[국내논문]PCR을 이용한 축산물 가공식품 내 소고기 성분 검출법 개발 Development of a Method to Detect Cattle Material from Processed Meat Products Using a Polymerase Chain Reaction원문보기
중합효소연쇄반응법을 이용한 축산물 가공식품 내에 존재하는 소고기 성분을 특이적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 축산물 가공식품 78종류를 무작위로 선별하였다. 가공식품으로부터 추출한 genomic DNA를 이용하여 소의 미토콘드리아 16S rRNA 염기서열을 이용하여 strain-specific primer를 직접 제작하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후, 증폭된 반응산물의 염기서열을 분석 하였다. 축산물 가공식품 내 소고기 성분 검출을 위한 중합효소연쇄반응 수행 결과, 소고기 성분이 함유되어 있는 17개의 축산물 가공식품이 정확히 증폭되었고, 증폭산물의 DNA 염기서열 분석 결과 소의 미토콘드리아 16S rRNA 서열과 95% 이상의 상동성을 보였다. 본 실험에서 제시된 방법으로 축산물 가공식품 내 소고기 성분검출을 적용하였을 시, 소고기 성분이 함유된 축산물 가공식품을 정확하게 감별할 수 있었으며, 나아가 식품 원재료의 허위기재 등에 의한 불량식품 유통 근절 및 종교적 이유로 인한 금기 식품감별 등과 같은 과학적 식품 감시에 기여할 수 있다고 사료된다.
중합효소연쇄반응법을 이용한 축산물 가공식품 내에 존재하는 소고기 성분을 특이적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 축산물 가공식품 78종류를 무작위로 선별하였다. 가공식품으로부터 추출한 genomic DNA를 이용하여 소의 미토콘드리아 16S rRNA 염기서열을 이용하여 strain-specific primer를 직접 제작하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후, 증폭된 반응산물의 염기서열을 분석 하였다. 축산물 가공식품 내 소고기 성분 검출을 위한 중합효소연쇄반응 수행 결과, 소고기 성분이 함유되어 있는 17개의 축산물 가공식품이 정확히 증폭되었고, 증폭산물의 DNA 염기서열 분석 결과 소의 미토콘드리아 16S rRNA 서열과 95% 이상의 상동성을 보였다. 본 실험에서 제시된 방법으로 축산물 가공식품 내 소고기 성분검출을 적용하였을 시, 소고기 성분이 함유된 축산물 가공식품을 정확하게 감별할 수 있었으며, 나아가 식품 원재료의 허위기재 등에 의한 불량식품 유통 근절 및 종교적 이유로 인한 금기 식품감별 등과 같은 과학적 식품 감시에 기여할 수 있다고 사료된다.
Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect cattle material from processed meat products. Seventy-eight different commercial processed meat products were purchased from several big food marts. Among them, 17 products contained cattle material (10 samples contained only cattle, 5 samples mixed...
Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect cattle material from processed meat products. Seventy-eight different commercial processed meat products were purchased from several big food marts. Among them, 17 products contained cattle material (10 samples contained only cattle, 5 samples mixed with cattle and porcine, 2 samples mixed with cattle, porcine and chicken). The genomic DNA was extracted directly from the processed meat products, and strain-specific primer targeting the 16S ribosomal RNA mitochondrial gene was used. All PCR products were cloned into the pGEM-T easy vector and sequenced. Consequently, the PCR products were amplified from 10 processed meat products, which contained only cattle material in our conditions. Furthermore, PCR reactions showed the same results at mixed samples. The DNA sequence obtained from pGEM-T easy/PCR products showed more than 95% identity with Bos taurus 16S rRNA gene using homology analysis. In conclusion, we suggest that the method using PCR, as performed in this study, could be useful in detecting cattle material in processed meat products. Moreover, our system could be applicable in inspection procedures to improve the verification of correct labeling for import and export processed meat products.
Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect cattle material from processed meat products. Seventy-eight different commercial processed meat products were purchased from several big food marts. Among them, 17 products contained cattle material (10 samples contained only cattle, 5 samples mixed with cattle and porcine, 2 samples mixed with cattle, porcine and chicken). The genomic DNA was extracted directly from the processed meat products, and strain-specific primer targeting the 16S ribosomal RNA mitochondrial gene was used. All PCR products were cloned into the pGEM-T easy vector and sequenced. Consequently, the PCR products were amplified from 10 processed meat products, which contained only cattle material in our conditions. Furthermore, PCR reactions showed the same results at mixed samples. The DNA sequence obtained from pGEM-T easy/PCR products showed more than 95% identity with Bos taurus 16S rRNA gene using homology analysis. In conclusion, we suggest that the method using PCR, as performed in this study, could be useful in detecting cattle material in processed meat products. Moreover, our system could be applicable in inspection procedures to improve the verification of correct labeling for import and export processed meat products.
