넙치(Paralichthys olivaceus)의 immunoglobulin M에 대한 단클론 항체 생산 Production of Monoclonal Antibodies Against the Immunoglobulin M of Olive Flounder Paralichthys Olivaceus원문보기
Immunoglobulin M (IgM) was purified from olive flounder Paralichthys olivaceus sera using mannan-binding protein (MBP) and protein L affinity columns (designated as MBPIgM and ProLIgM, respectively). A monoclonal antibody (MAb) against olive flounder IgM was produced. The MBPIgM and ProLIgM had appa...
Immunoglobulin M (IgM) was purified from olive flounder Paralichthys olivaceus sera using mannan-binding protein (MBP) and protein L affinity columns (designated as MBPIgM and ProLIgM, respectively). A monoclonal antibody (MAb) against olive flounder IgM was produced. The MBPIgM and ProLIgM had apparent molecular weights of 77, 73, and 28 kDa in SDS-PAGE. Nine hybridomas secreting MAbs against olive flounder IgM were established: five MAbs for MBPIgM (1, 2, 3, 4, and 5) and four for ProLIgM (6, 7, 8, and 9). Western blotting indicated that seven MAbs recognized heavy (H; MAbs 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7) chains and one recognized light (L; MAb 9) chains of IgM, while MAb 8 did not recognize IgM. The results of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with bovine serum albumin (BSA, antigen) and the nine MAbs revealed that the optical density (OD) values of sera differed significantly between BSA- and non-immunized fish, despite some sera from non-immunized fish with slight high OD values. These results suggest that the MAbs produced in this study reacted specifically with the IgM from olive flounder.
Immunoglobulin M (IgM) was purified from olive flounder Paralichthys olivaceus sera using mannan-binding protein (MBP) and protein L affinity columns (designated as MBPIgM and ProLIgM, respectively). A monoclonal antibody (MAb) against olive flounder IgM was produced. The MBPIgM and ProLIgM had apparent molecular weights of 77, 73, and 28 kDa in SDS-PAGE. Nine hybridomas secreting MAbs against olive flounder IgM were established: five MAbs for MBPIgM (1, 2, 3, 4, and 5) and four for ProLIgM (6, 7, 8, and 9). Western blotting indicated that seven MAbs recognized heavy (H; MAbs 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7) chains and one recognized light (L; MAb 9) chains of IgM, while MAb 8 did not recognize IgM. The results of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with bovine serum albumin (BSA, antigen) and the nine MAbs revealed that the optical density (OD) values of sera differed significantly between BSA- and non-immunized fish, despite some sera from non-immunized fish with slight high OD values. These results suggest that the MAbs produced in this study reacted specifically with the IgM from olive flounder.
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문제 정의
어류는 사육 환경에 따라 면역 반응이 달라지므로 어류를 대상으로 한 항체 검출 ELISA를 실시하기 위해서는 사육 환경에 따른 특이 항체 반응에 대한 정보가 필요하며, 또한 실험을 실시하는데 있어서는 2차 항체로서 어류 IgM을 인식하는 항체가 필요하다. 본 연구에서는 넙치를 대상으로 항체 검출 ELISA를 실시하기 위한 기초 연구로서 넙치 IgM에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody, MAb)를 생산하고자 하였다. 넙치의 IgM은 mannan binding protein (MBP) affinity column과 protein L affinity column을 사용하여 정제한 후 항원으로 사용하였다.
제안 방법
1차 항체로는 넙치 혈청(BSA 면역 및 비면역 넙치로부터 분리한 혈청)을 5% skim milk로 희석(40배)하여 1시간 반응시킨 후 50µL씩 분주하였고, 2차 항체로는 본 연구에서 제작한 MAb를 50 µL씩 분주하였으며, 3차 항체는 peroxidase conjugated 항 마우스 IgG 염소 혈청을 50 µL씩 분주하였다.
1차 항체로는 본 연구에서 제작한 hybridoma의 배양액을 사용하여 50 µL씩 분주하였고, 2차 항체로서 5% skim milk로 1,000배 희석된 peroxidase conjugated 항 마우스 IgG 염소 혈청(Younginfrontier, Korea)을 50 µL씩 분주하 였다.
