[국내논문]Beauveria bassiana 배양여액 분획추출물의 진딧물 살충활성 Aphicidal Activity of Different Fraction Extracts of Culture Filtrate of Beauveria bassiana Isolate against Aphids원문보기
목화진딧물과 복숭아혹진딧물은 채소를 포함한 다양한 작물에 큰 피해를 주는 해충이다. 이들 해충의 친환경 방제를 위해 진딧물에 병원성이 높은 곰팡이(B. bassiana) 유래 대사물질을 이용한 방제 연구를 수행하였다. 이 균주의 배양여액의 살충율은 목화진딧물에 처리 3일 후 100%, 복숭아혹진딧물에 처리 5일 후 99%였다. 이 추출물을 $CHCl_3$ : MeOH 비율을 달리하여 silica gel column chromatography 한 결과, 50:1 ($CHCl_3$ : MeOH)의 추출물 분획의 살충률이 목화진딧물과 복숭아혹진딧물에 각 80%와 75.4%로 다른 분획에 비해 현저하게 높았다. 또 각 용매비율별 추출물을 1:1로 혼합하여 처리한 결과, 분획 추출물 혼합에 의한 상승효과는 보이지 않았으며 두 진딧물에 모두 50:1 ($CHCl_3$ : MeOH) 단독처리에서 살충률(목화진딧물 77.3%, 복숭아혹진딧물 76.4%)이 가장 높았으며 50:1 + 70:1이 두 번째로 높았다(목화진딧물 72%, 복숭아혹진딧물 70.2%). 앞으로 안정적인 진딧물 방제를 위해 50:1 분획 추출물 내 진딧물 살충성 물질을 분리 동정 및 대량생산 연구를 진행할 예정이다.
목화진딧물과 복숭아혹진딧물은 채소를 포함한 다양한 작물에 큰 피해를 주는 해충이다. 이들 해충의 친환경 방제를 위해 진딧물에 병원성이 높은 곰팡이(B. bassiana) 유래 대사물질을 이용한 방제 연구를 수행하였다. 이 균주의 배양여액의 살충율은 목화진딧물에 처리 3일 후 100%, 복숭아혹진딧물에 처리 5일 후 99%였다. 이 추출물을 $CHCl_3$ : MeOH 비율을 달리하여 silica gel column chromatography 한 결과, 50:1 ($CHCl_3$ : MeOH)의 추출물 분획의 살충률이 목화진딧물과 복숭아혹진딧물에 각 80%와 75.4%로 다른 분획에 비해 현저하게 높았다. 또 각 용매비율별 추출물을 1:1로 혼합하여 처리한 결과, 분획 추출물 혼합에 의한 상승효과는 보이지 않았으며 두 진딧물에 모두 50:1 ($CHCl_3$ : MeOH) 단독처리에서 살충률(목화진딧물 77.3%, 복숭아혹진딧물 76.4%)이 가장 높았으며 50:1 + 70:1이 두 번째로 높았다(목화진딧물 72%, 복숭아혹진딧물 70.2%). 앞으로 안정적인 진딧물 방제를 위해 50:1 분획 추출물 내 진딧물 살충성 물질을 분리 동정 및 대량생산 연구를 진행할 예정이다.
Cotton aphid (Aphis gossypii) and green peach aphid (Myzus persicae) are serious pests damaging various crops including vegetables such as pepper, cucumber, and Chinese cabbage. We conducted a study to control two aphids with secondary metabolite of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. A B. b...
Cotton aphid (Aphis gossypii) and green peach aphid (Myzus persicae) are serious pests damaging various crops including vegetables such as pepper, cucumber, and Chinese cabbage. We conducted a study to control two aphids with secondary metabolite of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. A B. bassiana was already selected as a high virulence isolate against cotton aphid and green peach aphid. The culture filtrate of the isolate showed high pathogenicity against both aphids as 100% mortality against cotton aphid 3 days after treatment and 99% against green peach aphid 5 days after treatment. A different fraction extracts with $CHCl_3$ : MeOH of B. bassiana culture filtrate (30:1, 50:1, 70:1, 90:1, 100:1; v/v) through silica gel column chromatography showed different control effect to aphids. Among them, 50:1 ($CHCl_3$ : MeOH) fraction had highest mortality as 77.3% and 75.4% against A. gossypii and M. persicae, respectively. A mixture of each fraction (1:1) had no synergistic effects because control effect of every mixture was lower than only 50:1 extract; for example, mortality of 50:1 + 70:1 showed $2^{nd}$ highest as 72% of cotton aphid and 70.2% of green peach aphid and other mixtures were lower than these values. In future we will study the identification and mass production of aphicidal compound isolated from 50:1 fraction to develop stable aphid control agent.
