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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 명태 성장단계별 사육수의 세균 분포, 병원체 조사 및 비정상개체 발생에 대한 원인 분석을 수행 하였으며, 이를 토대로 명태 양식의 질병 관리를 위한 기초 자료를 얻고자 하였다.
- 본 연구에서는 명태 양식 기술 개발 과정 중 수산생물 병원체의 영향을 알아보고자 사육수 내 총 세균수 변화, 분포와 명태에 대한 영향을 분석하였으며, 성장 단계별 명태의 병원체(세균, 기생충 및 바이러스) 조사 및 비정상 개체 발생에 대한 원인 구명을 수행하였다. 자어 단계에서 사육수의 평균 세균수는 2.
제안 방법
- PCR 후 증폭된 산물은 1X TAE electrophoresis buffer(40 mM Tris, 20 mM acetate, 2 mM EDTA)에 용해시킨 1% agarose gel 상에서 100 V로 전기영동하고 Gel documentation system (Alpha Innotech)을 이용하여 자외선 램프하에서 band를 관찰하여 16S rRNA 유전자 증폭 여부를 확인하였다. 각 증폭된 산물은 ExoSap-IT for PCR product clean-up kit(Affymetrix)를 사용하여 정제하였으며, ABI 3730 XL DNA analyzer (Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- (2016a) 방법에 따라 One-step multiplex RT-PCR법을 추가적으로 수행하였다. PCR 후 증폭된 산물은 상기의 방법에 따라 전기영동을 수행하고 자외선 램프 하에서 band를 관찰하여 바이러스 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
- Patho Gene-spin DNA/RNA Extraction kit (Intronbio)를 이용하여 제조사의 방법에 따라서 핵산을 추출하고 최종적으로 40 μL의 TE buffer로 현탁하였다.
- VHSV와 MBV의 진단을 위해서 Iscript cDNA synthesis kit (Bio-rad)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하여 PCR의 주형 (template)으로 사용하였다. 각 바이러스별 primer mix 2 μL, Nuclease-free water 17 μL, 핵산 1 μL를 PCR premix (Enzynomics)에 혼합한 뒤 PCR 기기 (DNA engine dyad, Bio-rad)를 이용하여 Table 1의 조건에 따라 유전자 증폭을 수행하였다.
- 각 바이러스별 primer mix 2 μL, Nuclease-free water 17 μL, 핵산 1 μL를 PCR premix (Enzynomics)에 혼합한 뒤 PCR 기기 (DNA engine dyad, Bio-rad)를 이용하여 Table 1의 조건에 따라 유전자 증폭을 수행하였다.
- 각 세균 집락을 멸균 생리식염수 (PBS) 200 μL에 현탁 후 Patho Gene-spin DNA/RNA Extraction kit (Intronbio)를 이용하여 제조사의 방법에 따라서 핵산을 추출하였다.
- PCR 후 증폭된 산물은 1X TAE electrophoresis buffer(40 mM Tris, 20 mM acetate, 2 mM EDTA)에 용해시킨 1% agarose gel 상에서 100 V로 전기영동하고 Gel documentation system (Alpha Innotech)을 이용하여 자외선 램프하에서 band를 관찰하여 16S rRNA 유전자 증폭 여부를 확인하였다. 각 증폭된 산물은 ExoSap-IT for PCR product clean-up kit(Affymetrix)를 사용하여 정제하였으며, ABI 3730 XL DNA analyzer (Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기 서열과 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 유전자은행 (GenBank)에 등록된 세균 염기서열의 유전적 상동성을 비교하여 최종적으로 세균을 동정하였으며, 이를 토대로 사육수의 세균 분포율을 산출하였다.
- 아가미의 경우 Decalcifying Solution-Lite (Sigma)로 2차 고정 및 탈회하였다. 고정된 조직 시료를 24시간 동안 흐르는 물에 수세를 실시하고 조직처리기 (Leica)를 사용하여 70, 80, 90, 95, 100% 알콜로 단계적으로 탈수시킨 후 자일렌 (xylene)을 처리하여 투명화시키고 파라핀 용액을 조직에 침투시켰다. 투명화된 시료는 60℃의 파라핀 용액에 넣어 포매한 후 마이크로톰 (Leica)을 이용하여 4~5 μm 두께로 박편을 제작하였다.