넙치 IgM에 대한 MAb를 생산하는 hybridoma의 선별과 제작된 MAb가 넙치 IgM을 인식하는지를 조사하기 위하여 ELISA 를 실시하였다. Hybridoma 선별은 Kim et al. (2008)의 ELISA 방법을 변형하여 실시하였다. 정제된 넙치 IgM (MBPIgM와 ProLIgM)을 coating buffer (0.
MBPIgM과 ProLIgM을 마우스에 면역시킨 후 마우스의 비장 조직과 SP2/0 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 클로닝하여 최종적으로 9개의 MAb를 선별하였다. MBPIgM에 대한 5개의 MAb (MBPIgMMAb:1, 2, 3, 4, 5)와 ProLIgM에 대한 4개의 MAb (ProLIgMMAb:6, 7, 8, 9).
MBPIgM과 ProLIgM을 마우스에 면역시킨 후 마우스의 비장 조직과 SP2/0 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 클로닝하여 최종적으로 9개의 MAb를 선별하였다.
T-PBS 로 5번 수세하였고 ELISA 발색액(100 mM Na2HPO4, 50 mM citric acid, 1 mg/mL o-phenylenediamine, 0.03% H2O2)을 각 well에 50 µL씩 분주한 후 25℃에서 15분 동안 발색하였다.
각 well에 2 N H2SO4를 50 µL씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후 microplate photometer (Multiskan, USA)로 492 nm에서 흡광도(optical density, OD)값을 측정하였다.
넙치 IgM에 대한 MAb를 생산하는 hybridoma의 선별과 제작된 MAb가 넙치 IgM을 인식하는지를 조사하기 위하여 ELISA 를 실시하였다. Hybridoma 선별은 Kim et al.
Laemmli (1970)의 방법에 준해 SDS-PAGE를 실시하였다. 넙치 IgM의 인식부위를 확인하기 위해, 정제된 넙치 IgM (MBPIgM와 ProLIgM)을 12% polyacrylamide gel에 loading 한 후 100 V에서 전기영동을 하였다. 전기영동 종료 후 gel을 coomassie brilliant blue를 사용하여 염색하였다.
본 연구에서 제작된 MAb가 항체 검출 ELISA에 사용 가능한 지를 평가하기 위해, 넙치에 BSA를 면역시킨 후 0, 7, 14, 21일째 혈청을 분리하여 BSA에 대한 항체가를 측정하였다(Fig. 4). ProLIgM-MAb 4개(6, 7, 8, 9)는 BSA 면역 넙치 혈청에 대해 시간이 경과됨에 따라 항체가가 증가되는 것으로 나타났으며, 대조구의 혈청(BSA 비면역 혈청)에서는 뚜렷한 항체가의 증가가 관찰되지 않았다.
본 연구에서는 넙치를 대상으로 한 항체 검출 ELISA를 실시 하는데, 반드시 필요한 넙치 IgM에 대한 항체를 생산하기 위하여 MBP와 protein L affinity column을 사용하여 넙치 IgM 를 정제한 후, 정제된 IgM (MBPIgM와 ProLIgM)을 사용하여 MAb를 제작하였다. MBP와 protein L affinity column을 사용하여 넙치 Ig를 정제한 후 SDS-PAGE를 실시한 결과, MBPIgM과 ProLIgM 모두에서 약 77, 73, 28 kDa의 분자량이 관찰되었다(Fig.
, 2007)이 보고되어 있다. 본 연구에서는 처음으로 protein L affinity column을 사용하여 넙치 IgM을 정제하였다. Protein L affinity column은 기존의 방법들에 비해(salting-out, ion-exchange chromatography 및 gel filtra-tion을 이용한 방법, immune affinity column을 사용하는 방법) 간편하면서도 빠른 시간내에 넙치 IgM을 정제할 수 있는 장점을 지니고 있다.
양성 hybridoma는 정제된 넙치 IgM을 사용하여 ELISA법으로 선별하였고 3회 이상 제한 희석법으로 클로닝하였다. 선별된 MAb의 isotyping은 마우스 Ig isotyping ELISA kit (BD Biosciences, USA)를 사용하여 결정하였다.
항체 반응과 발색 조건은 위와 동일하게 실시하였다. 양성 대조구로는 시판 중인 항 넙치 IgM에 대한 MAb (Diagnostics Ltd., Scotland)를 사용하여 위와 동일하게 ELISA를 실시하였다.
