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문제 정의
- faecalis가과거 감수성이었던 항생제에 대한 내성이 증가하는 것은 이 세균들이 치료나 예방의 목적으로 사용한 동물성 의약 품중 항생제에 노출되었을 가능성이 있음을 의미한다 4) . 따라서 본 연구에서는 서울시내 시판 식육 중 존재하는 E. faecalis의 항생제 내성, 항생제 내성 유전자 및 병독성 유전자의 분포를 분석하였다. 분리된 E.
- faecalis에서 항생제 내성에 관여하는 다중약물 유출 펌프 유전자와 병독인자(virulence factor)가 존재함을 확인하는 보고들이 있다 18,19) . 이러한 현상은 축산업 현장에서 동물성 의약품으로 사용되는 항생제를 사용한 결과로 해석되며 따라서 본 연구에서는 서울시내에서 시판되고 있는 식육(소고기, 돼지고기 및 닭고기)을 대상으로 E. faecalis을분리하고 이들의 주요 항생제에 대한 내성 패턴, 다중약물 유출 펌프 유전자와 병독성인자 유전자를 분석하였다.
제안 방법
- E. faecalis의 genomic DNA는 GeneAll Cell SV kit (진올바이오테크놀로지, 서울, 대한민국)을 이용하여 분리하였으며 균의 세포벽의 분해를 용이하게 하기 위하여 lysozyme (30 mg/mL, Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가하였다.
- PCR 반응으로 증폭한 DNA 절편이 해당 약물 유출 펌프 및 병독성 유전자인지 확인하기 위하여 DNA 염기서열을 확인하였다. PCR 반응 후 전기영동을 실시하여 해당 크기의 DNA 절편을 agarose gel에서 잘라낸 후 GeneAll PCR purificaiotn kit(진올바이오테그놀로지, 서울, 대한민국)을 이용해 agarose gel에서 DNA를 추출, 정제 후 Genotech(제노텍, 대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 결정 후 미국국립의학도서관(PubMed)에서 제공하는 염기 서열분석(Nucleotide Blast)을 사용하여 동질성을 확인하였다.
- PCR 반응으로 증폭한 DNA 절편이 해당 약물 유출 펌프 및 병독성 유전자인지 확인하기 위하여 DNA 염기서열을 확인하였다. PCR 반응 후 전기영동을 실시하여 해당 크기의 DNA 절편을 agarose gel에서 잘라낸 후 GeneAll PCR purificaiotn kit(진올바이오테그놀로지, 서울, 대한민국)을 이용해 agarose gel에서 DNA를 추출, 정제 후 Genotech(제노텍, 대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 결정 후 미국국립의학도서관(PubMed)에서 제공하는 염기 서열분석(Nucleotide Blast)을 사용하여 동질성을 확인하였다.
- 본 실험에 사용한 primer의 염기서열과 반응 조건을 Table 1에 나타내었다. PCR반응은 AccuPower TM premix (바이오니아, 대전, 대한민국)를 사용하여 95℃, 5분간 denaturation 후 95 ℃, 30초, Table 1에 표시된 annealing 조건에서 30초, 72℃, 1분간 extension반응을 30회 반복 후마지막 72 ℃, 7분간 elongation 하였다.
- . 본 실험에 사용한 동정용 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었으며 E. faecalis ddl primer에 반응한 균주만 선택하여 다음 실험을 진행하였다. 양성 대조균으로는 E.
- 본 실험에 사용한 항생물질은 최고 농도를 64 µg/mL로 하고 2배 계열 희석하여 최저 농도가 0.03 µg/mL 되도록 항생물질 희석 계열을 만들었다.
- 본 연구는 서울시내에서 시판중인 식육에서 E. faecalis를 분리하고 이 균들의 항생제 내성 패턴, 항생제 유출 펌프 유전자 및 병독성 유전자의 분포를 분석하였다. 총 277개의 식육시료에서 93균주의 E.
- 식육식료에서 분리한 93균주의 E. faecalis을 대상으로 ampicillin, chloramphenicol (Sigma Co. St. Louis, MO, USA), ciprofloxacin (Korea United Pharm Inc., Seoul, Korea), erythromycin (Sigma Co. St. Louis, MO, USA), levofloxacin (KukJe Pharm. Corp, Seongnam, Korea), quinupristindalfopristin (Handok, Seoul, Korea), tetracycline, teicoplanin 및 vancomycin (Sigma Co. St. Louis, MO, USA)에 대한 감수성 검사를 실시하였다. 감수성 검사는 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, Wayne, PA, USA)의 고체배지희석법으로 실시하였으며 21) , Muller-Hinton (Difco, Detroit, MI, USA) 배지를 사용하였고 정도관리를 위한 표준균으로는 E.
- 여기에 하룻밤 전 배양한 균액을 10 7 CFU/ mL되도록 희석한 후 5 µL씩 항생제 배지에 접종하여 배양하고 균주의 성장을 확인할 수 없는 가장 낮은 항생제의 농도를 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)로 결정하였다.
