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문제 정의
- 이는 효소의 경우 대량생산하여 반응에 이용하기 힘들다는 점에 있어서 두 공정을 비교하여 활성을 비교하는 것이 동일한 수준에 이루어져야 한다는 것을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 포름알데하이드 제거에 사용된 효소, 흡착제, 산화 촉매제의 동일한 질량을 기준으로 비활성을 측정하고자 하였다. 결과적으로는 FDH 기반의 생물학적 효소의 비활성이 월등히 높게 측정이 되었는데, 이는 또한 효소 반응과 흡착/촉매 반응 조건에 영향을 받았을 것으로 생각된다.
- 또한 포름알데하이드 제거를 목적으로 할 경우, 제거되는 포름알데하이드와 효소 활성의 상관관계를 직접적으로 측정할 수 없다는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는FDH의 효소 활성을 측정함에 있어서 포름알데하이드를 직접적으로 검출하는 방법을 통하여 포름알데하이드의 제거 관점에서의 FDH 효소 활성을 측정하고자 한다. 본 연구에서는 포름알데하이드와 반응하여 색변화를 일으키는 pararosaniline과 purpald를 사용하였다.
- 본 연구는 chemo-enzymatic 융합 공정을 최종 목표로 생물학적 효소, 화학 흡착제 및 촉매의 활성에 대한 연구 결과를 비교하고자 하였다. 앞서 언급한 상이한 반응 스케일 및 반응 조건에 대한 최적화 연구가 추가적으로 진행이 된다면 생물학적인 촉매 방법과 화학적 흡착처리를 동시에 적용하여 효율적으로 포름알데하이드를 제거할 수 있을 것이다.
- 본 연구에서는 앞서 언급한 생물학적 FDH 효소 기반의 포름알데하이드 제거 연구와 더불어 활성탄, 제올라이트 흡착제와 Pd/TiO2 산화 촉매를 도입하여 액상 형태의 포름알데하이드를 제거 및 산화하는 반응 연구를 동시에 수행하였다. 이러한 연구 과정들을 통하여 본 연구의 궁극적인 목표인 pararosaniline-포름알데하이드 정량 검출 기반의 FHD 효소 활성 측정 및 화학적 흡착/산화 촉매 전환 효율의 정량적 비교를 연구하고자 한다[22].
- 본 연구에서는 앞서 진행한 FDH 효소 기반의 생물학적 포름알데하이드 전환 연구를 진행함과 동시에 화학적 흡착 및 산화적 촉매 반응을 통한 포름알데하이드 제거 연구를 함께 진행하였다. 화학적 흡착제로는 가장 많이 사용되는 활성탄과 제올라이트를 선정하였으며 열처리 및 alkaline 전처리 방법을 추가하여 액상 포름알데하이드의 제거 효율을 측정하였다.
- 산화 촉매를 도입하여 액상 형태의 포름알데하이드를 제거 및 산화하는 반응 연구를 동시에 수행하였다. 이러한 연구 과정들을 통하여 본 연구의 궁극적인 목표인 pararosaniline-포름알데하이드 정량 검출 기반의 FHD 효소 활성 측정 및 화학적 흡착/산화 촉매 전환 효율의 정량적 비교를 연구하고자 한다[22].
- 49sec-1mM-1의 kcat/Km 수치로 결정되었으며 이는 기존에 보고된 다양한FDH 효소 활성과 크게 다르지 않는 범위에 속한다. 특히 본 연구에서 사용한 FDH 효소는 비활성이 8.69 U/mg으로 측정되었으며, 이를 화학적 흡착 및 산화 촉매 활성과 상대적으로 비교하는 수치로 적용하고자 하였다. 활성탄 및 제올라이트를 이용한 화학적 흡착의 경우 대략 50% 수준의 비슷한 포름알데하이드 제거 효율을 보였으며 흡착도의 경우 0.
제안 방법
- FDH 효소 반응은 정제된 단백질을 사용하여 활성을 측정하였다. FDH 활성 측정 방법은 기존의 NADH 생성 속도로 측정하는 방법이 아닌 pararosaniline을 이용하여 검출하였다.
- FDH 효소 생산을 위해 FDH발현하는 fdh 유전자를 클로닝하였다.fdh 유전자는 E.
- FDH 효소 활성은 pararosaniline Schiff base를 사용하여 직접적인포름알데하이드 감소량을 정량하여 결정하였다. Pararosaniline Schiffbase의 제조는 다음과 같다.
