5% 이상과 10% 미만일 것, 양성은 시험물질 처리군 중 1 개 농도 이상에서 구조이상세포 또는 수적이상 세포의 출현빈도가 10% 이상이며, 용량의존적인 증가 경향이 인정되어진 것으로 최종 판정하였다.
- 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상시험에서 시험물질은 1,250∼5,000 mg/mL의 시험적용 용량에서 대사활성화계 유무와 시간에 상관없이 염색체 구조이상과 수적이상 세포의 출현빈도는 5% 미만이여서 염색체 이상 유발능이 나타나지 않았다.
- 표본관찰 결과는 시험물질 처리군은 시험적용 용량인 1250, 2500 및 5000 μg/mL 농도 범위에서 염색체 구조이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0 및 0.5%이었고, 염색체 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0 및 0.0%이였다.
- 표본관찰 결과를 살펴보면, S9 mix 미적용(S9-mix)하였을 경우 염색체 구조이상세포의 출현빈도는 시험물질 처리군의 시험적용 용량인 1250, 2500 및 5000 μg/mL 농도에서 각각 0.0, 0.5 및 0.5%였으며, 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.5, 0.0 및 0.0%로 나타났다.
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