- 병독성 유전자 후보군으로는 gelE, ace, asa1, efaA 및 esp를 대상으로 하였다. 유전자의 검출은 gene specific PCR 반응을 실시하였으며 primer는 Genotech (제노텍, 대전, 대한민국)에서 제작하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 primer의 염기서열과 반응 조건을 Table 1에 나타내었다.
대상 데이터
- 2014년 5월부터 2015년 1월까지 시료의 다양성을 고려하여 서울시내 25개 행정자치구에 위치한 대형마트, 재래 시장 및 백화점 등에서 소고기 시료 142개, 돼지고기 시료 106개 및 닭고기 시료 29개 등 총 277개의 식육시료를 구입하여 실험에 사용하였으며 구입 후 즉시 냉장 운반하여 균 분리를 위한 실험을 수행하였다. 동일 상표 식육제품의 경우는 지리적으로 다른 곳이라도 중복 사용하지 않는 것을 원칙으로 하였다.
- AMP: ampicillin, CAM: chloramphenicolm, CIP: ciprofloxacin. EM: erythromycin, LEV: levofloxacin, QD: quinupristin-dalfopristin, TC: tetracycline, TEI: teicoplanin, VAN: vancomycin, MIC 50 and MIC 90 : the minimum concentrations of antibiotics required to inhibit 50% and 90% of the tested isolates.
- 다중약물 유출 펌프 유전자 후보군으로는 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa를 대상으로 하였다. 병독성 유전자 후보군으로는 gelE, ace, asa1, efaA 및 esp를 대상으로 하였다.
- 다중약물 유출 펌프 유전자 후보군으로는 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa를 대상으로 하였다. 병독성 유전자 후보군으로는 gelE, ace, asa1, efaA 및 esp를 대상으로 하였다. 유전자의 검출은 gene specific PCR 반응을 실시하였으며 primer는 Genotech (제노텍, 대전, 대한민국)에서 제작하여 사용하였다.
- faecalis ddl primer에 반응한 균주만 선택하여 다음 실험을 진행하였다. 양성 대조균으로는 E. faecalis ATCC29212 균주를 사용하였다.
이론/모형
- Louis, MO, USA)에 대한 감수성 검사를 실시하였다. 감수성 검사는 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, Wayne, PA, USA)의 고체배지희석법으로 실시하였으며 21) , Muller-Hinton (Difco, Detroit, MI, USA) 배지를 사용하였고 정도관리를 위한 표준균으로는 E. faecalis ATCC29212를 사용하였다. 본 실험에 사용한 항생물질은 최고 농도를 64 µg/mL로 하고 2배 계열 희석하여 최저 농도가 0.
- 순수 분리한 장알균 속 세균을 그람 염색, 생화학적 성상시험을 실시한 후 장알균 동정에 사용하는 ddl primer 를 사용하여 PCR 법으로 동정하였다 20) . 본 실험에 사용한 동정용 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었으며 E.
성능/효과
- faecium에서는 13%의 균에 본 유전자가 분포한다고 보고하고 있어 본 연구 결과와도 유사함을 알 수 있었다. E. faecalis 의 병독성인자 관련 유전자의 분포를 분석한 결과 젤라틴 분해효소 gelE 유전자는 64균주 (68.8%), 부착인자인 ace 유전자는 84균주(90.3%), 응집인자인 asa1 유전자는 44균주(47.3%), 심내막염 항원인자인 efaA 유전자는 85균주(91.4%) 및 장알균 표면 단백질인자인 esp 유전자는 12균주(12.9%)에 분포하였다. 최근 보고된 연구 결과에 따르면 임상분리 균주의 경우 96.
- 본 연구 결과 QD 에 대한 내성률이 높은 것도 lsa유전자 분포와 밀접한 연관이 있는 것으로 사료된다 28) . 가장 최근에 알려진 새로운 ABC 타입의 유출 펌프인 EfrAB 펌프 유전자인 efr(A)는 100%에 해당하는 93균주에서, efr(B)는 92균주에서(98.9%) 관찰되었다. E.
- 8% 에 분포하고 있었다(Table 3). 각 균주별로 병독성 유전자를 2개 이상 보유하는 비율을확인한 결과 1균주가 5개 유전자를 모두 보유하고 있었으며, 31균주가 4개 유전자, 39균주가 3개의 유전자, 19균주가 2개의 유전자를 가지고 있었으며, 1개의 유전자만을 가지고 있는 균주는 3균주에 불과 하였다(Table 4).
- 다중약물 유출펌프 유전자인 eme(A) 및 efr(A)는 총 93개의 E. faecalis균주 중 93 균주(100%)가 보유하고 있음을 알 수 있었으며 병독성 유전자의 경우 efaA 유전자는 전체균주의 91.4%, ace 유전자는 전체균주의 90.3%, gelE 유전자는 전제균주의 68.8% 에 분포하고 있었다(Table 3). 각 균주별로 병독성 유전자를 2개 이상 보유하는 비율을확인한 결과 1균주가 5개 유전자를 모두 보유하고 있었으며, 31균주가 4개 유전자, 39균주가 3개의 유전자, 19균주가 2개의 유전자를 가지고 있었으며, 1개의 유전자만을 가지고 있는 균주는 3균주에 불과 하였다(Table 4).