- 명태 양식 과정에서 수산생물 병원체의 감염 동태를 파악하고자 각 성장 단계별 (egg, yolk-sac larvae, larvae, earlyjuvenile, late-juvenile 그리고 adult)로 월 1~2회 주기로 3~10 마리를 시료로 채취하였다. 그리고 사육수의 총 세균수 변화 및 폐사 연관성을 알아보고자 월 2~4회 주기로 사육수를 10 mL 채수하여 실험에 사용하였다.
- 명태 사육 과정 중 체색 흑화, 안구돌출 등의 증상을 보이는 비정상 개체 및 폐사 개체에 대한 원인을 파악하고자 병리 조직 분석을 실시하였다. 주요 장기 (뇌, 간, 비장, 신장)를 10% 중성 포르말린 용액에 1 : 10 비율로 24시간 1차 고정하였다.
- 명태 양식 과정에서 수산생물 병원체의 감염 동태를 파악하고자 각 성장 단계별 (egg, yolk-sac larvae, larvae, earlyjuvenile, late-juvenile 그리고 adult)로 월 1~2회 주기로 3~10 마리를 시료로 채취하였다. 그리고 사육수의 총 세균수 변화 및 폐사 연관성을 알아보고자 월 2~4회 주기로 사육수를 10 mL 채수하여 실험에 사용하였다.
- 원액 및 희석된 사육수 200 μL를 1% NaCl이 첨가된 TSA (Tryptic Soy Agar, BD) 배지 (이하 STSA)에 도말한 뒤 15℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 세균 집락 (colony)을 계수하여 총 세균수를 산출하였다.
- 자어 (전장 3 cm 이하)의 경우 시료 전체를 생리식염수로 3회 세척한 후, 멸균된 조직마쇄 튜브 (2 & 5 mm sterilized bead, Watson)에 넣고 2,000 rpm 20초간 마쇄한 후 세균 배양에 사용하였다. 배양된 세균 집락은 STSA, TCBS 배지에서 순수분리 배양한 후 API 20E 및 20NE kit (Biomerieux)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실험을 실시하였다. 세균 정밀 동정을 위해서 상기 방법에 따라 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하였다.
- Patho Gene-spin DNA/RNA Extraction kit (Intronbio)를 이용하여 제조사의 방법에 따라서 핵산을 추출하고 최종적으로 40 μL의 TE buffer로 현탁하였다. 분리된 핵산은 분광광도계 NanoVue (GE Healthcare) 기기를 사용하여 DNA와 RNA의 양과 A260/280 nm 값을 측정하였으며 실험 전까지 - 20℃에 보관하였다.
- 각 증폭된 산물은 ExoSap-IT for PCR product clean-up kit(Affymetrix)를 사용하여 정제하였으며, ABI 3730 XL DNA analyzer (Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기 서열과 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 유전자은행 (GenBank)에 등록된 세균 염기서열의 유전적 상동성을 비교하여 최종적으로 세균을 동정하였으며, 이를 토대로 사육수의 세균 분포율을 산출하였다.
- 세균 16S rRNA 유전자 증폭은 16S universal primer (27F, 1492R)를 사용하였으며, primer mix 2 μL, Nuclease-free water 17 μL, 핵산 1 μL를 PCR premix (Enzynomics)에 혼합하여 PCR 기기 (DNA engine dyad, Bio-rad)에서 수행하였다.
- 세균 종 동정 및 분포율 분석을 위해서 배양된 세균 집락을 멸균 루프 (loop)를 사용하여 무작위로 50개씩 취해 1% NaCl이 첨가된 TSA와 TCBS (Thiosulfate citrate bile sucrose) 배지에서 순수 분리하였다. 순수 분리된 세균 집락은 형태적 특성 (색상, 배양 형태)에 따라 1차 분류하였으며, 정밀 동정을 위해서 세균 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다 (Table 1).
- 자어 (전장 3 cm 이하)의 경우 시료 전체를 슬라이드 글라스에 고정하여 광학 현미경으로 기생충 감염 여부를 조사하였다. 세균성 질병 조사를 위해서 주요 내부 장기 (간, 비장, 신장)와 병변 부위 (안구, 지느러미 등)를 무균적으로 채취하여 STSA 및 TCBS 배지에 15℃에서 24시간 배양하였다. 자어 (전장 3 cm 이하)의 경우 시료 전체를 생리식염수로 3회 세척한 후, 멸균된 조직마쇄 튜브 (2 & 5 mm sterilized bead, Watson)에 넣고 2,000 rpm 20초간 마쇄한 후 세균 배양에 사용하였다.
