메탄올자화균이란 일탄소 화합물인 메탄올을 주탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 미생물을 말한다. Methylobacterium extorquens AM1은 serine cycle을 탄소대사경로로 이용하는 메탄올자화균 중에서도 가장 많이 연구가 진행된 균주이다. M. extorquens AM1의 poly 3-hydroxybutyrate (PHB) cycle은 EMCP (ethylmalonyl-CoA pathway), glyoxylate regeneration cycle, TCA cycle과 연결되어 있으며 EMCP 유래 유기산 또는 TCA 유기산을 생산하기 위해서는 PHB cycle로 흐르는 carbon flux의 차단이 필요하다. 이를 위해서 PHB 합성과 acetyl-CoA flux의 조절유전자로 알려져 있는 PhaR 유전자를 markerless gene deletion 방법을 이용해서 M. extorquens AM1에서 knockout했다. 결과적으로, knockout 균주인 ${\Delta}phaR$에서 야생종 대비 확연히 PHB granule이 줄어든 것이 확인되었다. Lag phase가 약 12 h 늦어졌지만, ${\Delta}phaR$은 야생종과 비슷한 세포성장과 메탄올소비 경향을 보임을 확인하였다.
메탄올자화균이란 일탄소 화합물인 메탄올을 주탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 미생물을 말한다. Methylobacterium extorquens AM1은 serine cycle을 탄소대사경로로 이용하는 메탄올자화균 중에서도 가장 많이 연구가 진행된 균주이다. M. extorquens AM1의 poly 3-hydroxybutyrate (PHB) cycle은 EMCP (ethylmalonyl-CoA pathway), glyoxylate regeneration cycle, TCA cycle과 연결되어 있으며 EMCP 유래 유기산 또는 TCA 유기산을 생산하기 위해서는 PHB cycle로 흐르는 carbon flux의 차단이 필요하다. 이를 위해서 PHB 합성과 acetyl-CoA flux의 조절유전자로 알려져 있는 PhaR 유전자를 markerless gene deletion 방법을 이용해서 M. extorquens AM1에서 knockout했다. 결과적으로, knockout 균주인 ${\Delta}phaR$에서 야생종 대비 확연히 PHB granule이 줄어든 것이 확인되었다. Lag phase가 약 12 h 늦어졌지만, ${\Delta}phaR$은 야생종과 비슷한 세포성장과 메탄올소비 경향을 보임을 확인하였다.
Methylotrophy is able to use reduced one-carbon compound, such as methanol and methylamine, as a sole carbon source. Methylobacterium extorquens AM1 is the most extensively studied methylotroph utilizing serine-isocitrate lyase cycle. Because the Poly 3-hydroxybutyrate (PHB) synthesis pathway in M. ...
Methylotrophy is able to use reduced one-carbon compound, such as methanol and methylamine, as a sole carbon source. Methylobacterium extorquens AM1 is the most extensively studied methylotroph utilizing serine-isocitrate lyase cycle. Because the Poly 3-hydroxybutyrate (PHB) synthesis pathway in M. extorquens AM1 is likely to interlink with EMCP (ethylmalonyl-CoA pathway), glyoxylate, and TCA cycles, regulation of PHB production is needed to produce EMCP-derived acid or TCA acids. To adjust carbon flux to PHB production, PhaR, which seems to have function of regulator of PHB synthesis and acetyl-CoA flux, was knocked out in M. extorquens AM1 by using markerless gene deletion methods. As a result, PHB granules were remarkably reduced in the knockout strain ${\Delta}phaR$ compared to parental strain. Although lag phase was extended for 12h, ${\Delta}phaR$ showed similar cell growth and methanol consumption rate compared to wild type.
