[논문]S-allylcysteine 매개 caspases의 활성화 및 PARP의 불활성화를 통한 HeLa 세포주의 증식 억제효과

김현희; 공일근; 민계식

doi:10.5352/jls.2017.27.2.164

S-allylcysteine 매개 caspases의 활성화 및 PARP의 불활성화를 통한 HeLa 세포주의 증식 억제효과
S-allylcysteine-mediated Activation of Caspases and Inactivation of PARP to Inhibit Proliferation of HeLa 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.27 no.2 = no.202, 2017년, pp.164 - 171

김현희 (경상대학교 응용생명과학부) , 공일근 (경상대학교 응용생명과학부) , 민계식 (경남과학기술대학교 생명과학대학 간호학과)

초록
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본 연구에서는 인간 자궁경부암세포주에서 S-allylcysteine (SAC)이 세포자멸경로에 중요한 역할을 담당하는 initiator caspase의 하나인 caspase-9와 effector caspase에 속하는 caspase-3 및 caspase-7 그리고 DNA 복구에 관여하는 poly ADP-ribose polymerase (PARP)의 발현조절에 미치는 영향과, SAC에 의한 이러한 세포자멸 및 DNA 복구 관련 단백질의 발현변화가 세포증식억제를 통한 기능적 작용을 유발하는지를 조사하였다. 단백질 발현분석 결과, 특히 50 mM의 SAC로 48시간 동안 처리하였을 경우, procaspase-3, -7, -9 및 PARP의 발현은 각각 94%, 38%, 95% 및 64% 감소되었으며, 이와 반대로 caspase-3, -7, -9 및 cleaved-PARP의 발현은 현저히 증가되었다. 또한 cell proliferation assay 결과, 20 mM 이상의 SAC 처리는 6, 12, 24 및 48시간에서 농도 및 시간 의존적인 세포증식 억제효과를 나타내었다. 이러한 결과는 SAC 처리가 자궁경부암세포의 증식을 억제하며, 이에 대한 가능한 분자적 작용기전들 중의 하나로 세포자멸과정 중 initiator caspase의 하나인 caspase-9의 활성을 유도하고 이에 따른 effector caspase인 caspase-3과 caspase-7의 활성을 촉진시킬 뿐만 아니라 DNA 복구에 관여하는 PARP의 불활성화를 초래함으로써 세포자멸 유도에 관여하는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Our previous study suggested that S-allylcysteine (SAC) inhibits the proliferation of the human cervical cancer cell line, HeLa, at least in part through the induction of apoptosis and cell cycle arrest. To further analyze the specific molecular mechanism(s) by which SAC mediates its antiproliferative effects, this study examined the role of SAC in regulating the protein expression of initiator caspase (caspase-9), effector caspases (caspase-3 and caspase-7), and poly-ADP-ribose polymerase (PARP) in HeLa. Western blot analysis showed that when cells were treated with 50 mM SAC for 48 hr, the expression of procaspase-3, -7, and -9 and PARP was reduced by 94%, 38%, 95%, and 64%, respectively, as compared to the untreated control. In contrast, the expression of caspase-3, -7, and -9 and cleaved-PARP was markedly increased by SAC treatment. The SAC-mediated changes in the expression of these proteins were correlated with the concomitant inhibition of cellular proliferation by SAC. The cell proliferation assay showed that HeLa treatment with more than 20 mM SAC for 6-48 hr resulted in both concentration- and time-dependent inhibition of cellular proliferation. These results indicate that the SAC-induced antiproliferative effect in HeLa may be mediated at least in part through the activation of caspase-9, followed by the activation of caspase-3 and caspase-7 as well as the inactivation of PARP, thus leading to cellular apoptosis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나, 자궁경부암세포에서 SAC에 의한 세포자멸의 유도가 어떠한 분자적 기전을 통하여 매개되는지는 알려져 있지 않다. 따라서, 본 연구에서는 인간 자궁경부암세포주에서 SAC가 세포자멸경로에서 중요한 역할을 담당하는 initiator caspase의 하나인 caspase-9와 effector caspase에 속하는 caspase-3 및 caspase-7 그리고 세포의 증식, 분화 및 자멸 과정에서 DNA의 복구를 수행하는 DNA-binding zinc finger protein 중 하나인 PARP의 발현조절에 미치는 영향을 조사하였다.
특히, 지난 보고에서 SAC가 세포사멸의 유도와 세포주기의 억제를 통하여 자궁경부암세포주의 증식을 억제함을 제시하였다[15]. 본 연구에서는 SAC에 의한 자궁경부암세포주의 세포사멸 효과가 어떠한 분자적 경로를 통하여 매개되는지를 확인하기 위하여, 세포자멸 관련 단백질인 caspase-3, caspase-7 및 caspase-9 그리고 DNA 복구 단백질인 PARP의 SAC 처리농도 및 시간에 따른 발현변화를 조사하였다.

