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문제 정의
- 상기한 연구를 바탕으로 본 저자들은 黃芩 메탄올 추출물이 CD가 유발된 생쥐의 피부 표면 증상을 개선해 줄 수 있을 것이라는 가설을 세우고 본 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)를 이용하여 생쥐에 CD를 유발한 다음, 黃芩 메탄올 추출물을 도포하고 피부 두께 및 피부 표면 증상 그리고 멜라닌 지수와 홍반 지수에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 천연물을 이용하여 스테로이드를 줄이거나 대체하는 연구는 천연물 연구의 큰 축으로 자리하고 있으며, 세계적인 추세이기도 하다. 본 연구에서는 이러한 세계적 추세에 발맞추어 대표적인 淸熱藥인 黃芩이 CD의 피부증상에 어떤 영향을 미치는지 살펴보았다.
가설 설정
- 상기한 연구를 바탕으로 본 저자들은 黃芩 메탄올 추출물이 CD가 유발된 생쥐의 피부 표면 증상을 개선해 줄 수 있을 것이라는 가설을 세우고 본 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)를 이용하여 생쥐에 CD를 유발한 다음, 黃芩 메탄올 추출물을 도포하고 피부 두께 및 피부 표면 증상 그리고 멜라닌 지수와 홍반 지수에 미치는 영향을 살펴보았다.
제안 방법
- DNFB를 이용한 피부염 유발방법은 본 연구진이 이미 제시한 방법을 차용하여 실시되었다9). 과정을 간략히 요약하면 다음과 같다.
- 대표적인 淸熱藥으로 피부의 風熱질환에 다용하며, 피부에서 항염증 효과와 항산화 효과가 잘 알려진 黃芩에 대하여 접촉피부염의 피부 표면 증상 및 피부 색조에 미치는 영향을 관찰하였다. 본 연구에서는 생쥐에 DNFB를 이용하여 접촉피부염을 유발하고 黃芩 메탄올 추출물을 피부 도포한 후 피부 두께, 전반적 표면 증상의 정도 및 면적과 피부 상태, 홍반 지수와 멜라닌 지수에 미치는 영향을 살펴본 결과 黃芩 추출물은 반복적인 DNFB 피부 처리에 의하여 발생하는 피부 두께 증가를 유의한 수준으로 감소시켰고, 피부 표면 증상의 면적과 삼출물, 각질, 점상 출혈 등을 감소시키는 경향을 보였으며, 홍반 지수를 유의한 수준으로 감소시켰다.
- 정상군 (Normal, NOR)은 DNFB를 첨가하지 않은 vehicle(AOO)만을 처리하였고, CD 대조군 (Control, CTL)은 DNFB를 이용하여 CD를 유발한 다음 vehicle (AOO+EtOH)을 처리하였으며, 저농도군 (LOW)은 CD를 유발한 다음, 1 mg/ml 농도의 SBE 50㎕를 7일간 도포하였으며, 고농도군 (HIG)은 CD를 유발한 다음,10 mg/ml 농도의 SBE 50 ㎕를 7일간 도포하였다. 마지막으로 덱사메타손군 (DEX)은 CD를 유발한 다음, 2.5 mg/ml 농도의 dexamethasone 50 ㎕를 7일간 도포하였다. 자세한 실험 스케줄은 Fig.
- 과정을 간략히 요약하면 다음과 같다. 먼저 DNFB를 아세톤 (acetone)과 올리브 오일 (olive oil)이 4:1로 혼합된 vehicle (AOO)에 0.1%로 희석하여 생쥐의 양측 귀의 후면에 3일간 감작 (sensitazation)하였으며, 4일 뒤 0.2% DNFB용액을 제모된 생쥐의 등에 2일 간격으로 4회 처리하여 피부염 증상을 유발 (Challenge)하였다. 피부 도포를 위하여 SBE와 dexamethasone (DEX)은 에탄올 (EtOH)에 녹여진 다음 AOO에 1:4 비율로 희석 되었다.