- 세균 종 동정 및 분포율 분석을 위해서 배양된 세균 집락을 멸균 루프 (loop)를 사용하여 무작위로 50개씩 취해 1% NaCl이 첨가된 TSA와 TCBS (Thiosulfate citrate bile sucrose) 배지에서 순수 분리하였다. 순수 분리된 세균 집락은 형태적 특성 (색상, 배양 형태)에 따라 1차 분류하였으며, 정밀 동정을 위해서 세균 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다 (Table 1). 각 세균 집락을 멸균 생리식염수 (PBS) 200 μL에 현탁 후 Patho Gene-spin DNA/RNA Extraction kit (Intronbio)를 이용하여 제조사의 방법에 따라서 핵산을 추출하였다.
- 명태 사육 과정 중 체색 흑화, 안구돌출 등의 증상을 보이는 비정상 개체 및 폐사 개체에 대한 원인을 파악하고자 병리 조직 분석을 실시하였다. 주요 장기 (뇌, 간, 비장, 신장)를 10% 중성 포르말린 용액에 1 : 10 비율로 24시간 1차 고정하였다. 각 장기를 3~4 cm 크기로 세절한 후 카세트에 넣고 10% 중성 포르말린으로 2차 고정하였다.
- 채취된 시료에 대한 내·외부 임상증상을 확인하였으며 체표 점액 및 아가미 등을 슬라이드 글라스에 고정한 후 광학 현미경으로 기생충 감염 유무를 조사하였다.
- 총 세균수 측정을 위해 채수된 시료를 6 well plate (SPL)에서 멸균 생리식염수 (PBS; phosphate buffered saline, Bioneer) 로 1/10, 1/100, 1/1000 단계로 희석하였다. 원액 및 희석된 사육수 200 μL를 1% NaCl이 첨가된 TSA (Tryptic Soy Agar, BD) 배지 (이하 STSA)에 도말한 뒤 15℃에서 24시간 배양하였다.
- 파라핀 절편은 hematoxylineeosin (H&E) 염색 후 광학현미경 (Oylmpus)으로 조직 병변을 관찰하였다.
- 해산어류에 감염을 일으킬 수 있는 바이러스 중 15℃ 이하에서도 증식이 가능한 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (VHSV, viral hemorrhagic septicemia virus), 해산버나바이러스 (MBV; marine birnavirus), 신경괴사바이러스 (NNV, nervous necrosis virus)에 대한 감염 여부를 조사하였다. 주요 장기 (간, 비장, 신장)를 멸균된 조직마쇄 튜브 (2 & 5mm sterilized bead, Watson)에 넣고 2,000 rpm 20초간 마쇄한 후 마쇄액 150 μL 를 핵산 추출에 사용하였다.
이론/모형
- 각 바이러스별 primer mix 2 μL, Nuclease-free water 17 μL, 핵산 1 μL를 PCR premix (Enzynomics)에 혼합한 뒤 PCR 기기 (DNA engine dyad, Bio-rad)를 이용하여 Table 1의 조건에 따라 유전자 증폭을 수행하였다. 또한, 국내 상존 VHSV와 NNV 유전형 (genotype)에 대한 검출 민감도가 높은 Kim et al. (2016a) 방법에 따라 One-step multiplex RT-PCR법을 추가적으로 수행하였다. PCR 후 증폭된 산물은 상기의 방법에 따라 전기영동을 수행하고 자외선 램프 하에서 band를 관찰하여 바이러스 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
- 배양된 세균 집락은 STSA, TCBS 배지에서 순수분리 배양한 후 API 20E 및 20NE kit (Biomerieux)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실험을 실시하였다. 세균 정밀 동정을 위해서 상기 방법에 따라 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하였다.
성능/효과
- , Shewanella sp.로 4종류의 세균이 검출되었고 슈도모나스 균이 52%로 분포하였다. 성장 단계별로 공급한 먹이는 자어 및 자치어 단계에서는 로티퍼, 알테미아, 코페포다였고, 치어 및 미성어 단계에서는 코페포다, 냉동곤쟁이였으며, 성어 단계에서는 냉동굴, 갯지렁이 등이었다.
- 그리고 Shewanella sp.로 총 7종류의 세균이 검출되었으며, 비브리오균의 분포가 52%로 가장 높게 나타났다 (Table 2). 치어 및 미성어 단계에서는 Pseudomonas azotoformans 또는 P.