제안 방법

SAC에 의한 세포자멸 관련 단백질 및 DNA 복구 단백질의 발현변화가 세포증식억제를 통한 기능적 작용과 일치하는지를 확인하기 위하여, 먼저 농도 및 시간에 따른 SAC 처리에 의한 자궁경부암세포주의 세포증식 억제효과를 분석하였다. SAC는 0~50 mM의 농도 및 각 시간대별로(6~48 hr) 처리된 HeLa 세포주에서, 대체로 농도 및 시간 의존적인 세포증식 억제효과를 보였다(Fig.
HeLa cells were treated with SAC in different concentrations (0, 20 and 50 mM) for 48 hr. The panel shows the results from Western blot analysis of PARP and cleaved-PARP expression with alpha-tubulin as a loading control. The numbers below each panel show the relative intensities of PARP or cleaved-PARP to the loading control which were calculated by dividing the background-subtracted density value of PARP or cleaved-PARP by the corresponding value of the loading control at the respective concentration, and comparision to the PBS control.
HeLa cells were treated with SAC in different concentrations (0, 10, 20 and 50 mM) for 6 hr (A), 12 hr (B), 24 hr (C) or 48 hr (D). The panels show the results from Western blot analysis of procaspase-3 and caspase-3 expression with alpha-tubulin or beta-actin as a loading control. The numbers below each panel show the relative intensities of procaspase-3 or caspase-3 to the loading control which were calculated by dividing the background-subtracted density value of procaspase-3 or caspase-3 by the corresponding value of the loading control at the respective concentration, and comparision to the PBS control.
HeLa cells were treated with SAC in different concentrations (0, 10, 20 and 50 mM) for 6 hr (A), 12 hr (B), 24 hr (C) or 48 hr (D). The panels show the results from Western blot analysis of procaspase-7 and caspase-7 expression with alpha-tubulin or beta-actin as a loading control. The numbers below each panel show the relative intensities of procaspase-7 or caspase-7 to the loading control which were calculated by dividing the background-subtracted density value of procaspase-7 or caspase-7 by the corresponding value of the loading control at the respective concentration, and comparision to the PBS control.
HeLa cells were treated with SAC in different concentrations (0, 10, 20 and 50 mM) for 6 hr (A), 12 hr (B), 24 hr (C) or 48 hr (D). The panels show the results from Western blot analysis of procaspase-9 and caspase-9 expression with alpha-tubulin or beta-actin as a loading control. The numbers below each panel show the relative intensities of procaspase-9 or caspase-9 to the loading control which were calculated by dividing the background-subtracted density value of procaspase-9 or caspase-9 by the corresponding value of the loading control at the respective concentration, and comparision to the PBS control.
각 96-well plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포(6,000 cells/well)에 다양한 농도의 SAC (0, 1, 10, 20 및 50 mM in PBS)를 첨가한 다음, 각각 6, 12, 24 및 48 hr 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. SAC 처리에 의한 HeLa 세포의 증식에 미치는 효과는 시약공급자의 protocol에 따라 CellTiter-Glo^® Luminescent cell viability assay (Promega, Madison, WI, U.
각 SAC 농도(0, 1, 10, 20 및 50 mM)에 따른 처리시간별 세포증식에 미치는 영향을 cell proliferation assay를 이용하여 비교 분석하였다. Fig.
그리고, secondary antibody에 결합된 HRP의 촉매반응을 통한 chemiluminescent 생성물을 유도하기 위하여, HRP 특이적 기질이 포함된 EzWestLumi plus (Atto, Tokyo, Japan) A, B 용액을 1:1 혼합하여 2분간 반응시켰으며, 발광 생성물의 양은 암실에서 x-ray 필름에 감광시켜 발현된 각 단백질의 양을 정성적으로 분석하였다. 각 필름에 노출된 단백질 band의 강도는 Image studio lite program (LI-COR, Lincoln, NE, U.S.A.)을 이용하여 정량적으로 분석되었다.