- 실험 마지막 날 (day 15) 전자저울 (Hansung, 한국)을 이용하여 체중을 측정하였으며, 비장의 무게는 실험 마지막 날 생쥐를 희생시킨 다음 비장을 적출하여 미량 저울 (Sartorius, 한국)로 무게를 측정하였고, 결과는 실험 마지막 날 체중에 대한 비율 (%)로 나타내었다.
- 실험 마지막 날 (day 15), 생쥐를 희생시킨 후, digital camera (Canon, 일본)과 피부분석 시스템 (NBT, 한국)을 이용하여 생쥐의 등에 유발된 피부 표면 증상을 관찰하였다.
- 실험 마지막 날, 생쥐의 체중을 측정한 후, 생쥐를 희생시키고 비장을 절제하여 무게를 측정하였다. 비장의 무게는 체중 변화와 관련이 있으므로 실험 마지막 날 측정된 체중에 대한 비율로 환산하여 관찰한 결과 대조군에서 정상군과 비교해 유의한 수준으로 비장/체중비가 증가하였으며, SBE는 이러한 비장/체중비에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig.
- 정상군 (Normal, NOR)은 DNFB를 첨가하지 않은 vehicle(AOO)만을 처리하였고, CD 대조군 (Control, CTL)은 DNFB를 이용하여 CD를 유발한 다음 vehicle (AOO+EtOH)을 처리하였으며, 저농도군 (LOW)은 CD를 유발한 다음, 1 mg/ml 농도의 SBE 50㎕를 7일간 도포하였으며, 고농도군 (HIG)은 CD를 유발한 다음,10 mg/ml 농도의 SBE 50 ㎕를 7일간 도포하였다. 마지막으로 덱사메타손군 (DEX)은 CD를 유발한 다음, 2.
- 피부 표면 증상 관찰이 끝난 후, 피부 색차계 (Cortex Technology, Denmark)를 이용하여 홍반 지수와 멜라닌 지수를 측정하였다. 정확한 홍반 지수와 멜라닌 지수의 측정을 위하여 생쥐의 등 표면에서 서로 다른 3개 부위를 측정한 후 그 평균값을 해당 개체의 값으로 사용하였다.
- 黃芩의 추출은 메탄올을 이용하였으며, 이전 연구를 통하여 제시된 방법을 준용하였다9). 추출 과정을 간략히 요약하면, 黃芩 50 g을 99.9% 메탄올 500 ml에 침지하고 15분간 초음파 (화신기계, 한국)로 진탕해준 다음, 24시간 동안 추출하였다. 24시간이지난 후, 메탄올을 수거하고, 다시 500 ml의 메탄올을 이용하여 재차 추출하였다.
- 피부 표면 증상 관찰 및 홍반 지수와 멜라닌 지수의 측정이 끝난 후 등 피부 조직을 절제한 다음, vernier calipers(Mitutoyo, Japan)를 이용하여 두께를 측정하였다.
- 피부 표면 증상 관찰이 끝난 후, 피부 색차계 (Cortex Technology, Denmark)를 이용하여 홍반 지수와 멜라닌 지수를 측정하였다. 정확한 홍반 지수와 멜라닌 지수의 측정을 위하여 생쥐의 등 표면에서 서로 다른 3개 부위를 측정한 후 그 평균값을 해당 개체의 값으로 사용하였다.
대상 데이터
- CD 유발을 위한 1-Fluoro-2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 귀 부종 측정을 위하여 vernier calipers (Mitutoyo, Carros, Japan)를 사용하였고, 피부 표면 관찰을 위하여 digital camera (Canon, Japan)와 피부분석 system (NBT, 한국)을 사용하였으며, 홍반 지수와 멜라닌 지수 측정을 위하여 피부색차계(Cortex Technology, Denmark)를 사용하였다.
- 黃芩은 화림제약 (부산, 한국)을 통해 구입한 후, 정선하여 사용하였다. 黃芩의 추출은 메탄올을 이용하였으며, 이전 연구를 통하여 제시된 방법을 준용하였다9).