- 초음파 분쇄기를 통하여 세포를 파쇄한 이후 세포 파쇄 총 부분과 13,500 rpm 원심분리 이후 수용성 상층액 부분을 회수하여 단백질 전기 영동법을 통하여 분리하였다. FDH 효소를 분리 정제하기 위하여 동일하게 발현 유도된 세포를 lysis 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl)에 재부유하고 이어서 초음파 파쇄를 통하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 후 획득한 수용성 단백질 부분은 Ni-NTA resin과 결합 후 다양한 농도의 imidazole 수용액으로 세척 및 분리를 통하여 최종적으로 수용성으로 발현된 FDH 단백질만을 분리 정제하였다.
- Km, kcat 및 kcat / Km의 FDH kinetic 상수들은 5 µg/mL FDH 단백질과 각각 0.1 µM, 1.0 µM, 50 µM, 100 µM의 기질에 대해서 측정한 포름알데하이드 제거 속도를 통하여 결정하였다.
- coli BL21(DE3)를 사용하였고 발현조건은 다음과 같다. pET-28a(+)-fdh 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 형질 전환하여 fdh 발현 균주를 구축하였다. LB 복합 배지 2 mL에 FDH발현 균주를 접종하여 37℃에서 12 h 배양하고, 250 mL 플라스크에 50 mL LB 복합배지를 멸균하여 초기 배양액 0.
- 본 실험을 진행하기 위하여 대장균(Escherichia coli K12)의 유전자에 존재하는 fdh 유전자를 확보하고 발현용 대장균인 Escherichia coli BL21(DE3)에서 T7 promoter 조절 하에 FDH 효소를 발현하고 정제하였다. 그리고 FDH 효소와 다양한 농도의 포름알데하이드를 in-vitro에서 반응하고 연속적으로 pararosaniline 기반의 정량 방법 적용하여 FDH 효소의 kinetic 수치들과 동시에 제거되는 포름알데하이드의 비활성을 측정하였다.
- 95 ℃에서 5 min 이후, 95℃에서 1 min, 58 ℃에서 1 min, 72 ℃에서 1 min (30사이클), 60 ℃에서 5 min. 그리고 증폭한 fdh 유전자는 EcoRI과 HindIII 제한효소를이용하여 양 말단을 효소 반응 처리하고 동일한 제한 효소로 처리한pET-28a(+) 클로닝 벡터에 ligation하여 pET-28a(+)-fdh 플라스미드를구축하였다.
- 본 연구에서 사용한 흡착제 활성탄은 AC pellet 2 mm 및 4-8 meshAC이며 그리고 제올라이트 흡착제는 zeolite 5A와 zeolite X (13X)를사용하였다. 그리고 활성탄, 제올라이트를 지지체로 하여 alkaline 처리한 흡착제의 경우 각각 지지체 1 g당 0.00125 mol의 KI, KOH가 입혀진 촉매를 제조하기 위해 활성탄, 제올라이트 100 g에 KI 20.75 g,KOH 7.01 g을 impregnation하여 활성탄과 제올라이트 표면에 골고루 입혀주었다. 그리고 100 ℃에서 수분을 제거해준 후 110 ℃에서 완전건조하고 촉매 실험 전 증류수로 여러 번 씻어주어 촉매에 남은 불순물을 제거하고 건조하여 각각의 흡착제를 준비하였다.
- 기존의 pararosaniline을 이용한 포름알데하이드의 검출의 경우 높은 민감도 및 저농도의 검출이 용이하였으나, 화학적 흡착 및 산화 촉매 반응의 경우 고농도의 포름알데하이드 검출에 효율적인 purpald 검출을 이용하여 흡착 및 산화 반응 이후 반응기의 잔류 포름알데하이드를 검출하였다. Purpald (4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole, CAS 1750-12-5) 시약은 Sigma-Aldrich Korea (Suwon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 우선 pararosaniline 발색 강도와 포름알데하이드의 농도 의존성에 대한 실험 결과를 토대로 농도 의존성 상관 관계식을 유도하였으며, 이 관계식을 이용하여 FDH 효소 반응을 통한 포름알데하이드 제거 효율의 결정에 응용할 수 있었다. 본 실험을 진행하기 위하여 대장균(Escherichia coli K12)의 유전자에 존재하는 fdh 유전자를 확보하고 발현용 대장균인 Escherichia coli BL21(DE3)에서 T7 promoter 조절 하에 FDH 효소를 발현하고 정제하였다. 그리고 FDH 효소와 다양한 농도의 포름알데하이드를 in-vitro에서 반응하고 연속적으로 pararosaniline 기반의 정량 방법 적용하여 FDH 효소의 kinetic 수치들과 동시에 제거되는 포름알데하이드의 비활성을 측정하였다.