(1979)의 방법에 따라 실시하였다. 전기 영동한 넙치 IgM을 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA) 에 옮긴 후, 본 연구에서 제작한 MAb (1차 항체)와 alkaline phosphatase (AP)가 붙어 있는 goat anti-mouse IgG (Sigma, USA, 2차 항체)로 반응시키고 AP가 붙어 있는 substrate kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 발색하였다.
정제된 넙치 IgM (MBPIgM과 ProLIgM)과 complete Freund’s adjuvant (Gibco, USA)를 동량으로 섞어 100 μL씩 2마리의 BALB/c 마우스의 복강에 1차 접종하였고, 2주 후에 정제된 넙치 IgM으로 2차 접종하였다.
항 BSA 넙치 혈청은 건강한 넙치(체중: 1.0-1.5 kg) 2마리에 BSA를 1 mg/200 µL씩 복강에 주사한 후 17-20℃에 사육하면서 0, 7, 14, 21일째 미부정맥에서 채혈하여 원심분리(6,000 rpm, 4℃, 20 min)하여 얻었으며, 대조구의 혈청은 2마리의 넙치에 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)를 200 µL씩 복강에 주사한 후 위와 동일한 방법으로 분리하였다.
이론/모형
Laemmli (1970)의 방법에 준해 SDS-PAGE를 실시하였다. 넙치 IgM의 인식부위를 확인하기 위해, 정제된 넙치 IgM (MBPIgM와 ProLIgM)을 12% polyacrylamide gel에 loading 한 후 100 V에서 전기영동을 하였다.
Shin et al. (2007)이 언급한 방법에 따라 ImmunoPure IgM purification kit (Pierce, USA)를 사용하여 넙치 IgM을 정제하였다. ImmunoPure MBP column을 preparation buffer 5 mL로 수세한 후 binding buffer 20 mL로 column을 equilibration 하였다.
전기영동 종료 후 gel을 coomassie brilliant blue를 사용하여 염색하였다. Western blot-ting은 Towbin et al. (1979)의 방법에 따라 실시하였다. 전기 영동한 넙치 IgM을 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA) 에 옮긴 후, 본 연구에서 제작한 MAb (1차 항체)와 alkaline phosphatase (AP)가 붙어 있는 goat anti-mouse IgG (Sigma, USA, 2차 항체)로 반응시키고 AP가 붙어 있는 substrate kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 발색하였다.
6×10-2 mM thymidine in Dulbecco’s modified eagle medium)로 suspension 시킨 후 96 well plate에 분주하여 37℃ 로 설정된 CO2 배양기에서 배양하였다. 양성 hybridoma는 정제된 넙치 IgM을 사용하여 ELISA법으로 선별하였고 3회 이상 제한 희석법으로 클로닝하였다. 선별된 MAb의 isotyping은 마우스 Ig isotyping ELISA kit (BD Biosciences, USA)를 사용하여 결정하였다.
각 well에 2 N H2SO4를 50 µL씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후 microplate photometer (Multiskan, USA)로 492 nm에서 흡광도(optical density, OD)값을 측정하였다. 제작된 MAb가 넙치 IgM을 인식하는지를 조사하기 위하여 BSA에 대한 특이 항체를 검출하는 ELISA를 Kim et al. (2007, 2011)의 방법에 준해 실시하였다. ELISA plate에 5 µg BSA/50 µL를 각 well에 분주한 후, 37℃에서 overnight하여 항원을 coating 하였다.
성능/효과
MBPIgM에 대한 5개의 MAb (MBPIgMMAb:1, 2, 3, 4, 5)와 ProLIgM에 대한 4개의 MAb (ProLIgMMAb:6, 7, 8, 9). 9개의 MAb에 대한 isotyping 결과, H chain은 IgG1 (1, 2, 3, 4, 5, 9), IgG2a (7), IgG2b (6, 8)로 나타났으며, L chain은 모두 kappa로 확인되었다(data not shown). 9개의 MAb와 정제된 넙치 IgM을 사용하여 western blotting을 실시한 결과, MBPIgM-MAb 5개는 MBPIgM과 ProLIgM의 H chain을 인식하였다(Fig.