- 실험동물은 18～20 g의 Balb/c계 수컷 생쥐를 샘타코 (경기, 한국)로부터 구입하였으며 1주일 이상, 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험실 환경은 온도 22±2℃를 유지하면서 12시간 단위로 낮과 밤이 계속되는 상황을 실험 종료 시까지 유지하였다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot(Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.)를 이용하였다. 실험성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.
- 실험성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 黃芩의 작용이 corticosteroid인 dexamethasone과는 다름을 시사한다. DEX군을 살펴보면 유의한 체중 감소와 비장/체중비의 감소가 관찰되며, 비장/체중비의 경우 정상군과 비교하여도 유의하게 감소하였다(Fig. 6). 이러한 결과는 dexamethasone은 splenocyte의 apoptosis를 유발함으로써 비장의 위축을 일으킨다는 사실을 감안할 때17), 대표적인 부작용인 전반적 면역 감소의 증거로 해석될 수 있으며, SBE의 경우 이러한 전반적 면역감소의 기능과는 다른 기전을 가지는 것으로 판단되며, 천연물을 이용한 다른 논문에서도 이러한 경향이 발견된다18,19).
- Dexamethasone의 투여는 CD 유발에 의하여 발생하는 피부 두께의 증가를 정상군 수준으로 억제하였으며(Fig. 2), 삼출물과 각질, 점상출혈과 같은 피부 표면 증상을 효과적으로 개선하였다(Fig. 3). 그러나, 홍반지수에는 특별한 영향을 미치지 못하였는데, 이는 피부의 두께를 얇게 만듦으로써 피부 혈관 노출을 증가시킨데 기인하는 것으로 생각된다.
- 3A, B). SBE의 도포는 대조군에서 발견되는 삼출물과 각질, 색소침착 등을 감소시키는 경향과 함께 병변 부위의 넓이를 감소시키는 경향을 보였으며, 고농도 투여군 (HIG)에서 더 효과가 좋아지는 경향을 보였다(Fig. 3C, D). 덱사메타손의 도포는 병변 부위와 삼출물 그리고 각질을 감소시키는 경향을 보였으나, 색소 침착에는 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig.
- 일반적으로 점상 출혈은 중등도 이상의 피부염에서 발견되며, 인간에서는 가려움증에 대한 대처가 잘못되는 경우에도 발생한다. SBE의 투여는 점상출혈을 감소시키는 경향을 보였으며(Fig. 4), 이러한 결과는 黃芩이 CD 피부 병변의 정도를 감소시키는 효과가 있는 것으로 해석된다. 황금과 관련한 선행 연구에서 정 등13)은 黃芩 추출물의 항염증 효과를 보고하였는데, 보고된 내용을 감안하면, 본 연구의 결과는 黃芩 추출물이 비만세포의 histamine 분비를 억제함으로써 실험동물에서 가려움증을 억제할 수 있고 그 결과 점상 출혈이 감소하게 되었을 가능성이 있음으로 해석된다.
- 6B). 그러나, 덱사메타손의 피부 도포는 체중과 비장/체중비 모두에서 대조군과 유의한 수준의 감소를 보였으며, 이러한 감소는 정상군과 비교하여도 통계적 유의성이 나타났다(Fig. 6A, B).
- 본 연구에서는 생쥐에 DNFB를 이용하여 접촉피부염을 유발하고 黃芩 메탄올 추출물을 피부 도포한 후 피부 두께, 전반적 표면 증상의 정도 및 면적과 피부 상태, 홍반 지수와 멜라닌 지수에 미치는 영향을 살펴본 결과 黃芩 추출물은 반복적인 DNFB 피부 처리에 의하여 발생하는 피부 두께 증가를 유의한 수준으로 감소시켰고, 피부 표면 증상의 면적과 삼출물, 각질, 점상 출혈 등을 감소시키는 경향을 보였으며, 홍반 지수를 유의한 수준으로 감소시켰다. 또한, 체중과 비장/체중비를 관찰한 결과 dexamethasone과는 다르게 실험동물의 체중과 비장/체중비에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
- 일반적으로 급성기 때에는 소양성 소포 (pruritic vesicle)와 홍반 (erythema)가 위주가 되며, 만성기로 갈수록 피부 두께가 증가하고 색소침착과 태선화 (lichenification)가 진행되게 된다9). 본 연구에서 사용한 DNFB 동물 모델은 피부 표면에 홍반과 삼출물, 각질 등을 유발함과 동시에 피부 두께가 두꺼워지고 색소침착도 일어나는 것으로 보았을 때 인간 CD의 아급성기에 해당하는 것으로 사료된다.