- 0, 150 mM NaCl)에 재부유하고 이어서 초음파 파쇄를 통하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 후 획득한 수용성 단백질 부분은 Ni-NTA resin과 결합 후 다양한 농도의 imidazole 수용액으로 세척 및 분리를 통하여 최종적으로 수용성으로 발현된 FDH 단백질만을 분리 정제하였다. 이렇게 분리 정제한 단백질은 아래와 같은 in-vitro 효소 반응을 통하여 포름알데하이드 산화 반응 검출에 최종적으로 사용되었으며 단백질 농도는 Bradford assay를 통하여 정량하였다.
- Pararosaniline과 purpald는 포름알데하이드와 반응하게 되면포름알데하이드의 농도에 따라 다양한 농도의 보라색으로 발색하게 된다(Figure 1). 우선 pararosaniline 발색 강도와 포름알데하이드의 농도 의존성에 대한 실험 결과를 토대로 농도 의존성 상관 관계식을 유도하였으며, 이 관계식을 이용하여 FDH 효소 반응을 통한 포름알데하이드 제거 효율의 결정에 응용할 수 있었다. 본 실험을 진행하기 위하여 대장균(Escherichia coli K12)의 유전자에 존재하는 fdh 유전자를 확보하고 발현용 대장균인 Escherichia coli BL21(DE3)에서 T7 promoter 조절 하에 FDH 효소를 발현하고 정제하였다.
- 완전히 pararosaniline-HCl의 붉은색이 소멸되는 순간의 수용액을 pararosaniline Schiff base-포름알데하이드 검출 지시약으로 사용하였다. 이렇게 준비한 pararosaniline Schiff base를 FDH와 포름알데하이드의 효소반응 종료 후 준비한 반응기에 혼합하였고, 5 min간 상온에서 반응시킨 후 UV/vis spectrometry를 이용하여 540 nm흡광도를 관찰하였다. 흡광 세기와 포름알데하이드 농도와의 상관 관계를 구하기 위하여 동일한 조건에서 포름알데하이드 농도를 10 nM에서 1 mM농도 구간에서 흡광도를 측정하여 FDH 효소 반응에 사용한 기질 농도 범위에서 가장 근접한 비례 상수를 도입하여 포름알데하이드를 정량하였다(Figure 3).
- 69 U/mg으로 측정이 되었다. 이와 동시에 활성탄 및 제올라이트를 이용한 포름알데하이드제거 효율을 측정하여 chemisorption capacity와 산화 반응 효율을 우선 결정하였다. 초기 포름알데하이드의 농도가 100 µg/mL 수준일 경우 대부분의 흡착 결과 흡착도는 0.
- 정제된 FDH 단백질과 0.1µM에서 0.1 mM의 다양한 농도의 포름알데하이드 기질을 이용하여다음과 같은 조건에서 in-vitro 효소 반응을 진행하였다.
- 화학적 흡착제로는 가장 많이 사용되는 활성탄과 제올라이트를 선정하였으며 열처리 및 alkaline 전처리 방법을 추가하여 액상 포름알데하이드의 제거 효율을 측정하였다. 제거된 포름알데하이드의 농도 ∆[FA]는 초기반응에 사용한 포름알데하이드의 농도 [FA]0에서 흡착 이후 배출되는포름알데하이드의 농도 [FA]10를 purpald assay를 통하여 정량하였다.
- 초기 포름알데하이드의 농도는 100 µg/mL 및 10 µg/mL에 대해서 상온 흡착 실험을 진행하였고, 제올라이트 5A, 고온 열처리를 한 제올라이트, KI 처리를 한 제올라이트, pellet활성탄, 4-8 mesh 활성탄, KI 처리를 한 활성탄에 대해서 각각 흡착 실험을 진행하였고, 상온에서 Pd/TiO2 촉매에 의한 산화 반응의 총 7가지 포름알데하이드 흡착 및 산화 실험을 진행하였다.
