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문제 정의
- ) Sacc.를 국내에서 처음으로 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 꽃도라지 지제부에서 분리한 병원균의 균학적 특성, 염기서열 분석 결과 및병원성 검정에 대한 결과를 토대로 꽃도라지 뿌리썩음병의 발생을 국내 최초로 보고하고자 한다.
제안 방법
- 균주 NC15-392, NC15-433, NC15-434를 각각 PDA 배지에 10일간 배양하고, 멸균수로 포자를 회수하여 1 × 106 spores/mL의 농도로 포자현탁액을 만들었다. 50공 육묘상자에서 8~12개 잎이 전개된 꽃도라지 유묘를 뽑아 흙을 씻어내고, 멸균된 가위를 사용하여 뿌리 끝부분을 약 0.5 cm 정도 잘라 상처를 내고 포자현탁액에 10분간 침지처리 하였다. 대조구는 뿌리 끝부분을 자른 꽃도 라지 유묘를 멸균수에 침지하여 처리하였다.
- 5 cm 정도 잘라 상처를 내고 포자현탁액에 10분간 침지처리 하였다. 대조구는 뿌리 끝부분을 자른 꽃도 라지 유묘를 멸균수에 침지하여 처리하였다. 침지 후, 꽃도라지 유묘를 플라스틱 포트(직경 20 cm)에 3주씩 옮겨 정식하였고, 균주당 5개 포트를 처리하였으며, 병원성 검정은 2회 수행 하였다.
- ) Sacc.로 동정되었으며, 건전한 꽃도라지 유묘에 인공접종하여 병원성을 확인하였다.
- 병든 꽃도라지 시료에서 병원균을 분리하기 위하여 지제부를 세로로 절단하고 도관부의 갈변된 병든 조직과 건전 조직의 경계부위를 3 × 3 mm 크기로 잘라냈다.
- Fusarium속 균은 균학적 특성에 의한 형태적 분류의 한계로 몇 개 유전자를 이용한 계통분류학적 연구가 활발히 진행되어 왔고, 이를 종 분류에 사용하고 있다[11-13]. 본 연구에서 형태적-특성에 의해 F. solani로 확인된 균주의 정확한 동정을 위해 translation elongation factor 1 alpha (TEF)와 RNA polymerase II second largest subunit (RPB2) 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. Potato dextrose broth (PDB) 배지에서 배양한 균사를 동결 건조하여 마쇄한 후, CTAB-phenol법으로 genomic DNA를 추출하였다[14].
- 각 균주는 감자한천 배지(potato dextrose agar, PDA)에 옮겨 배양하고, 이 균주를 10℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리한 Fusarium균의 균학적 특성은 carnation leaf agar (CLA) 배지를 사용하여 22℃, near ultraviolet (NUV)/암조건(12시간/12시간)으로 배양하여 조사하였고, 배양적 특성은 PDA 배지에서 25℃, 암조건으로 7일간 배양하여 조사 하였으며, 경기도 여주 시료에서 분리한 NC15-392와 경남 김해 시료에서 분리한 NC15-433 균주를 대상으로 하였다.
- 증폭 산물은 Wizard SV Gel & PCR Clean-up System kit (Promega, San Luis Obispo, CA, USA)로 정제하였고, direct sequencing을 통해 염기서열 분석을 실시하였다.
- 대조구는 뿌리 끝부분을 자른 꽃도 라지 유묘를 멸균수에 침지하여 처리하였다. 침지 후, 꽃도라지 유묘를 플라스틱 포트(직경 20 cm)에 3주씩 옮겨 정식하였고, 균주당 5개 포트를 처리하였으며, 병원성 검정은 2회 수행 하였다. 접종 3일 후부터, NC15-392 균주 접종구에서 유묘가 시드는 증상이 관찰되었고, 7일후에는 모든 접종구에서 유묘가 시들고 생육이 불량했으며, 특히 NC15-392 접종구에서는 식물체가 완전히 시들어 황화되었다(Table 2, Fig.
대상 데이터
- 균주 NC15-392, NC15-433, NC15-434를 각각 PDA 배지에 10일간 배양하고, 멸균수로 포자를 회수하여 1 × 106 spores/mL의 농도로 포자현탁액을 만들었다.