Cotton aphid (Aphis gossypii) and green peach aphid (Myzus persicae) are serious pests damaging various crops including vegetables such as pepper, cucumber, and Chinese cabbage. We conducted a study to control two aphids with secondary metabolite of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. A B. bassiana was already selected as a high virulence isolate against cotton aphid and green peach aphid. The culture filtrate of the isolate showed high pathogenicity against both aphids as 100% mortality against cotton aphid 3 days after treatment and 99% against green peach aphid 5 days after treatment. A different fraction extracts with $CHCl_3$ : MeOH of B. bassiana culture filtrate (30:1, 50:1, 70:1, 90:1, 100:1; v/v) through silica gel column chromatography showed different control effect to aphids. Among them, 50:1 ($CHCl_3$ : MeOH) fraction had highest mortality as 77.3% and 75.4% against A. gossypii and M. persicae, respectively. A mixture of each fraction (1:1) had no synergistic effects because control effect of every mixture was lower than only 50:1 extract; for example, mortality of 50:1 + 70:1 showed $2^{nd}$ highest as 72% of cotton aphid and 70.2% of green peach aphid and other mixtures were lower than these values. In future we will study the identification and mass production of aphicidal compound isolated from 50:1 fraction to develop stable aphid control agent.
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문제 정의
, 2013). 따라서 본 연구에서는 이 곰팡이 균주가 생산하는 살충성 물질을 확인하기 위하여 배양여액 분획들의 목화진딧물 및 복숭아혹진딧물에 대한 살충활성을 조사하였다.
목화진딧물과 복숭아혹진딧물은 채소를 포함한 다양한 작물에 큰 피해를 주는 해충이다. 이들 해충의 친환경 방제를 위해 진딧물에 병원성이 높은 곰팡이(B. bassiana) 유래 대사물질을 이용한 방제 연구를 수행하였다. 이 균주의 배양여액의 살충율은 목화진딧물에 처리 3일 후 100%, 복숭아혹진딧물에 처리 5일 후 99%였다.
제안 방법
제조된 포자현탁액은 AD배지(조성 3% corn steep powder, 4% glucose (Sigma, USA), 4% yeast extract) 500 ㎖ 가 들어 있는 1 L flask에 최종농도 1.0×10⁵ conidia/㎖가 되도록 접종하였다.
액체배양을 위해 곰팡이 포자는 PDA에서 7일간 배양한 후, 멸균된 5 ㎖ 0.05% Tween 80 용액을 PDA에 넣고 멸균된 spreader를 이용하여 포자를 회수하고, 헤모사이토미터를 이용 하여 포자수를 계수한 후 1.0×107 conidia/㎖의 포자현탁액을 제조하였다.
5 cm 배추 또는 오이 잎 조각에 접종하여 광주기 16:8 (L:D), 25±2℃ cage에서 15시간 동안 산자를 받고 성충을 제거 후 2일을 사육한 3령 약충을 이용하였다. 각 검정용 dish에 는 25마리의 3령 약충을 넣어 주고, 잎의 건조 방지를 위해 페트리디쉬의 바닥에 filter paper를 두고 200 ㎕의 D.W.를 넣어 습식처리를 해주었다.
처리는 plexiglass spray box (90×90×90 cm3 )에 설치된 sprayer (cone nozzle, 직경 1.5 mm)를 이용하여 배양여액 500 ㎕를 각각의 leaf disc 앞, 뒷면에 분사하였다.
건조 후 광주기 16:8 (L:D), 25±2℃, 습도 >90% cage에 넣고 24시간마다 진딧물의 살충률을 조사 하며, 5일간 살충률을 관찰하였다.
AD배지를 사용하여 3일간 shaking incubator에서 배양한 Bb08균 배양액이 들어있는 플라스크의 입구를 화염 멸균한 후 250 ㎖ centrifugal bottle에 옮겨 담았다. 이후 9000 rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 수거하여 멸균된 filter paper와 Bottle Top Vacuum Sterile Filter (CLS430769, Sigma aldrich)에 연속하여 여과시켜 균체 및 포자를 모두 제거하였다.
멸균된 분액깔때기를 준비한 후 여과된 배양여액에 ethyl acetate (EA)를 1:1로 넣고 강하게 교반하고 상층의 EA 물질 층을 회수한 후 다시 같은 부피의 EA를 다시 넣고 강하게 교반하여 EA 물질층만을 회수하였다. 회수한 물질층은 evaporator를 이용해 50℃, 70 rpm 조 건에서 휘발성 용매를 모두 증발 제거한 후, 용매(CHCl3 : MeOH = 100:1) 10 ㎖을 vacuum flask에 넣어준 후 sonicator를 이용하여 flask 내에 남아있는 물질을 녹여 회수하였다.