- 또한 대부분의 경우 병독성인자는 한 개 이상을 가지고 있는 것으로 보고되고 있는데 32) 본 연구에서도 5개 모두 보유한 균이 1균주, 4개 보유한 균이 31균주, 3개 보유한 균이 39 균주, 2개 보유한 균이 19균주로 확인되었다(Table 4). 따라서 우리나라 식육시료에서 분리한 E. faecalis에 존재하는 병독성인자 관련 유전자의 분포도는 기존 외국의 사례와 유사한 것으로 확인되었다. 본 연구는 우리나라의 시판 식육에서 분리한 장알균속 세균에서 다중약물 유출 펌프 유전자의 분포비율 및 병독성인자 유전자의 분포에 관한 첫 보고라 사료되며 추후에도 지속적인 모니터링이 필요한 것으로 사료된다.
- 4%의 균주에서 확인되었다. 병독성 인자인 gel(E)는 68.8%, ace는 90.3%, asa1는 47.3%, efaA는 91.4%, esp는 12.9%의 균주에서 확인되었다. 본 연구는 시판 식육에서 분리한 지표 미생물의 하나인 E.
- faecalis 균은 100%가 lsa유전자를 보유하고 있었으며 이 유전자는 특히 quinupristin/dalfopristine (QD) 에 대한 내성과 관계됨을 보고하였다. 본 연구 결과 QD 에 대한 내성률이 높은 것도 lsa유전자 분포와 밀접한 연관이 있는 것으로 사료된다 28) . 가장 최근에 알려진 새로운 ABC 타입의 유출 펌프인 EfrAB 펌프 유전자인 efr(A)는 100%에 해당하는 93균주에서, efr(B)는 92균주에서(98.
- faecalis의 항생제 내성, 항생제 내성 유전자 및 병독성 유전자의 분포를 분석하였다. 분리된 E. faecalis은 검사 항생제중 quinupristin-dalfoprisitn (76.3%) 및 tetracycline (45.2%)에 대한 내성 비율이 높게 나타났으며 이러한 결과는 다른 국내, 외 다른 연구 결과와도 유사한 경향을 보이고 있음을 알 수 있었다(Table 2) 22-25) . E.
- 식육시료에서 분리한 E. faecalis의 항생제 내성을 조사한 결과 ampicillin은 35.5%, chloramphenicol은 6.4%, ciprofloxacin은 4.3%, erythromycin은 18.3%, levofloxacin 은 0%, quinupristin-dalfospristin은 76.3%, tetracycline은 45.2%, teicoplanin은 0%, vancomycin은 0%의 내성 양상을 나타내었다(Table 2).
- 2%의 내성이었으며 levofloxacin, teiconplanin 및 vancomycin에는 모든 균이 감수성이었다. 약물 유출펌프인 MFS타입의 eme(A)와 ABC 타입의 efr(A)유전자는 모든 균주(100%)에서 확인되었으며 efr(B)는 98.9%, lsa는 91.4%의 균주에서 확인되었다. 병독성 인자인 gel(E)는 68.
- faecalis 를 분리하였다. 이 균주들의 항생제 내성비율은 ampicillin에는 35.5%, chloramphenicol에 6.4%, ciprofloxacin에 4.3%, eryhtromycin에 18.3%, quinupristin-dalfopristin에 76.3%, tetracycline에 45.2%의 내성이었으며 levofloxacin, teiconplanin 및 vancomycin에는 모든 균이 감수성이었다. 약물 유출펌프인 MFS타입의 eme(A)와 ABC 타입의 efr(A)유전자는 모든 균주(100%)에서 확인되었으며 efr(B)는 98.
- 총 277개의 식육 시료에서 93개의 E. faecalis을 분리하였다. 이중 48균주는 소고기, 6균주는 닭고기, 39균주는 돼지고기에서 분리되었다.
- faecalis를 분리하고 이 균들의 항생제 내성 패턴, 항생제 유출 펌프 유전자 및 병독성 유전자의 분포를 분석하였다. 총 277개의 식육시료에서 93균주의 E. faecalis 를 분리하였다. 이 균주들의 항생제 내성비율은 ampicillin에는 35.
후속연구
- 9%의 균주에서 확인되었다. 본 연구는 시판 식육에서 분리한 지표 미생물의 하나인 E. faecalis의 항생제 내성, 약물유출펌프 및 병독서 유전자의 분포를 분석한 연구로 지속적인 모니터링을 하여야 할 것으로 사료된다.
- faecalis에 존재하는 병독성인자 관련 유전자의 분포도는 기존 외국의 사례와 유사한 것으로 확인되었다. 본 연구는 우리나라의 시판 식육에서 분리한 장알균속 세균에서 다중약물 유출 펌프 유전자의 분포비율 및 병독성인자 유전자의 분포에 관한 첫 보고라 사료되며 추후에도 지속적인 모니터링이 필요한 것으로 사료된다.
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