- 대표적인 淸熱藥으로 피부의 風熱질환에 다용하며, 피부에서 항염증 효과와 항산화 효과가 잘 알려진 黃芩에 대하여 접촉피부염의 피부 표면 증상 및 피부 색조에 미치는 영향을 관찰하였다. 본 연구에서는 생쥐에 DNFB를 이용하여 접촉피부염을 유발하고 黃芩 메탄올 추출물을 피부 도포한 후 피부 두께, 전반적 표면 증상의 정도 및 면적과 피부 상태, 홍반 지수와 멜라닌 지수에 미치는 영향을 살펴본 결과 黃芩 추출물은 반복적인 DNFB 피부 처리에 의하여 발생하는 피부 두께 증가를 유의한 수준으로 감소시켰고, 피부 표면 증상의 면적과 삼출물, 각질, 점상 출혈 등을 감소시키는 경향을 보였으며, 홍반 지수를 유의한 수준으로 감소시켰다. 또한, 체중과 비장/체중비를 관찰한 결과 dexamethasone과는 다르게 실험동물의 체중과 비장/체중비에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
- 본 연구의 결과에서 SBE의 피부 도포는 반복적인 DNFB 처리에 의하여 증가되는 피부 두께를 유의한 수준으로 감소시켰다(Fig. 2). 이러한 결과는 DNCB를 이용한 CD 모델에서 보고된 黃芩 추출물의 효과4,5,8)와 일치하며, 黃芩이 피부 조직 내에서 항염증 효과가 있음을 시사한다.
- . 본 연구의 결과에서 반복적인 DNFB 피부 처리는 유의한 수준의 비장/체중비 상승을 유도했으며, SBE는 체중 및 비장/체중비에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig. 6). 이러한 결과는 黃芩의 작용이 corticosteroid인 dexamethasone과는 다름을 시사한다.
- 실험 마지막 날, 생쥐의 체중을 측정한 후, 생쥐를 희생시키고 비장을 절제하여 무게를 측정하였다. 비장의 무게는 체중 변화와 관련이 있으므로 실험 마지막 날 측정된 체중에 대한 비율로 환산하여 관찰한 결과 대조군에서 정상군과 비교해 유의한 수준으로 비장/체중비가 증가하였으며, SBE는 이러한 비장/체중비에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig. 6B). 그러나, 덱사메타손의 피부 도포는 체중과 비장/체중비 모두에서 대조군과 유의한 수준의 감소를 보였으며, 이러한 감소는 정상군과 비교하여도 통계적 유의성이 나타났다(Fig.
- 실험 마지막 날, 생쥐를 희생하고 피부의 두께를 측정한 결과대조군 (CTL)에서 정상군 (NOR)에 비하여 유의한 수준의 피부 두께 증가가 관찰되었으며, 10 mg/ml 농도의 SBE 피부 도포군(HIG)에서는 대조군과 비교하여 유의한 수준의 피부 감소가 관찰되었으며, 덱사메타손군 (DEX)의 경우 정상군 수준으로 피부 두께가 감소하였다(Fig. 2).
- 24시간이지난 후, 메탄올을 수거하고, 다시 500 ml의 메탄올을 이용하여 재차 추출하였다. 얻어진 추출액은 감압 농축기 (Eyela, Japan)와 동결건조기 (Labconco, USA)를 이용하여 농축, 동결건조 되었으며, 최종 산물 (Scutellaria baicalensis Extract, SBE)은 4.52 g으로 수율은 9.04%였다.