회수된 물질은 Silica gel column chromatography를 이용하여 CHCl3 : MeOH = 100:1, 90:1, 70:1, 50:1, 30:1(v/v) 비율로 살충성 물질을 정제하여 45℃ 건조 오븐에서 추출한 분획 추출물 의 용매를 모두 휘발시킨 후 각 농도의 추출물에 멸균 증류수 140 ㎖를 넣고 3분간 vortexing 하면서 용해하여 4℃에 보관하였다. 각 농도별 분획 추출물들의 혼합액의 살충활성 검정을 위해, 멸균 증류수에 희석된 각 농도별 분획추출물을 1:1로 혼합한 혼합액(30:1 + 50:1, 30:1 + 70:1, 30:1 + 90:1, 30:1 + 100:1, 50:1 + 70:1, 50:1 + 90:1, 50:1 + 100:1, 70:1 + 90:1, 70:1 + 100:1, 90:1 + 100:1)을 준비하였다.
5 mm)를 이용하여 배양여액 500 ㎕를 각각의 leaf disc 앞, 뒷면에 분사하였다. 모든 처리는 같은 높이, 같은 위치, 같은 압력, 같은 양을 살포하였으며 타 배양여액 살포시마다 sprayer를 70% ethanol로 소독한 후 D.W. 로 세척하여 사용하였다. 살포 후 잎 표면 수분제거를 위해 1시간 정도 풍건하였다.
진딧물이 붓과 공기에 대한 반응이 없고 표피 색깔의 변화가 눈에 띠게 관찰되면 죽은 것으로 판정하였다. 살충활성 검정을 위한 생물검정은 3회의 각기 다른 시기에 수행되었으며, 매 실험마다 3개의 검정용 dish를 사용하여 반복하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 복숭아혹진딧물과 목화진딧물은 국립농업과학원 농업미생물과 해충사 육실에서 온도 25℃, 광조건 16 L : 8 D, 상대습도 60±5% 조건으로 cage (90×90×90 cm3 )에서 사육하였다.
생물검정용 진딧물은 사육중인 진딧물 성충을 직경 5.5 cm petri dish 내에 들어 있는 직경 3.5 cm 배추 또는 오이 잎 조각에 접종하여 광주기 16:8 (L:D), 25±2℃ cage에서 15시간 동안 산자를 받고 성충을 제거 후 2일을 사육한 3령 약충을 이용하였다.
)에서 사육하였다. 기주 식물로 온실에서 45일 키운 배추와 30일 키운 오이를 사용하였다.
본 실험에서는 배양액과 배양여액 모두 복숭아혹진딧물에 살충률이 높은 것으로 알려진 B. bassiana Bb08 (미생물 수탁번호 : KACC93163P)를 이용하였다(Kim et al., 2013). B.
데이터처리
모든 통계분석은 SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2012)으로 진행되었고, 일원 분산분석(one-way ANOVA)(α=0.05) 후 유의한 차이가 나타난 데이터는 튜키의 다중비교 (Tukey’s honestly significance difference [HSD]) 방법으로 사후 검정하였다.
성능/효과
B. bassiana Bb08을 500 ㎖ AD 배지에서 배양하여 제조한 AD 배양여액의 목화진딧물 및 복숭아혹진딧물에 대한 살충활성을 조사한 결과, 목화진딧물에 대한 살충률은 2일차에 59%로 복숭아혹진딧물의 36%보다 유의하게 높았으며(F=166.1, df=3, 8, P<0.0001), 3일차에 100%에 도달하였다(F=682.8, df=3, 8, P<0.0001).
배양여액의 용매 비율별 분획 추출물에 의한 목화진딧물 살충률 조사 결과, 처리 1일 후 50:1 (CHCl3 : MeOH)에서 18%로 다른 농도(30:1, 70:1, 90:1, 100:1)의 0.6~6.2%보다 유의하게 높았으며(F=24.5, df=5, 12, P<0.0001), 처리 2일 후 68.3%, 3일 후 75.1%, 5일 후 80%로 다른 4개 농도의 2~5일 후 1.3~19.3%보다 유의하게 높았다(2일 후, F=180.0, df=5, 12, P< 0.0001; 3일 후, F=318.2, df=5, 12, P<0.0001; 4일 후, F=391.9, df=5, 12, P<0.0001; 5일 후, F=463.9, df=5, 12, P<0.0001) (Fig. 2).