- 꽃도라지 유묘를 대상으로 3개 분리 균주의 병원성을 확인하였다. 균주 NC15-392, NC15-433, NC15-434를 각각 PDA 배지에 10일간 배양하고, 멸균수로 포자를 회수하여 1 × 106 spores/mL의 농도로 포자현탁액을 만들었다.
- solani균과 97%의 상동성을 나타낸다고 하였다[5]. 따라서 본 연구에서는 36개 F. solani species complex와 일본 꽃도라지 뿌리썩음병균을 포함하여 TEF 유전자를 분석하였으며, 외집단 (outgroup)은 Fusarium staphyleae를 대상으로 하였다. 그 결과, 국내 꽃도라지 분리균 역시 clade 3에 속하였고, 일본의 꽃도라지 뿌리썩음병균과 99.
데이터처리
- 증폭 산물은 Wizard SV Gel & PCR Clean-up System kit (Promega, San Luis Obispo, CA, USA)로 정제하였고, direct sequencing을 통해 염기서열 분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 정렬하였고, nucleotide의 유사도를 계산하여 MEGA 6.0 프로그램을 이용하여 neighbor-joining법에 의해 계통수를 작성하였다(Fig. 2). O’Donnell[12]은 여러 기주에서 분리한 36개의 F.
이론/모형
- solani로 확인된 균주의 정확한 동정을 위해 translation elongation factor 1 alpha (TEF)와 RNA polymerase II second largest subunit (RPB2) 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. Potato dextrose broth (PDB) 배지에서 배양한 균사를 동결 건조하여 마쇄한 후, CTAB-phenol법으로 genomic DNA를 추출하였다[14]. TEF 유전자는 EF-1/EF2 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다[15].
- Sequence data were obtained from the NCBI GenBank database. The tree was generated using neighbor- joining analysis and Kimura 2-parameter model. Bar represents the number of nucleotide substitutions per site.
성능/효과
- 잘라낸 조각은 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 1분간 표면 살균하고, 멸균수로 3회 세척한 후 물기를 제거하고 물한천 배지(water agar, WA)에 치상하였다. 3~5일 후, 시료 절편에서 자라난 균총을 관찰한 결과, 모두 Fusarium균의 포자가 확인되었고, 각 균총으로부터 9개 균주를 단포자 분리하였다. 각 균주는 감자한천 배지(potato dextrose agar, PDA)에 옮겨 배양하고, 이 균주를 10℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 1G, 1J). PDA 배지에서의 배양적 특성을 조사한 결과, 두 균주 모두 생육속도가 빠른 편이었고, 기중균사는 많지 않으나 흰색 내지 분홍색에서 오렌지색이었으며, NC15-433 균주는 색소의 형성이 없었으나 NC15-392 균주는 오렌지색의 색소를 형성하는 특징이 있었다(Fig. 1B~1E). 이와 같은 형태적, 배양적 특성은 이전에 보고된 F.
- solani species complex의 분류학적 재정리가 필요하다고 하였다[5]. TEF 유전자 분석에 사용된 36개 F. solani species complex 중 31개 종을 대상으로 RPB2 유전자를 분석하였으며, 외집단은 TEF 유전자 분석과 동일한 F. staphyleae로 하였다. 그 결과, 국내 꽃도라지 분리균은 clade 3에 속하였으며, F.
- 1%의 상동성을 나타내었다. 건전한 꽃도라지 유묘의 뿌리를 포자현탁액에 침지 접종하여 병원성 검정을 수행한 결과, 접종 7일 이내에 접종한 식물체에서만 병징이 관찰되었다. 따라서 이 병을 F.
- staphyleae로 하였다. 그 결과, 국내 꽃도라지 분리균은 clade 3에 속하였으며, F. striatum NRRL22101와 가장 높은 98.0~98.1%의 상동성을 나타냈는데 이 균은 파나마에서 분리된 종이며, F. solani의 이명 (synonym)으로 알려져 있다(Fig. 2B). 이와 같이 TEF와 RPB2 유전자 분석 결과 간에는 일부 차이를 보였으며, 따라서 Fusarium균의 계통분류 연구에는 2개 이상의 유전자를 사용하는 multilocus sequence typing (MLST) 분석이 필요할 것으로 생각된다.