Methylotrophy is able to use reduced one-carbon compound, such as methanol and methylamine, as a sole carbon source. Methylobacterium extorquens AM1 is the most extensively studied methylotroph utilizing serine-isocitrate lyase cycle. Because the Poly 3-hydroxybutyrate (PHB) synthesis pathway in M. extorquens AM1 is likely to interlink with EMCP (ethylmalonyl-CoA pathway), glyoxylate, and TCA cycles, regulation of PHB production is needed to produce EMCP-derived acid or TCA acids. To adjust carbon flux to PHB production, PhaR, which seems to have function of regulator of PHB synthesis and acetyl-CoA flux, was knocked out in M. extorquens AM1 by using markerless gene deletion methods. As a result, PHB granules were remarkably reduced in the knockout strain ${\Delta}phaR$ compared to parental strain. Although lag phase was extended for 12h, ${\Delta}phaR$ showed similar cell growth and methanol consumption rate compared to wild type.
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문제 정의
extorquens AM1이 C1 화합물을 이용해 전혀 성장하지 못하며, phaC의 결실이 일어날 경우에는 성장속도가 느려져 세포가 성장하는데 결함이생기게 된다[17,18]. 따라서 미생물의 acetyl-CoA flux 및 PHB 합성 조절유전자로 알려져 있는 phaR 유전자를 제거함으로써 carbon flux의 과잉을 해결하고자 하였다. 본 연구는 phaR유전자 제거를 위해 기존의 insertion 방법[17]이 아닌 pK19mobsacB를 이용한 markerless gene deletion 방법을 M.
따라서 미생물의 acetyl-CoA flux 및 PHB 합성 조절유전자로 알려져 있는 phaR 유전자를 제거함으로써 carbon flux의 과잉을 해결하고자 하였다. 본 연구는 phaR유전자 제거를 위해 기존의 insertion 방법[17]이 아닌 pK19mobsacB를 이용한 markerless gene deletion 방법을 M. extorquens AM1에서 확립하였고, M. extorquens AM1에서 공초점 현미경을 통해 PHB granule이 가시적으로 확인가능함을 제시하였다.
제안 방법
재조합 플라스미드 (pK19mobsacB-ΔphaR)가 도입된 재조합 클론은 standard protocol에 따라 선별되었다[20]. Kanamycin-sensitive, saccharose-resistant clone은 overlap primer을 이용해 colony PCR으로 확인하였다. phaR deletion에 이용된 올리고 정보는 Table 1에 기재하였다.
M. extorquens AM1 wild type과 ΔphaR 균주의 차이를 확인하기 위해 배양 실험을 진행하였다.
phaR 결실을 확인하기 위해, phaR upstream, downstream의 overlap PCR용 올리고머를 사용해 colony PCR 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 통해 wild type과 phaR 결실 균주의 DNA사이즈를 확인하였다(Fig.
phaR 유전자 제거를 확인하기 위해 PHB granule을 선택적으로 염색하는 Nile-red 시약을 이용해 염색 후 공초점 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과 덤벨 또는 막대기 모양으로 세포 양쪽에 PHB granule이 관찰되었다.
따라서 PHB를 암호화하는 유전자인 phaABC를 조절하는 phaR 조절유전자의 knockout을 통해 메탄올로부터 TCA cycle로 향하는 carbon flux를 강화하였다. 기존 유전자 제거 방법과 다르게 pK19mobsacB 벡터를 이용한 markerless gene deletion 방법을 이용해 항생제저항유전자가 남지 않는 strain을 제작하였다. phaR이 knockout된 돌연변이에서 세포 내 PHB granule의 생성이 저해되는 것을 공초점 현미경을 통해 가시적으로 확인할 수 있었다.
25로 계산하여 접종하였고 methanol은 1% (v/v)으로주입하고 30oC, 240 rpm 조건으로 배양하였다. 미생물 배양액은 61 h까지 600 nm 파장에서 세포 광학밀도(OD)를측정하였다.
extorquens AM1 wild type과 ΔphaR 균주의 차이를 확인하기 위해 배양 실험을 진행하였다. 실험 배지는 M. extorquens AM1이 쉽게 성장 가능한 한정배지인 NMS Media에 메탄올을 주 탄소원으로 추가하였으며, 재현성을 위해 flask scale에서 3번 진행하였다.
phaR 결실을 확인하기 위해, phaR upstream, downstream의 overlap PCR용 올리고머를 사용해 colony PCR 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 통해 wild type과 phaR 결실 균주의 DNA사이즈를 확인하였다(Fig. 2). 기존 phaR deletion은 insertion deletion방법을 주로 사용했다[17].