05% Tween-20 in TBS) wash buffer로 각 10분간 3회 반복 수세하였다. 각 항원에 결합된 primary antibody를 탐지하기 위하여 사용된 secondary antibody는 goat anti-rabbit IgGHRP (Cell Signaling Technology) 또는 goat anti-mouse IgGHRP (ThermoFisher, Rockford, IL, U.S.A.)로서 blocking solution에 모두 1:3,000의 농도로 희석하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켰으며, TBST wash buffer로 각 10분간 3회 반복 수세하였다. 그리고, secondary antibody에 결합된 HRP의 촉매반응을 통한 chemiluminescent 생성물을 유도하기 위하여, HRP 특이적 기질이 포함된 EzWestLumi plus (Atto, Tokyo, Japan) A, B 용액을 1:1 혼합하여 2분간 반응시켰으며, 발광 생성물의 양은 암실에서 x-ray 필름에 감광시켜 발현된 각 단백질의 양을 정성적으로 분석하였다.
)를 primary antibody로 사용하였다. 각각의 primary antibody는 blocking solution에서 모두 1:1,000의 농도로 희석하여 PVDF membrane과 함께 4℃ over-night 및 25℃ 1시간 동안 반응시킨 다음, TBST (0.05% Tween-20 in TBS) wash buffer로 각 10분간 3회 반복 수세하였다. 각 항원에 결합된 primary antibody를 탐지하기 위하여 사용된 secondary antibody는 goat anti-rabbit IgGHRP (Cell Signaling Technology) 또는 goat anti-mouse IgGHRP (ThermoFisher, Rockford, IL, U.
, 37℃에서 배양하였다. 각각의 배양시간 이후 세포를 PBS로 3회 수세한 다음 1X SDS sample buffer [62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 50 mM DTT 및 0.001% bromophenol blue]를 첨가하여 95℃에서 10분간 가열한 후 용해된 단백질을 함유한 상등액을 원심분리하였다. 세포로부터 추출된 총단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel 상에서 전기영동을 통해 분자량에 따라 분리시킨 다음 Immobilon^®-P PVDF transfer membrane (EMD Millipore, Billerica, MA, U.
간단히 말하면, 세포를 함유하는 plate의 배양액을 제거한 후, 100 μl의 신선한 배양액(DMEM) 과 동일한 부피의 CellTiter-Glo® reagent를 혼합하여 각 well에 200 μl의 반응혼합액을 첨가한 다음, orbital shaker에서 2분 그리고 정지상태에서 8분 동안 반응시킨 후 luminometer를 이용하여 발광양을 측정하였다.
)로서 blocking solution에 모두 1:3,000의 농도로 희석하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켰으며, TBST wash buffer로 각 10분간 3회 반복 수세하였다. 그리고, secondary antibody에 결합된 HRP의 촉매반응을 통한 chemiluminescent 생성물을 유도하기 위하여, HRP 특이적 기질이 포함된 EzWestLumi plus (Atto, Tokyo, Japan) A, B 용액을 1:1 혼합하여 2분간 반응시켰으며, 발광 생성물의 양은 암실에서 x-ray 필름에 감광시켜 발현된 각 단백질의 양을 정성적으로 분석하였다. 각 필름에 노출된 단백질 band의 강도는 Image studio lite program (LI-COR, Lincoln, NE, U.
다양한 농도의 SAC (0, 10, 20 및 50 mM in PBS)를 10 cm plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포(3,000,000 cells/plate)에 첨가한 다음, 각각 6, 12, 24 및 48 hr 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 각각의 배양시간 이후 세포를 PBS로 3회 수세한 다음 1X SDS sample buffer [62.
단백질이 고정된 PVDF membrane을 이용하여 다음과 같이 Western immunoblotting을 실시하였다. 먼저, immunoglobulin G (IgG)의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 PVDF membrane을 blocking solution (5% skim milk 및 0.05% Tween-20 in TBS) 내에서 25℃, 1시간 동안 처리하였다. 이후, SAC의 처리농도 및 시간에 따라 발현된 caspase-3, caspase-7, caspase-9 및 PARP 단백질의 양을 탐지하기 위하여, 각각 rabbit anti-caspase-3 IgG, rabbit anti-caspase-7 IgG, rabbit anti-caspase-9 IgG, rabbit anti-PARP IgG 및 rabbit anticleaved-PARP IgG (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, U.
05% Tween-20 in TBS) 내에서 25℃, 1시간 동안 처리하였다. 이후, SAC의 처리농도 및 시간에 따라 발현된 caspase-3, caspase-7, caspase-9 및 PARP 단백질의 양을 탐지하기 위하여, 각각 rabbit anti-caspase-3 IgG, rabbit anti-caspase-7 IgG, rabbit anti-caspase-9 IgG, rabbit anti-PARP IgG 및 rabbit anticleaved-PARP IgG (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, U.S.A.)를 primary antibody로 사용하였다. 그리고, 각 처리군 사이의 상대적인 단백질의 발현 양을 비교하기 위한 표준 대조단백질의 발현탐지는 rabbit anti-alpha tubulin IgG (Cell Signaling Technology) 또는 mouse anti-beta actin IgG (Sigma-Aldrich, St.
2). 특히, 50 mM의 SAC 처리는 12, 24 및 48 hr에서 각각 25%, 71% 및 94%의 시간 의존적인 발현감소를 유도하였다. 이와는 대조적으로, 활성형 caspase-3 단백질의 양은 48 hr의 SAC 처리에 의해 현저한 증가를 나타내었다(Fig.