9개의 MAb에 대한 isotyping 결과, H chain은 IgG1 (1, 2, 3, 4, 5, 9), IgG2a (7), IgG2b (6, 8)로 나타났으며, L chain은 모두 kappa로 확인되었다(data not shown). 9개의 MAb와 정제된 넙치 IgM을 사용하여 western blotting을 실시한 결과, MBPIgM-MAb 5개는 MBPIgM과 ProLIgM의 H chain을 인식하였다(Fig. 2). ProLIgM-MAb의 경우, 6과 7은 MBPIgM과 ProLIgM 모두 H chain을 강하게 인식하였고, 9는 L chain에 반응하였다(Fig.
4). MBPIgM-MAb 5개(1, 2, 3, 4, 5)는 3개의 ProLIgM-MAb (7, 8, 9)와 유사한 결과를 보여 BSA 면역 혈청과 대조구의 혈청이 뚜렷이 구분되었다. 하지만 BSA 비면역 넙치 혈청과 BSA를 면역시키기 전에 취한 혈청에서도 OD값(0.
본 연구에서는 넙치를 대상으로 한 항체 검출 ELISA를 실시 하는데, 반드시 필요한 넙치 IgM에 대한 항체를 생산하기 위하여 MBP와 protein L affinity column을 사용하여 넙치 IgM 를 정제한 후, 정제된 IgM (MBPIgM와 ProLIgM)을 사용하여 MAb를 제작하였다. MBP와 protein L affinity column을 사용하여 넙치 Ig를 정제한 후 SDS-PAGE를 실시한 결과, MBPIgM과 ProLIgM 모두에서 약 77, 73, 28 kDa의 분자량이 관찰되었다(Fig. 1). ProLIgM에서는 넙치 혈청 로트에 따라서 약 77, 73, 28 kDa의 분자량 이외에도 약 57 kDa의 분자량이 관찰 되기도 하였다(data not shown).
4). ProLIgM-MAb 4개(6, 7, 8, 9)는 BSA 면역 넙치 혈청에 대해 시간이 경과됨에 따라 항체가가 증가되는 것으로 나타났으며, 대조구의 혈청(BSA 비면역 혈청)에서는 뚜렷한 항체가의 증가가 관찰되지 않았다. Kim et al.
Protein L affinity column은 기존의 방법들에 비해(salting-out, ion-exchange chromatography 및 gel filtra-tion을 이용한 방법, immune affinity column을 사용하는 방법) 간편하면서도 빠른 시간내에 넙치 IgM을 정제할 수 있는 장점을 지니고 있다. 또한 ProLIgM을 사용하여 제작한 MAb는 MBPIgM-MAb와 마찬가지로 넙치 IgM을 특이적으로 인식하는 것으로 확인되었다.
후속연구
, 2007) 넙치 IgM이 블로킹제에 비특이적으로 흡착하여 발생하는 높은 백그라운드와는 관계가 없을 것으로 사료 된다. 향후 위의 원인을 규명하는 연구가 수행되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국내 넙치류 생산 현황은?
넙치(Paralichtys olivaceus)는 가자미목 넙치과에 속하는 해산어종으로서 완전양식 기술이 확립되어 있으며, 식용으로서의 기호도가 높아 우리나라의 대표적인 양식 어종으로서 자리매김하고 있다. 2015년 넙치류의 양식 생산량은 45,759톤(약 5,040억원)으로 전체 어류 양식 생산량의 약 53%를 차지하고 있다(KOSIS, 2016). 하지만 고밀도 사육, 병원체의 출현, 어장의 노후화 등으로 인해 다양한 감염성 질병이 발생하여 경제적으로 피해를 입고 있다.
넙치란 무엇인가?
넙치(Paralichtys olivaceus)는 가자미목 넙치과에 속하는 해산어종으로서 완전양식 기술이 확립되어 있으며, 식용으로서의 기호도가 높아 우리나라의 대표적인 양식 어종으로서 자리매김하고 있다. 2015년 넙치류의 양식 생산량은 45,759톤(약 5,040억원)으로 전체 어류 양식 생산량의 약 53%를 차지하고 있다(KOSIS, 2016).
넙치류의 양식의 문제점은?
2015년 넙치류의 양식 생산량은 45,759톤(약 5,040억원)으로 전체 어류 양식 생산량의 약 53%를 차지하고 있다(KOSIS, 2016). 하지만 고밀도 사육, 병원체의 출현, 어장의 노후화 등으로 인해 다양한 감염성 질병이 발생하여 경제적으로 피해를 입고 있다.
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