대상 데이터
Column은 Hi-Plex H (300×7.7 mm Column Dimensions, polystyreol-divinylbenzol resin; Agilent Technologies, USA)를 사용하였다.
실험에 사용된 균주는 메탄올을 탄소원 및 에너지원으로 이용하여 성장하는 균주로서 ATCC에서 분양받은 Methylobacterium extorquens AM1 (ATCC 14718)을 이용하였다. 균주의 배양에 사용된 기본 배지는 Higgins의 Nitrate Minimal Salt (NMS) medium을 약간 변형 시켜 사용하였다[21].
실험에 사용된 균주인 Methylobacterium extorquens AM1은 ATCC에 서분양받았다. phaR유전자 제거를 위해서는 markerless gene deletion 방법에 쓰이는 pK19mobsacB 벡터를 사용하였다[20].
실험에서 반응한 Methanol은 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) YL9100 (Younglin, Korea)을 이용하여 분석하였으며, 검출기는 굴절률 검출기(RID) YL9170 (Younglin, Korea)을 이용하였다. Column은 Hi-Plex H (300×7.
이론/모형
M. extorquens AM1의 phaR 결실 돌연변이는 two-step homologous recombination 방법을 통해 제작하였다[20]. phaR유전자의 upstream (551bp)과 downstream (298bp)을 polymerase chain reaction (PCR)을 통해 증폭한다.
실험에 사용된 균주인 Methylobacterium extorquens AM1은 ATCC에 서분양받았다. phaR유전자 제거를 위해서는 markerless gene deletion 방법에 쓰이는 pK19mobsacB 벡터를 사용하였다[20].
생성된 875bp 크기의 최종 PCR 산물은 제한효소 Pst I와 EcoR I (Takara, Japan) 을 이용하여 pK19mobsacB에 삽입하였다. 구축한 재조합 플라스미드는 M. extorquens AM1에 Gene Pulser Xcell Electroporator (Bio-Rad, USA)를 이용해 전기천공법으로 도입하였다. 재조합 플라스미드 (pK19mobsacB-ΔphaR)가 도입된 재조합 클론은 standard protocol에 따라 선별되었다[20].
성능/효과
61시간 배양 실험 결과, phaR이 결실된 재조합 균의 경우 wild type에 비해 lag phase가 12 h 늦어졌지만 세포 성장 최대값은 비슷한 것으로 보아 생장에 크게 영향을 주지는 않는 것으로 보인다. HPLC 분석결과 wild type, 재조합 균 모두 메탄올 1% (v/v, 7.
61시간 배양 실험 결과, phaR이 결실된 재조합 균의 경우 wild type에 비해 lag phase가 12 h 늦어졌지만 세포 성장 최대값은 비슷한 것으로 보아 생장에 크게 영향을 주지는 않는 것으로 보인다. HPLC 분석결과 wild type, 재조합 균 모두 메탄올 1% (v/v, 7.91 g/ L)는 100% uptake함을 확인하였으나 다른 Metabolite는 검출되지 않았다(Fig. 5). TCA cycle유래 대사산물의 경우 Acetyl-CoA flux가 부족한 것으로 추정된다[19].
그 결과 덤벨 또는 막대기 모양으로 세포 양쪽에 PHB granule이 관찰되었다. phaR 결실 돌연변이는 wild type에 비해 두드러지게 PHB granule이 줄어든 것이 확인되었다(Fig. 3).
기존 유전자 제거 방법과 다르게 pK19mobsacB 벡터를 이용한 markerless gene deletion 방법을 이용해 항생제저항유전자가 남지 않는 strain을 제작하였다. phaR이 knockout된 돌연변이에서 세포 내 PHB granule의 생성이 저해되는 것을 공초점 현미경을 통해 가시적으로 확인할 수 있었다. 본 연구는 M.