- 획득한 세포는 SDS-PAGE 단백질 분리를 통하여 단백질 발현을 확인하는데 사용하였다. 초음파 분쇄기를 통하여 세포를 파쇄한 이후 세포 파쇄 총 부분과 13,500 rpm 원심분리 이후 수용성 상층액 부분을 회수하여 단백질 전기 영동법을 통하여 분리하였다. FDH 효소를 분리 정제하기 위하여 동일하게 발현 유도된 세포를 lysis 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 8.
- 흡광 세기와 포름알데하이드 농도와의 상관 관계를 구하기 위하여 동일한 조건에서 포름알데하이드 농도를 10 nM에서 1 mM농도 구간에서 흡광도를 측정하여 FDH 효소 반응에 사용한 기질 농도 범위에서 가장 근접한 비례 상수를 도입하여 포름알데하이드를 정량하였다(Figure 3). 포름알데하이드 정량 결과를 토대로 FDH 효소 kinetics를 결정하였다. Km, kcat 및 kcat / Km의 FDH kinetic 상수들은 5 µg/mL FDH 단백질과 각각 0.
- Figure 2의 포름알데하이드 농도에 따른 pararosaniline의 발색 농도변화 및 흡광도의 상관 관계를 살펴보면 100 µM에서 100 nM 수준의 농도에서는 선형적인 포름알데하이드의 검출이 가능하였으나 1 mM이상 혹은 100 nM 이하의 포름알데하이드 농도에서는 흡광도가 너무 높게 측정되거나 너무 낮게 측정되어 정확한 포름알데하이드의 농도를 검출하기 힘들었다. 포름알데하이드의 검출 최적 농도를 고려하여FDH 효소 반응의 기질 농도의 범위를 결정하였다. 분리한 FDH 단백질 용액으로부터 다양한 농도의 포름알데하이드 기질에 대해 측정한포름알데하이드 소멸 속도를 Michaelis-Menten equation에 대입하여 Km, kcat 및 kcat /Km 상수들을 결정하였다.
- 생물학적 처리 반응의 비활성은 U/mg 단위로 측정되었으나 화학적 처리 공정의 경우 U/g으로 측정되어 생물학적 제거 공정이 월등히 높게 측정되었다. 화학적 흡착 및 산화 촉매 반응 역시 제거 효율을 동일한 기준의 비활성으로 전환하여 비교하였다(Figure 5). 비활성 단위의 정의를 표준 반응 조건에서 1 mg의 포름알데하이드를 제거하기 위해서 필요한 화학 흡착제 혹은 촉매의 g양으로 정의하였고 이는 FDH의 효소 비활성 단위와 비교하였을 때 동일한 1 mg의 포름알데하이드를 제거하기 위해서 필요한 효소의 양을 mg으로 정의한 것에 비해 천분의 일 수준으로 낮게 정의된 단위이다.
- 본 연구에서는 앞서 진행한 FDH 효소 기반의 생물학적 포름알데하이드 전환 연구를 진행함과 동시에 화학적 흡착 및 산화적 촉매 반응을 통한 포름알데하이드 제거 연구를 함께 진행하였다. 화학적 흡착제로는 가장 많이 사용되는 활성탄과 제올라이트를 선정하였으며 열처리 및 alkaline 전처리 방법을 추가하여 액상 포름알데하이드의 제거 효율을 측정하였다. 제거된 포름알데하이드의 농도 ∆[FA]는 초기반응에 사용한 포름알데하이드의 농도 [FA]0에서 흡착 이후 배출되는포름알데하이드의 농도 [FA]10를 purpald assay를 통하여 정량하였다.
- 이렇게 준비한 pararosaniline Schiff base를 FDH와 포름알데하이드의 효소반응 종료 후 준비한 반응기에 혼합하였고, 5 min간 상온에서 반응시킨 후 UV/vis spectrometry를 이용하여 540 nm흡광도를 관찰하였다. 흡광 세기와 포름알데하이드 농도와의 상관 관계를 구하기 위하여 동일한 조건에서 포름알데하이드 농도를 10 nM에서 1 mM농도 구간에서 흡광도를 측정하여 FDH 효소 반응에 사용한 기질 농도 범위에서 가장 근접한 비례 상수를 도입하여 포름알데하이드를 정량하였다(Figure 3). 포름알데하이드 정량 결과를 토대로 FDH 효소 kinetics를 결정하였다.
대상 데이터
- FDH 효소 발현용 대장균은 E. coli BL21(DE3)를 사용하였고 발현조건은 다음과 같다. pET-28a(+)-fdh 플라스미드를 E.