- 명태 성장 단계별로 VHSV, NNV 그리고 MBV에 대한 유전자 진단 결과, 모든 개체에서 바이러스는 검출되지 않았다 (Table 3).
- 명태 성장단계별로 사육수의 총 세균수를 조사한 결과, 8.0×10~6.2×104 cfu/mL로 나타났으며, 자어(Larvae; 부화 6일~60일령, 0.5~1.9 cm)의 사육수에서는 7.0×10~7.9×103 cfu/mL(평균 2.1 × 103 cfu/mL), 치어 및 미성어 (Juvenile; 부화 60일~ 17개월령, 2.1~28.1 cm)에서는 8.0 × 10~2.4 × 104 cfu/mL (평균 3.4 × 103 cfu/mL), 성어(Adult; 18개월 이상, 29.9~36.8 cm)에서는 9.5 × 10~7.5 × 102 cfu/mL (평균 3.2 × 102 cfu/mL) 수준으로 나타났다(Fig. 1).
- 9 × 103 cfu/mL 104 cfu/mL로 명태 사육수의 총 세균수와 유사한 수준으로 나타나고 있다. 본 연구과정 중 명태 사육 수온은 자치어 단계에서 6~7℃, 치어~성어 단계에서 8~10℃로 일정하게 유지되었으나, 성장단계별 수온 차이에 의한 유의적인 사육수의 총 세균수 변화는 관찰되지 않았다. 사육수 분포 세균 중 병원성 세균으로 알려진 Vibrio anguillarum의 경우, 저온 사육환경 (10℃ 내외)에서 세균수가 106 cfu/mL 이상일 때 대구 자어의 폐사를 유발했다고 보고된 바가 있다 (Reid et al.
- 본 연구에서 명태 자어 사육수의 전체 비브리오균 (Vibrio spp.)은 101 ~ 102 cfu/mL (평균 1.9 × 102 cfu/mL) 수준으로 나타났으며 (data not shown), 분리 세균은 5℃ 조건에서는 증식되지 않았다.
- 치어 및 미성어 (전장 15~30 cm) 중 일부 (전체 사육 개체 중 5% 미만) 개체에서 체색 흑화, 안구 돌출, 턱 주변 출혈 등의 증상을 보이는 비정상 개체가 발생하였다. 안구 내 기포 형성으로 인한 돌출을 보이는 개체들의 아가미에서 전형적인 공기 색전증 (gas embolism) 증상인 기포가 다수 관찰되었으며 각막의 상피조직에서 기포, 실질조직 손상 및 세균 침입 흔적을 확인할 수 있었다 (Fig. 3, Table 4). 또한, 안구 돌출과 턱 주변 조직 출혈을 보이는 개체에서 시신경이 밀집되어 있는 맥락막 주변 조직의 괴사가 관찰되었다.
- 비정상 개체의 내부 장기 (간, 비장, 신장, 심장)에서는 병변 부위가 관찰되지 않았다. 안구 조직 (각막, 망막, 맥락막) 병변과 사육수 세균과의 상관관계를 분석한 결과, 병변 부위 (안구, 턱 주변)에서 검출된 세균 (P. fluorescens, Vibrio sp., V. pelagius, Planococcus maritumus 그리고 Pseudoalteromonas sp.)이 사육수 내에도 동일하게 분포하였다. 이러한 결과는 사육과정 중 물리적 충격 (수조 충돌 등)으로 인한 외상 발생 및 생리적 스트레스로 인한 1차적 요인과 사육수 내 세균이 상처 부위에 2차 국소 감염 (local infection)을 일으켜 비정상 개체가 발생된 것으로 생각된다.
- 외관상 건강한 개체에서는 대량 폐사를 일으킬 수 있는 세균, 바이러스가 검출되지 않았으나, 일부 안구돌출, 턱 주변 조직 출혈을 보이는 비정상 개체에서 아가미 새변의 기포 형성, 각막 조직 및 맥락막 주변 조직 괴사가 관찰되었다. 특히, 병변 부위에서 검출된 세균(P. fluorescens, Vibrio sp., V. pelagius, Planococcus maritumus 그리고 Pseudoalteromonas sp.)이 사육수에도 동일하게 분포하였으며, 사육 과정 중 외상 발생 이후 2차 세균 감염이 발생할 수 있음을 시사한다. 명태의 안정적인 양식 산업화를 위한 요소로 기초 질병 데이터 구축과 더불어 지속적인 질병관리가 필요하다.
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