대상 데이터

HeLa 세포주는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)로부터 구입되었으며, 5회의 계대배양을 통하여 실험에 사용되었다. 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 및 태아송아지 혈청은 GIBCO Invitrogen (Grand Island, NY, U.
)를 primary antibody로 사용하였다. 그리고, 각 처리군 사이의 상대적인 단백질의 발현 양을 비교하기 위한 표준 대조단백질의 발현탐지는 rabbit anti-alpha tubulin IgG (Cell Signaling Technology) 또는 mouse anti-beta actin IgG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)를 primary antibody로 사용하였다. 각각의 primary antibody는 blocking solution에서 모두 1:1,000의 농도로 희석하여 PVDF membrane과 함께 4℃ over-night 및 25℃ 1시간 동안 반응시킨 다음, TBST (0.
배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 및 태아송아지 혈청은 GIBCO Invitrogen (Grand Island, NY, U.S.A.)으로부터, 그리고 세포배양 plate는 Nunc A/S (Roskilde, Denmark)로부터 구입되었다.

데이터처리

실험결과는 평균±S.E.로 표시되었으며, 처리군 사이의 통계적 유의성은 Student’s t-test에 의해 결정되었다.

이론/모형

SAC 처리에 의한 HeLa 세포의 증식에 미치는 효과는 시약공급자의 protocol에 따라 CellTiter-Glo® Luminescent cell viability assay (Promega, Madison, WI, U.S.A.)에 의해 분석되었다.