)는 Table 1에 명시하였다. 각각의 PCR산물을 주형으로 overlap PCR을 하였고 그 결과 875bp의 최종 PCR 산물이 생성되었다. overlap PCR에 사 용한 overlap primer는 Table 1에 명시하였다.
phaR 유전자 제거를 확인하기 위해 PHB granule을 선택적으로 염색하는 Nile-red 시약을 이용해 염색 후 공초점 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과 덤벨 또는 막대기 모양으로 세포 양쪽에 PHB granule이 관찰되었다. phaR 결실 돌연변이는 wild type에 비해 두드러지게 PHB granule이 줄어든 것이 확인되었다(Fig.
PHB cycle은 EMCP (ethylmalonyl-CoA pathway), TCA cycle과 연결되어 있으며 EMCP 유래 유기산 또는 TCA 유기산을 생산하기 위해서는 PHB 합성 대사경로의 차단이 필요하다. 따라서 PHB를 암호화하는 유전자인 phaABC를 조절하는 phaR 조절유전자의 knockout을 통해 메탄올로부터 TCA cycle로 향하는 carbon flux를 강화하였다. 기존 유전자 제거 방법과 다르게 pK19mobsacB 벡터를 이용한 markerless gene deletion 방법을 이용해 항생제저항유전자가 남지 않는 strain을 제작하였다.
이 방법을 사용할 시에 kanamycin 저항 유전자가 돌연변이 균에 남게 되어 추가 유전자 결실 균주 제작이나, 배양에 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 mobsacB를 이용한 유전자제거 방법을 사용하였고, 이 방법은 insertion deletion에 비해 삽입되는 유전자가 없고, 기존 야생종 대비 변화 부분이 phaR deletion 외에 없다는 장점이 있다.
실험 결과 wild type의 경우 거의 대부분의 세포에서 PHB가 생성되었으나, phaR 결실 돌연변이의 경우는 일부만 PHB가 생성되었고, 형광 흡수세기 값도 매우 낮았다. 따라서 실험결과 phaR을 제거할 경우 PHB 생성은 강력히 저해되는 것을 확인하였다.
세포당 상대적인 형광흡수세기는 Pixel sum/Cell count로 계산하였으며wild type과 ΔphaR은 약 17.8배 차이를 보였다(Fig. 4).
4). 실험 결과 wild type의 경우 거의 대부분의 세포에서 PHB가 생성되었으나, phaR 결실 돌연변이의 경우는 일부만 PHB가 생성되었고, 형광 흡수세기 값도 매우 낮았다. 따라서 실험결과 phaR을 제거할 경우 PHB 생성은 강력히 저해되는 것을 확인하였다.
후속연구
phaR이 knockout된 돌연변이에서 세포 내 PHB granule의 생성이 저해되는 것을 공초점 현미경을 통해 가시적으로 확인할 수 있었다. 본 연구는 M. extorquens AM1의 중심 대사과정과 PHB cycle의 후속연구에 도움이 될 것이라 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
메탄올자화균이란 무엇인가?
메탄올자화균이란 호기 상태에서 일탄소 화합물인 메탄올을 주 탄소원 및 에너지원으로 이용하는 미생물을 일컫는다[5,6]. 이에 대한 연구는 1970년대 이후 균체 단백질(single cell protein, SCP)이나 생분해성 고분자인 poly 3-hydroxybutyrate (PHB)를 생산하기 위해 많이 진행되었다[6-8].
PHB 합성에 관여하는 유전자는 무엇이 있는가?
1)[17,18]. PHB 합성에 관여하는 유전자는 phaA, phaB, phaC, phaR이 있다. phaA와 phaB의 결실 일어날 경우 M.
메탄올자화균의 Type I과 Type II의 특징은 무엇인가?
메탄올자화균은 세포내 막 구조에 따라 Type I과 Type II로 분류된다. Type I은 여러 겹의 막이 세포 전체에 고루 분포하고 있는 반면, Type II는 두 겹의 막이 세포 표면 쪽에 분포하고있다. 또한일탄소화합물을생합성에이용하는경로에따라 ribulose monophosphate (RuMP) cycle methylotroph와 serine cycle methylotroph로 분류된다.
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