두 번째로 높은 살충률은 50:1+70:1(1:1) 혼합액 처리에서 목화진딧물과 복숭아혹진딧물에 각각 72%와 70.2%로 70:1 추출물의 19.6%와 24.9%보다 높은 상승효과를 보였다(목화진딧물 처리 1일 후, F=13.7, df=15, 32, P<0.0001; 2일 후, F=63.0, df=15, 32, P<0.0001; 3일 후, F=42.2, df=15, 32, P<0.0001; 4일 후, F=53.4, df=15, 32, P<0.0001; 5일 후, F=61.2, df=15, 32, P<0.0001: 복숭아혹진딧물 처리 1일 후, F=19.6, df=15, 32, P<0.0001; 2일 후, F=102.5, df=15, 32, P<0.0001; 3일 후, F=69.0, df=15, 32, P<0.0001; 4일 후, F=72.3, df=15, 32, P<0.0001; 5일 후, F=104.3, df=15, 32, P<0.0001).
복숭아혹진딧물에 대한 분획별 살충률도 목화진딧물 과 유사하게 50:1의 살충률이 가장 높았다(처리 1일 후 18.2%, 2일 후 65%, 5일 후 75.4%; 다른 4개 농도의 1일 후부터 5일 살충률 0.1~19.7%) (1일 후, F=84.8, df=5, 12, P<0.0001; 2 일 후, F=112.8, df=5, 12, P<0.0001; 3일 후, F=162.1, df=5, 12, P<0.0001; 4일 후, F=198.0, df=5, 12, P<0.0001; 5일 후, F=201.4, df=5, 12, P<0.0001)(Fig. 3.).
각 용매 비율별 분획 추출물 혼합액의 시너지 효과를 확인하기 위해 실시한 생물검정 결 과, 목화진딧물(Fig. 4) 및 복숭아혹진딧물(Fig. 5)은 50:1(CHCl₃: MeOH) 단독 처리에서 가장 높은 살충률(5일차, 목화진딧물 77.3%; 복숭아혹진딧물 76.4%)을 보였다. 두 번째로 높은 살충률은 50:1+70:1(1:1) 혼합액 처리에서 목화진딧물과 복숭아혹진딧물에 각각 72%와 70.
곤충병원성 곰팡이 B. bassiana Bb08 배양여액의 용매 비율별 분획의 살충률은 용매 비율에 따라 달랐으며 50:1 (CHCl3 : MeOH) 분획에서 가장 높았다. 곤충병원성 곰팡이 배양여액 중에는 살충효과뿐만 아니라 섭식 저해 효과를 보이는 물질을 포함하는 경우도 있는 것으로 알려져 있으며, 그 물질의 종류나 성분은 곰팡이의 종류나 배지 성분, 배양 조건에 따라 다르다.
bassiana) 유래 대사물질을 이용한 방제 연구를 수행하였다. 이 균주의 배양여액의 살충율은 목화진딧물에 처리 3일 후 100%, 복숭아혹진딧물에 처리 5일 후 99%였다. 이 추출물을 CHCl3 : MeOH 비율을 달리하여 silica gel column chromatography 한 결과, 50:1 (CHCl3 : MeOH)의 추출물 분획의 살충률이 목화진딧물과 복숭아혹진딧물에 각 80%와 75.
이 균주의 배양여액의 살충율은 목화진딧물에 처리 3일 후 100%, 복숭아혹진딧물에 처리 5일 후 99%였다. 이 추출물을 CHCl3 : MeOH 비율을 달리하여 silica gel column chromatography 한 결과, 50:1 (CHCl3 : MeOH)의 추출물 분획의 살충률이 목화진딧물과 복숭아혹진딧물에 각 80%와 75.4%로 다른 분획에 비해 현저하게 높았다. 또 각 용매비율별 추출물을 1:1로 혼합하여 처리한 결과, 분획 추출물 혼합에 의한 상승효과는 보이지 않았으며 두 진딧물에 모두 50:1 (CHCl3 : MeOH) 단독처리에서 살충률 (목화진딧물 77.
4%로 다른 분획에 비해 현저하게 높았다. 또 각 용매비율별 추출물을 1:1로 혼합하여 처리한 결과, 분획 추출물 혼합에 의한 상승효과는 보이지 않았으며 두 진딧물에 모두 50:1 (CHCl3 : MeOH) 단독처리에서 살충률 (목화진딧물 77.3%, 복숭아혹진딧물 76.4%)이 가장 높았으며 50:1 + 70:1이 두 번째로 높았다(목화진딧물 72%, 복숭아혹진딧물 70.2%). 앞으로 안정적인 진딧물 방제를 위해 50:1 분획 추출물 내 진딧물 살충성 물질을 분리 동정 및 대량생산 연구를 진행할 예정이다.