- 기존의 pararosaniline을 이용한 포름알데하이드의 검출의 경우 높은 민감도 및 저농도의 검출이 용이하였으나, 화학적 흡착 및 산화 촉매 반응의 경우 고농도의 포름알데하이드 검출에 효율적인 purpald 검출을 이용하여 흡착 및 산화 반응 이후 반응기의 잔류 포름알데하이드를 검출하였다. Purpald (4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole, CAS 1750-12-5) 시약은 Sigma-Aldrich Korea (Suwon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Purpald 시약은 기존의 pararosaniline과 동일하게 포름알데하이드와 반응 후 보라색으로 발색하는 성질이 있으며 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량할 수 있다.
- 본 연구에서 사용한 흡착제 활성탄은 AC pellet 2 mm 및 4-8 meshAC이며 그리고 제올라이트 흡착제는 zeolite 5A와 zeolite X (13X)를사용하였다. 그리고 활성탄, 제올라이트를 지지체로 하여 alkaline 처리한 흡착제의 경우 각각 지지체 1 g당 0.
- 따라서 본 연구에서는FDH의 효소 활성을 측정함에 있어서 포름알데하이드를 직접적으로 검출하는 방법을 통하여 포름알데하이드의 제거 관점에서의 FDH 효소 활성을 측정하고자 한다. 본 연구에서는 포름알데하이드와 반응하여 색변화를 일으키는 pararosaniline과 purpald를 사용하였다. 이 방법을 통하여 제거되는 포름알데하이드의 양을 정확히 측정할 수 있었고 기질 감소 속도를 통하여 FDH 효소 활성 및 비활성을 결정할 수 있었다[15].
- 그 후 60 ℃에서 남아있는 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 촉매를 110 ℃에서 20 h 동안 완전 건조시킨후 400 ℃에서 2 h 동안 calcination하고 촉매 실험 전 증류수로 여러 번 씻어주어 촉매에 남은 불순물을 제거하고 건조기에 말려주어 Pd/TiO2 산화 촉매를 준비하였다.
- 획득한 세포는 SDS-PAGE 단백질 분리를 통하여 단백질 발현을 확인하는데 사용하였다. 초음파 분쇄기를 통하여 세포를 파쇄한 이후 세포 파쇄 총 부분과 13,500 rpm 원심분리 이후 수용성 상층액 부분을 회수하여 단백질 전기 영동법을 통하여 분리하였다.
이론/모형
- FDH 효소 반응은 정제된 단백질을 사용하여 활성을 측정하였다. FDH 활성 측정 방법은 기존의 NADH 생성 속도로 측정하는 방법이 아닌 pararosaniline을 이용하여 검출하였다. 정제된 FDH 단백질과 0.
- 포름알데하이드의 검출 최적 농도를 고려하여FDH 효소 반응의 기질 농도의 범위를 결정하였다. 분리한 FDH 단백질 용액으로부터 다양한 농도의 포름알데하이드 기질에 대해 측정한포름알데하이드 소멸 속도를 Michaelis-Menten equation에 대입하여 Km, kcat 및 kcat /Km 상수들을 결정하였다. 포름알데하이드 제거 최고속도 Vmax는 24.
- 세포 파쇄 후 획득한 수용성 단백질 부분은 Ni-NTA resin과 결합 후 다양한 농도의 imidazole 수용액으로 세척 및 분리를 통하여 최종적으로 수용성으로 발현된 FDH 단백질만을 분리 정제하였다. 이렇게 분리 정제한 단백질은 아래와 같은 in-vitro 효소 반응을 통하여 포름알데하이드 산화 반응 검출에 최종적으로 사용되었으며 단백질 농도는 Bradford assay를 통하여 정량하였다.
성능/효과
- 특히 Figure 2의 total cell extract에서 보이는 것과 같이 세포 전체 단백질에서 발현된 FDH 효소의 비율이 상당히 높은 것을 확인할 수 있었다. FDH 효소는 총 380개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 예상되는 단백질의 크기는 40 kDa으로Figure 2의 marker 크기와 비교할 때 동일한 크기의 FDH 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Ni-NTA resin을 이용하여 imidazole 농도에 따라 정제한 FDH 효소의 경우 Figure 2의 purified fraction과 같이 동일한 40 kDa 크기로 순수한 FDH 효소만을 분리할 수 있었다.