- 3). 이러한 결과는 SBE가 CD의 표면증상을 호전시킬 수 있음을 시사하며, 이전 연구들의 내용을 종합하여 보면, 피부 내에서 염증성 cytokine의 분비를 억제하고, 면역세포의 침윤을 억제함으로써 항염증 작용을 일으키고4,5,8) 그 결과로 피부 표면 증상의 호전을 가져왔다는 사실을 유추할 수 있다.
- . 이러한 표면증상들에 SBE가 어떤 영향을 미치는지 살펴본 결과, 병변 부위의 면적을 줄여주었으며, 삼출물이나 각질이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 3). 이러한 결과는 SBE가 CD의 표면증상을 호전시킬 수 있음을 시사하며, 이전 연구들의 내용을 종합하여 보면, 피부 내에서 염증성 cytokine의 분비를 억제하고, 면역세포의 침윤을 억제함으로써 항염증 작용을 일으키고4,5,8) 그 결과로 피부 표면 증상의 호전을 가져왔다는 사실을 유추할 수 있다.
- 이상의 결과들을 종합하여보면, 黃芩 추출물은 피부 내에서 항염증 작용의 지표 중에 하나인 피부 두께의 증가를 억제함과 동시에 홍반, 삼출물, 각질, 점상 출혈과 같은 CD의 피부 표면 증상들을 호전시켰으며, corticosteroid인 dexamethasone의 대표적 부작용에 해당하는 피부 위축이나 전반적 면역감소 등의 현상은 나타나지 않았다.
- . 이에 본 연구진은 SBE가 멜라닌 지수를 감소시킬 수 있을 것으로 가설을 세우고 실험을 진행하였으나, 본 연구의 결과를 살펴보면, SBE는 멜라닌 지수에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig. 5B). 이러한 결과는 본 연구진이 사용한 DNFB 동물 모델이 아급성 모델임에 기인하는 것이라 생각된다.
- 피부 분석시스템을 이용하여 피부 표면을 세밀히 분석한 결과대조군에서 혈관확장과 같은 요인에 기인하는 홍반뿐만 아니라 점상 출혈이 발견되었다(Fig. 4B). 일반적으로 점상 출혈은 중등도 이상의 피부염에서 발견되며, 인간에서는 가려움증에 대한 대처가 잘못되는 경우에도 발생한다.
- 피부 색차계를 이용하여 피부 표면 증상에 대한 주관적 평가 결과를 객관화해본 결과 고농도 SBE 투여군에서 유의한 수준의 홍반 지수의 감소가 관찰되었다(Fig. 5A). 이러한 결과는 앞에서 제시된 이전 연구결과들과 일맥상통하며 黃芩 추출물이 피부 표면 증상을 개선할 수 있음을 시사한다.
- 피부 색차계를 이용하여 홍반 지수와 멜라닌 지수에 미치는 영향을 관찰한 결과 대조군에서 유의한 수준의 홍반 지수와 멜라닌 지수 상승이 관찰되었으며, 고농도의 SBE는 홍반 지수를 유의한 수준으로 감소시켰다. 덱사메타손은 홍반 지수와 멜라닌 지수에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig.
- 피부분석 시스템을 이용하여 병변 부위 피부의 상태를 관찰한 결과 대조군에서는 삼출물, 각질과 함께 홍반과 점상출혈(petechia)의 흔적이 관찰되었으며, 고농도 SBE 투여군에서는 대조군에서 보이는 삼출물, 각질 및 점상출혈의 흔적까지 감소하는 경향을 보였다. DEX군의 경우 점상출혈은 현저하게 감소하였으나 피부 색조의 개선효과는 미미하였다(Fig.
후속연구
- 이러한 결과는 黃芩이 접촉피부염의 표면 증상을 완화시킬 수 있음을 시사하며, 이전 연구들에서 밝힌 바와 같이 항피부염 소재로서 비교적 안전하게 인간의 접촉피부염에 사용될 수 있음을 시사한다.
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