- 이와 같은 동정 결과는 translation elongation factor 1 alpha (TEF)와 RNA polymerase II subunit (RPB2) 유전자의 염기서열 분석으로 재확인되었다. 그 결과, 분리 균주는 NCBI GenBank에 등록된 F. solani와 TEF 유전자는 99.2~99.9%, RPB2 유전자는 98.0~98.1%의 상동성을 나타내었다. 건전한 꽃도라지 유묘의 뿌리를 포자현탁액에 침지 접종하여 병원성 검정을 수행한 결과, 접종 7일 이내에 접종한 식물체에서만 병징이 관찰되었다.
- 분생포자경의 길이는 매우 길며, 투명하고, mono 형태의 분생포자원세포(phialide)를 형성하였다. 두 개의 균주 모두 소형분생포자는 계란형 혹은 타원형 내지 원통형으로 투명하였고, NC15-433 균주의 경우 격막이 1~2개 있는 meso 형태의 소형분생포자가 다수 관찰되었다(Fig. 1F, 1I). NC15-392 균주의 포자크기는 11.
- 병든 식물체는 포장이나 육묘상자에서 황화되고, 뿌리 발육이 저해되었고, 진전되면 전체적으로 황화되면서 시들고, 위축되며, 결국 2~3개월 안에 완전히 말라 죽는다. 병든 식물체 지제부에서 Fusarium균이 분리되었고, 9개 균주를 단포자 분리하여 형태적 특성을 조사한 결과, Fusarium solani로 동정되었다. 대형포자는 통통하고, 직선형이거나 약간 굽은 초승달 모양이고, 소형분생포자는 긴 mono형태의 분생포자원세포에서 false head상으로 형성되었다.
- 이와 같이 TEF와 RPB2 유전자 분석 결과 간에는 일부 차이를 보였으며, 따라서 Fusarium균의 계통분류 연구에는 2개 이상의 유전자를 사용하는 multilocus sequence typing (MLST) 분석이 필요할 것으로 생각된다. 여기서 분석된 F.solani NC15-392, NC15-433, NC15-434 균주의 TEF 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 KX901847~ KX901849의 accession number로 등록하였고, RPB2 유전자 염기서열은 KY412780~ KY412782로 등록하였다.
- 이상과 같이 꽃도라지 뿌리썩음 증상에서 분리한 병원균은 형태적, 배양적 특성 및 DNA 염기서열 분석에 의해 F. solani로 동정되었고, 인위적 접종을 통해 꽃도라지에 병원성이 있음이 확인되었다. 따라서 본 결과를 바탕으로 국내 꽃도라지에 발생하는 뿌리썩음병균으로 Fusarium solani (Mart.
- 1B~1E). 이와 같은 형태적, 배양적 특성은 이전에 보고된 F. solani의 특성과 유사하며, 따라서 이들 분리균을 F. solani로 동정하였다(Table 1)[10].
- 침지 후, 꽃도라지 유묘를 플라스틱 포트(직경 20 cm)에 3주씩 옮겨 정식하였고, 균주당 5개 포트를 처리하였으며, 병원성 검정은 2회 수행 하였다. 접종 3일 후부터, NC15-392 균주 접종구에서 유묘가 시드는 증상이 관찰되었고, 7일후에는 모든 접종구에서 유묘가 시들고 생육이 불량했으며, 특히 NC15-392 접종구에서는 식물체가 완전히 시들어 황화되었다(Table 2, Fig. 1L). 또한 접종구와 무처리구의 식물체를 뽑아 뿌리를 관찰한 결과, 접종구에서의 뿌리 발육이 현저히 저해되고, 뿌리썩음 증상이 나타 났다(Fig.
- 1M). 접종구와 무처리구의 식물체 뿌리에서 균을 재분리한 결과, 접종구에서는 Fusarium균이 재분리되었고, 무처리구에서는 분리되지 않았다. 남아프리카의 꽃도라지에서 분리한 F.
후속연구
- 2B). 이와 같이 TEF와 RPB2 유전자 분석 결과 간에는 일부 차이를 보였으며, 따라서 Fusarium균의 계통분류 연구에는 2개 이상의 유전자를 사용하는 multilocus sequence typing (MLST) 분석이 필요할 것으로 생각된다. 여기서 분석된 F.
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