- FDH 효소의 농도는 Bradford assay방법으로 정량하였으며 그 결과 FDH 최종 농도는 0.5 mg/mL로 분자량을 고려하였을 때 최종적으로 순수한 12.7 µM의 FDH 단백질을 분리할 수 있었다.
- 촉매에 의한 산화 반응의 총 7가지 포름알데하이드 흡착 및 산화 실험을 진행하였다. Table 2의 결과와 같이 Pd/TiO2를 제외한 제올라이트, 활성탄 전부 45-70% 수준의 포름알데하이드 제거 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 제올라이트 및 활성탄의 경우 모두 KI를 처리하였을 때 포름알데하이드 제거 효율이 제올라이트가 47.
- 8% 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 가장 높은 포름알데하이드 제거 효율은 제올라이트를 KI처리를 한 흡착제였으며 67.7%의 최고 제거 효율을 나타내었다. 특히 Pd/TiO2의 산화 촉매 반응의 경우 제거 효율이 26.
- 따라서 본 연구에서는 포름알데하이드 제거에 사용된 효소, 흡착제, 산화 촉매제의 동일한 질량을 기준으로 비활성을 측정하고자 하였다. 결과적으로는 FDH 기반의 생물학적 효소의 비활성이 월등히 높게 측정이 되었는데, 이는 또한 효소 반응과 흡착/촉매 반응 조건에 영향을 받았을 것으로 생각된다.
- 26 U/g의 가장 높은 비활성을 나타내었다. 그러나 이 수준의 비활성은 FDH 효소의 비활성과 비교할 경우 104 수준으로 절대적으로 낮은 수치이고 상대적으로 비교하기에는 무리가 있다고 판단되었다. 위와 같은 결과는 화학 촉매 반응과 효소 반응의 활성 비교 기준이 다르기 때문이며 두 반응을 효과적으로 동시에 적용하기에는 한계점이 있다고 생각된다.
- 93 ×102 sec-1로 측정되었다. 기존에 보고된 P. putida 유래의 FDH 효소의 경우 포름알데하이드 기질에 대한 Km 수치가 0.09 mM 수준임을 고려할 경우 P. putida 유래 FDH 효소와 기질 친화도는 비슷한 수준임을 확인할 수 있었다. 또한 정제한 FDH 효소의 specific activity는 8.
- coli BL21(DE3)-FDH로부터 세포 총 단백질 및 수용성 부분들을 Figure 2의 SDS-PAGE 결과로부터 확인할 수 있었다. 기존에 보고된 대부분의 FDH 효소들이 대장균에서 발현 혹은 수용성 발현이 잘 되지 않아 P. putida FDH 효소의 경우와 같이 chaperon 등의 발현 보조 단백질들을 추가적으로 이용하였으나, 본 연구에서 사용된 E. coli K12균주의 FDH 효소는 E. coli BL21(DE3)에서 상당히 발현이 잘 이루어졌다. 특히 Figure 2의 total cell extract에서 보이는 것과 같이 세포 전체 단백질에서 발현된 FDH 효소의 비율이 상당히 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과를 통하여 포름알데하이드 제거 혹은 전환 실험에 있어서 화학적 흡착 및 촉매 전환 공정보다 생물학적 효소 전환 활성이 월등히 더 높다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 효소 반응과 흡착/촉매 화학 반응은 반응 시스템에 있어서 근본적인 차이점을 내재하고 있다.
- 그리고 이러한 기질 특이성을 기반으로 FDH의 class가 결정이 되며 아미노산 서열 유사도 분석을 통해 FDH 효소의 class를 예상할 수 있다. 본 연구에서 진행한 E. coli K12 유래의 FDH 효소를BLASTP (https://blast.cbni.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 통하여 아미노산서열을 분석해 본 결과 S-(hydroxymethyl)glutathione dehydrogenase 효소로 구분이 되며 이는 class III alcohol dehydrogenase 효소에 해당하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 Class III에 해당되는 FDH 효소의 경우 일반적으로 medium-chain family (MDR)에 해당된다고 알려져 있다[5,7].
- Purpald 시약은 기존의 pararosaniline과 동일하게 포름알데하이드와 반응 후 보라색으로 발색하는 성질이 있으며 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량할 수 있다. 이와 같은 검출 방법을 통하여 잔류 포름알데하이드 농도를 정량하였고 각각의 흡착제 및 산화 촉매의 포름알데하이드 제거 효율을 결정할 수 있었다.