후속연구
Bb08 균주의 경우 배양여액의 50:1 (CHCl3 : MeOH) 추출분획이 목화진딧물과 복숭아혹진딧물 모두에 높은 살충률을 보이는 것으로 보아 50:1 (CHCl3 : MeOH) 추출분획에 진딧물 살충성 물질이 포함 된 것으로 추측된다. 본 연구 결과에서 Bb08 균주의 배양여액 분획은 복숭아혹진딧물과 목화진딧물에 접촉하여 살충시키는 접촉독의 경향을 나타내고 있었으며 위의 다른 연구결과에서와 같이 Bb08 균주의 진딧물에 대한 기피 효과, 산란에 미치는 영향에 대한 구체적인 추가 실험과 기작에 대한 구명이 필요하다. 앞으로 효율적이고 안정적인 진딧물 방제제 개 발을 위해 진딧물 살충성 곰팡이의 대량생산, 진딧물 살충성 물질의 분리 동정 및 이 물질의 대량 배양 기술 개발을 수행할 예정이다.
본 연구 결과에서 Bb08 균주의 배양여액 분획은 복숭아혹진딧물과 목화진딧물에 접촉하여 살충시키는 접촉독의 경향을 나타내고 있었으며 위의 다른 연구결과에서와 같이 Bb08 균주의 진딧물에 대한 기피 효과, 산란에 미치는 영향에 대한 구체적인 추가 실험과 기작에 대한 구명이 필요하다. 앞으로 효율적이고 안정적인 진딧물 방제제 개 발을 위해 진딧물 살충성 곰팡이의 대량생산, 진딧물 살충성 물질의 분리 동정 및 이 물질의 대량 배양 기술 개발을 수행할 예정이다. 진딧물 살충성 곰팡이 및 대사물질의 대량 생산 기술 개발을 통한 저렴하고 안전한 친환경 미생물제의 안정적 공급은 국내 친환경 농자재 시장 활성화 및 1,000억 원에 이르는 진딧물 방제용 농약 수입 비용 절감 효과가 있을 것으로 기대된다.
앞으로 효율적이고 안정적인 진딧물 방제제 개 발을 위해 진딧물 살충성 곰팡이의 대량생산, 진딧물 살충성 물질의 분리 동정 및 이 물질의 대량 배양 기술 개발을 수행할 예정이다. 진딧물 살충성 곰팡이 및 대사물질의 대량 생산 기술 개발을 통한 저렴하고 안전한 친환경 미생물제의 안정적 공급은 국내 친환경 농자재 시장 활성화 및 1,000억 원에 이르는 진딧물 방제용 농약 수입 비용 절감 효과가 있을 것으로 기대된다.
2%). 앞으로 안정적인 진딧물 방제를 위해 50:1 분획 추출물 내 진딧물 살충성 물질을 분리 동정 및 대량생산 연구를 진행할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
B. bassiana와 V. lecanii를 이용한 진딧물 방제법의 장점은?
bassiana와 V. lecanii 균주의 포자와 배양여액을 이용하여 진딧물 방제 시 배양여액은 진딧물의 표피 구조를 변화시키는 물질을 생산하여 진딧물을 죽이기 때문에 포자를 이용한 방제보다 물리적 환경의 영향을 덜 받는 장점이 있다고 하였다. Bb08 균주의 배양여액 분획도 복숭아혹진딧물과 목화진딧물에 접촉하여 살충시키는 접촉독의 경향을 보이고 있으나 구체적인 기작에 대한 구명이 필요하다.
곰팡이를 이용한 미생물 살충제는 어떻게 작동하는가?
6%)을 차지하고 있다. 곰팡이를 이용한 미생물 살충제는 대부분 액체 또는 고체 배양한 포자가 주요 살충인자로 포함되어 있고, 이들은 충체 표면에 부착하여 적절한 온도, 습도 조건에서 발아하고 곤충의 표피 분해가 가능한 효소 등을 분비하여 곤충 체내로 침입하여 기주 곤충을 죽인다(Goettel et al., 2005).
곰팡이 포자를 이용한 미생물 살충제의 단점은?
, 2005). 하지만 포자에 의한 해충 방제는 속도가 느리고, 살충 효과가 온도, 습도, 햇빛(특히 자외선) 등의 영향으로 환경에 따라 살충효과의 변동이 큰 단점이 있다(Burges, 1998).
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