성능/효과

각 SAC 농도(0, 1, 10, 20 및 50 mM)에 따른 처리시간별 세포증식에 미치는 영향을 cell proliferation assay를 이용하여 비교 분석하였다. Fig. 1에 나타나 있는 바와 같이, 모든 처리시간(6~48 hr)에서 10 mM 이상의 SAC는 HeLa 세포주의 증식을 억제하였으며 특히, 20 mM 이상의 농도에서는 농도 의존적인 억제효과를 나타내었다. 구체적으로, 20 및 50 mM의 SAC 처리는 6 hr의 경우 각각 23% 및 29%, 12 hr의 경우 각각 23%, 및 31%, 24 hr의 경우 각각 45% 및 78% 그리고 48 hr의 경우 각각 46% 및 88%의 현저한 증식억제 효과를 보임으로써, SAC가 HeLa 세포주에 대하여 농도 의존적일 뿐만 아니라 처리시간 의존적인 증식억제 효과를 나타냄을 보였다.
SAC에 의한 세포자멸 관련 단백질 및 DNA 복구 단백질의 발현변화가 세포증식억제를 통한 기능적 작용과 일치하는지를 확인하기 위하여, 먼저 농도 및 시간에 따른 SAC 처리에 의한 자궁경부암세포주의 세포증식 억제효과를 분석하였다. SAC는 0~50 mM의 농도 및 각 시간대별로(6~48 hr) 처리된 HeLa 세포주에서, 대체로 농도 및 시간 의존적인 세포증식 억제효과를 보였다(Fig. 1). 이러한 결과는 이전에 보고된 자궁 경부암세포주[15] 뿐만 아니라, 유방암[7], 구강암[32], 난소암[35], 간암세포주[24] 및 안드로겐-비의존성 전립선암세포[21] 등에서 유사한 농도범위의 SAC 매개 세포증식 억제효과 보고들과 일치한다.
결론적으로, 본 연구에서는 SAC 처리가 자궁경부암세포주의 세포증식을 억제하며, 이에 대한 가능한 분자적 작용기전들 중의 하나로 세포자멸과정의 상위경로에 해당하는 initiator caspase 중 하나인 caspase-9의 활성을 유도하고 이에 따른 하위경로의 effector caspase인 caspase-3과 caspase-7의 활성화를 초래할 뿐만 아니라, DNA 복구에 관여하는 PARP를 불활성화시킴으로써 세포의 자멸을 초래함을 제시한다. SAC의 세포증식억제효과에 대한 보다 더 구체적인 분자적 신호경로 또는 다른 조절기전은 향후 추가적인 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 사료된다.
1에 나타나 있는 바와 같이, 모든 처리시간(6~48 hr)에서 10 mM 이상의 SAC는 HeLa 세포주의 증식을 억제하였으며 특히, 20 mM 이상의 농도에서는 농도 의존적인 억제효과를 나타내었다. 구체적으로, 20 및 50 mM의 SAC 처리는 6 hr의 경우 각각 23% 및 29%, 12 hr의 경우 각각 23%, 및 31%, 24 hr의 경우 각각 45% 및 78% 그리고 48 hr의 경우 각각 46% 및 88%의 현저한 증식억제 효과를 보임으로써, SAC가 HeLa 세포주에 대하여 농도 의존적일 뿐만 아니라 처리시간 의존적인 증식억제 효과를 나타냄을 보였다.
뿐만 아니라, caspase-3 및 caspase-7 의 활성화는 유전체 DNA를 분해하는 endonuclease의 활성화를 유도하여 세포사멸을 초래하는 것으로 보고되었다[11]. 따라서 이러한 결과들은 자궁경부암세포주에서 SAC가 effector caspase인 caspase-3과 caspase-7의 활성화를 통하여 DNA 복구를 촉매하는 PARP의 불활성화를 초래할 뿐만 아니라, DNA의 분해를 촉진시키는 endonuclease의 활성화를 유도함으로써 DNA 분절을 일으키고 이는 결국 세포사멸을 초래하는데 기여하는 것으로 사료된다.
PARP는 caspase-3과 caspase-7의 기질로 사용되며[12, 22], 난소암세포주에서 SAC 처리를 통해 활성화된 caspase-3이 PARP의 분절을 유도한다는 Xu 등[35]의 보고는 본 연구에서 나타난 SAC에 의한 procaspase-3과 procaspase-7의 감소, caspase-3과 caspase-7의 증가, 그리고 활성형 PARP 감소와 불활성화된 cleaved-PARP의 증가 등의 결과와 일치한다. 따라서, 이러한 결과는 자궁경부암세포주에서 SAC 처리에 의한 세포 증식 억제효과가 최소한 부분적으로 caspase-3 그리고/또는 caspase-7의 활성에 의하여 절단되어 불활성화된 PARP에 의해 초래된 DNA repair 기능의 소실에 기인할 수 있음을 의미한다. 그리고, SAC에 의한 PARP의 불활성화는 이전에 보고된 DNA fragmentation assay 및 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick and labeling) assay에서 나타난 바와 같이 SAC에 의해 유도되는 유전체 DNA의 분절 효과를 뒷받침한다[15].