- 특히 비활성의 경우 평균적으로 < 0.3 U/g 수준으로 측정되어, FDH기반의 생물학적 포름알데하이드 제거 활성이 월등히 높음을 알 수 있었다.
- Table 2의 결과와 같이 Pd/TiO2를 제외한 제올라이트, 활성탄 전부 45-70% 수준의 포름알데하이드 제거 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 제올라이트 및 활성탄의 경우 모두 KI를 처리하였을 때 포름알데하이드 제거 효율이 제올라이트가 47.5%,활성탄이 24.8% 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 가장 높은 포름알데하이드 제거 효율은 제올라이트를 KI처리를 한 흡착제였으며 67.
- 69 U/mg으로 측정되었으며, 이를 화학적 흡착 및 산화 촉매 활성과 상대적으로 비교하는 수치로 적용하고자 하였다. 활성탄 및 제올라이트를 이용한 화학적 흡착의 경우 대략 50% 수준의 비슷한 포름알데하이드 제거 효율을 보였으며 흡착도의 경우 0.2 mg/g 수준으로 측정되었다. 특히 비활성의 경우 평균적으로 < 0.
후속연구
- 6% Pt/TiO2 산화 촉매의 경우 40% 이하의 낮은 전환 효율을 갖는 것으로 보고되었다[23-26]. 더 높은 포름알데하이드 전환 효율을 확보하기 위해서는 상온보다는 고온에서 다양한 금속 산화제 및 첨가물에 대한 심도 있는 촉매 반응 연구가 필요할 것으로 생각된다. 특히 이 과정에서 더 정확한 촉매 활성을 평가하기 위해서는 다양한 구간의 온도에서 다양한 범위의 포름알데하이드 기질 농도와 반응한 결과를 측정해야 하는 오랜 연구가 필요할 것이다.
- 본 연구는 chemo-enzymatic 융합 공정을 최종 목표로 생물학적 효소, 화학 흡착제 및 촉매의 활성에 대한 연구 결과를 비교하고자 하였다. 앞서 언급한 상이한 반응 스케일 및 반응 조건에 대한 최적화 연구가 추가적으로 진행이 된다면 생물학적인 촉매 방법과 화학적 흡착처리를 동시에 적용하여 효율적으로 포름알데하이드를 제거할 수 있을 것이다. 이상적으로는 생물학적-화학적 공정의 각각의 장점들을 융합 적용한 복합 연속 공정을 시도하여 다양한 변수들을 최적화하고,비단 포름알데하이드 뿐 아니라 다양한 기질의 처리 및 전환 공정에 응용할 수 있는 모델 시스템으로서 개발이 가능할 것으로 생각된다.
- 앞서 언급한 상이한 반응 스케일 및 반응 조건에 대한 최적화 연구가 추가적으로 진행이 된다면 생물학적인 촉매 방법과 화학적 흡착처리를 동시에 적용하여 효율적으로 포름알데하이드를 제거할 수 있을 것이다. 이상적으로는 생물학적-화학적 공정의 각각의 장점들을 융합 적용한 복합 연속 공정을 시도하여 다양한 변수들을 최적화하고,비단 포름알데하이드 뿐 아니라 다양한 기질의 처리 및 전환 공정에 응용할 수 있는 모델 시스템으로서 개발이 가능할 것으로 생각된다.
- 더 높은 포름알데하이드 전환 효율을 확보하기 위해서는 상온보다는 고온에서 다양한 금속 산화제 및 첨가물에 대한 심도 있는 촉매 반응 연구가 필요할 것으로 생각된다. 특히 이 과정에서 더 정확한 촉매 활성을 평가하기 위해서는 다양한 구간의 온도에서 다양한 범위의 포름알데하이드 기질 농도와 반응한 결과를 측정해야 하는 오랜 연구가 필요할 것이다.
- 효소의 specific activity 측정 결과는 포름알데하이드를 기질로 하여 결정하였으나, 정확한 효소의 특성을 판단하기 위해서는 다양한 탄소 길이를 갖는 알데하이드를 기질로 하여 효소 활성을 측정하고 각각의 기질에 대해서 활성을 비교하는 연구가 필요할 것으로 생각된다. 이는 기존에 보고된 다양한 FDH 효소의 경우 short/medium/long-chain의 알데하이드에 대한 기질 특이성이 탄소 길이에 따라 다르기 때문이다.
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