이는 SAC가 비활성형 procaspases (procaspase-3, procaspase-7 및 procaspase-9)를 활성형 caspases (caspase-3, caspase-7 및 caspase-9)로의 전환을 매개하는 것으로 보인다. 따라서, 이러한 결과들은 SAC 처리에 의해 initiator caspase인 caspase-9가 비활성형 상태(procaspase-9)로부터 활성형 상태(caspase-9)로 전환되며, 활성화된 caspase-9는 다시 effector caspase인 procaspase-3 및 procaspase-7의 분절을 통한 활성화(caspase-3 및 caspase-7)를 매개하는 것으로 사료된다.
배양된 HeLa 세포를 48 hr 동안 다른 농도(0, 20 및 50 mM)로 SAC를 처리하여 PARP 및 cleaved-PARP 단백질의 발현변화를 분석한 결과, 농도 의존적인 PARP의 발현감소를 나타내었다(Fig. 5). 이와는 대조적으로, 불활성형 cleaved-PARP 단백질의 양은 50 mM SAC 처리에 의해 현저히 증가되었다(Fig.
배양된 HeLa 세포를 각각 다른 농도(0, 10, 20 및 50 mM) 및 시간(6, 12, 24 및 48 hr)으로 SAC를 처리하여 procaspase-3 및 caspase-3 단백질의 발현변화를 분석한 결과, 대부분의 처리농도(10, 20 및 50 mM) 및 시간(12~48 hr)에서 SAC가 procaspase-3의 발현을 감소시켰다(Fig. 2). 특히, 50 mM의 SAC 처리는 12, 24 및 48 hr에서 각각 25%, 71% 및 94%의 시간 의존적인 발현감소를 유도하였다.
배양된 HeLa 세포를 각각 다른 농도(0, 10, 20 및 50 mM) 및 시간(6, 12, 24 및 48 hr)으로 SAC를 처리하여 procaspase-7 및 caspase-7 단백질의 발현변화를 분석한 결과, procaspase-7 의 발현은 특히 50 mM의 24 및 48 hr 처리에서 각각 19% 및 38%만큼 감소되었다(Fig 3C, Fig 3D). 반면에, 활성형 caspase-7 단백질의 양은 24 및 48 hr SAC 처리에 의해 현저한 증가를 보였으며, 특히 50 mM의 처리에 의해 두드러진 증가를 나타내었다(Fig.
배양된 HeLa 세포를 각각 다른 농도(0, 10, 20 및 50 mM) 및 시간(6, 12, 24 및 48 hr)으로 SAC를 처리하여 procaspase-9 및 caspase-9 단백질의 발현변화를 분석한 결과, 대부분의 처리농도(10, 20 및 50 mM)에서 SAC가 procaspase-9의 발현을 시간 의존적으로 감소시켰다(Fig. 4). 특히, 50 mM의 SAC 처리는 24 및 48 hr에서 모두 95%의 현저한 발현감소를 유도하였다.
본 연구에서는 SAC가 HeLa 세포주의 procaspase-3, procaspase-7 및 procaspase-9의 단백질 발현을 하향조절할 뿐만 아니라, 활성형 caspase-3, caspase-7 및 caspase-9의 단백질 양을 상향조절한 것으로 나타났다(Fig. 2 - Fig. 4). 이러한 SAC 에 의해 유도된 HeLa 세포주의 caspase 발현조절은 이전에 보고된 난소암[35] 및 간암세포주[24]에서의 procaspase-3 및 procaspase-9의 발현 감소와 더불어 활성화된 caspase-3 및 caspase-9의 증가와 일치한다.
간단히 말하면, 세포를 함유하는 plate의 배양액을 제거한 후, 100 μl의 신선한 배양액(DMEM) 과 동일한 부피의 CellTiter-Glo^® reagent를 혼합하여 각 well에 200 μl의 반응혼합액을 첨가한 다음, orbital shaker에서 2분 그리고 정지상태에서 8분 동안 반응시킨 후 luminometer를 이용하여 발광양을 측정하였다. 이러한 실험은 각각 3회 반복 되었으며, 각 실험군의 세포증식률은 대조군(PBS)에 대한 상대적인 백분율로 표시되었다.
4). 특히, 50 mM의 SAC 처리는 24 및 48 hr에서 모두 95%의 현저한 발현감소를 유도하였다. 이와는 대조적으로, 활성형 caspase-9 단백질의 양은 12~48 hr의 SAC 처리에 의해 현저히 증가되었으며, 특히 50 mM의 처리에 의해 두드러진 증가를 나타내었다(Fig.

후속연구

결론적으로, 본 연구에서는 SAC 처리가 자궁경부암세포주의 세포증식을 억제하며, 이에 대한 가능한 분자적 작용기전들 중의 하나로 세포자멸과정의 상위경로에 해당하는 initiator caspase 중 하나인 caspase-9의 활성을 유도하고 이에 따른 하위경로의 effector caspase인 caspase-3과 caspase-7의 활성화를 초래할 뿐만 아니라, DNA 복구에 관여하는 PARP를 불활성화시킴으로써 세포의 자멸을 초래함을 제시한다. SAC의 세포증식억제효과에 대한 보다 더 구체적인 분자적 신호경로 또는 다른 조절기전은 향후 추가적인 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	SAC의 특징은 무엇인가?	마늘(Allium sativum)로부터 유래된 다양한 유기황 화합물들은 크게 diallyl sulfide, diallyl disulfide 및 diallyl trisulfide를 포함하는 지용성 군과 S-allylcysteine (SAC) 및 S-allylmercaptocysteine을 포함하는 수용성 군으로 나뉜다[35]. 그 중 SAC는 allyl기에 황 원자가 첨가된 cysteine의 유도체로서 숙성된 마늘에 다량 함유되어 있으며, 지난 수년간의 여러 연구를 통하여 항산화, 항염증, 신경보호 및 항암기능 등을 포함한 다양한 생리적 활성효과를 갖는 것으로 보고되어 왔다[15, 21, 35]. 그리고, 특히 마늘의 섭취가 암 발생의 감소뿐만 아니라 암의 진행을 억제하는 효과에 기여하는 것으로 보고됨에 따라[4, 36], 암의 예방과 치료를 위한 잠재적인 식품유래 화학요법제로서 SAC를 포함하는 유기황화합물들이 다양한 유형의 암세포에 대한 특이적 항암활성을 갖는 지에 대한 연구들이 진행되어 왔다[9].
	세포자멸 조절 기작 중 외인성 경로와 관련된 기작은?	세포기질에서 cytochrome c는 adaptor 단백질 Aparf-1 및 비활성 상태의 procaspase-9와 함께 apoptosome 을 형성하여 활성형 caspase-9를 생성하고, 활성화된 caspase-9는 다시 effector caspase인 caspase-3 및 caspase-7의 활성화를 매개한다[19, 27]. 외인성 경로는 Fas와 같은 세포 표면에 위치한 사멸수용체에 외부의 리간드가 결합함으로써 활성 화되며, 리간드와 사멸수용체의 결합은 Fas-associated protein with death domain (FADD)과 caspase-8로 구성된 deathinducing signaling complex (DISC)의 형성을 유도한다[3, 16, 28]. 조립된 DISC는 caspase-3의 활성화를 유도하여 세포의 자멸을 초래한다[1, 20, 33].
	마늘로부터 유래된 유기황 화합물은 무엇이 있는가?	마늘(Allium sativum)로부터 유래된 다양한 유기황 화합물들은 크게 diallyl sulfide, diallyl disulfide 및 diallyl trisulfide를 포함하는 지용성 군과 S-allylcysteine (SAC) 및 S-allylmercaptocysteine을 포함하는 수용성 군으로 나뉜다[35]. 그 중 SAC는 allyl기에 황 원자가 첨가된 cysteine의 유도체로서 숙성된 마늘에 다량 함유되어 있으며, 지난 수년간의 여러 연구를 통하여 항산화, 항염증, 신경보호 및 항암기능 등을 포함한 다양한 생리적 활성효과를 갖는 것으로 보고되어 왔다[15, 21, 35].

참고문헌 (36)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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