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문제 정의
이에 본 연구에서는, 기존의 축산물 식육 원재료에서 genomic DNA를 추출하여 PCR로 식육 원재료를 판별하는 방법과는 다르게, 다양한 식품 첨가제가 함유되어 있는 축산물 가공식품으로부터 직접 genomic DNA를 추출하고 소고기 성분만을 검출할 수 있는 특이적인 primer를 제작한 후 축산물 가공식품을 대상으로 소고기 성분을 검출 할 수 있는 PCR법을 개발하고자 하였다.
본 실험에서는 축산물 가공식품으로부터 소고기 성분을 정확하게 검출할 수 있는 새로운 PCR 방법을 제시하고자 하였다. 본 실험에 사용된 방법으로 PCR 반응을 수행하면 축산물 가공식품을 대상으로 소고기 성분의 함유 유무를 정확히 규명할 수 있을 것으로 기대되며, 나아가 식품 원료의 허위 기재로 인한 소비자 건강보호 및 종교에 의한 금지 식품 조사 등에 대한 과학적 식품 감시가 가능할 것으로 사료된다.
제안 방법
양성 대조군은 소고기 식육을, 음성 대조군은 돼지고기, 닭고기 및 오리고기 식육 원재료로부터 추출한 genomic DNA을 이용하여 같은 방법으로 사용하였고, 최종 PCR 반응산물의 확인은 PCR 반응 산물에 6X DNA loading dye를 10 μL 첨가 하여 교반한 후 10 μL를 취하여 2% agarose gel로 100 V, 30분간 전기영동 하였다. PCR 산물의 크기를 확인하기 위하여 100 bp DNA ladder를 함께 전기영동 한 후,EtBr (1 μg/mL)로 염색하여, Gel DocTM EZ Gel Documentation System (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)을 이용하여 확인하였다.
PCR 반응산물의 정확성을 확인하기 위해서는 DNA 염기서열을 분석하는 것이 가장 좋은 방법이다. 이를 위해, 축산물 가공식품으로부터 PCR 반응 동안 변이가 생기지 않는 pfu 중합효소를 사용하여 PCR 반응산물을 획득한 후, dATP를 이용하여 A tailing 실시하고, pGEMⓇ-T Easy vector에 cloning을 실시하여 clone을 확보했다. 확보된 clone을 이용하여 획득한 PCR 반응산물의 염기서열을 확인해 본 결과, 각각의 PCR 반응산물은 표적 유전자와의 상동성이 95% 이상 높게 나타났다.
대상 데이터
축산물 가공식품으로부터 소고기 성분을 검출하기 위한 PCR 방법을 개발하기 위하여 경남 진주에 위치한 대형마트로부터 소고기, 돼지고기 및 닭고기 성분이 함유되어 있는 축산물 가공식품 78종류를 무작위로 구매하였다. 이들 중에, 소고기 성분을 함유하는 축산물 가공식품은 떡갈비류 8개, 장조림류 1개,소세지류 2개, 스테이크류 1개, 그리고 탕류 5개로 총 17개였다.
데이터처리
제한효소 처리 후,2% agarose gel에 전기영동을 실시하여 클론을 확인하고,DNA 염기서열 분석을 의뢰하여 DNA 염기서열을 획득하였다. 획득된 DNA 염기서열의 상동성은 유전자은행의 blast 프로그램(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
본 실험에 필요한 genomic DNA를 추출하기 위해서 ExgeneTM Cell SV kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 지침대로 실시하였다. 양성 대조군으로 소고기 식육을, 음성 대조군으로 돼지고기, 닭고기 그리고 오리고기 식육 원재료를 이용하였다.
PCR 반응산물의 염기서열 분석을 위하여 pGEMⓇ-T Easy Vector (Promega, WI, USA)를 사용하였다. 먼저, PCR 반응산물을 WizardⓇ SV Gel and PCR clean-up System (Promega,WI, USA)을 이용하여 agarose gel로부터 추출한 후, 10XA-attachment mix (Toyobo Biotechnology, Osaka, Japan)를 이용하여 제조사의 지침대로 dATP를 결합시켜 pGEMⓇ-Teasy 플라즈미드와 T4 DNA ligase (Promega, WI, USA)를 이용하여 cloning을 실시하였다.
성능/효과
이런 이유로 여러 그룹에서 식품 원재료의 미토콘드리아 DNA를 이용하여 신속하고 정확하게 식품 원재료를 검출 할 수 있는 분자생물학적 방법인 PCR법[3] 및 multiplex PCR법[16] 등이 계속적으로 개발되어왔으나, 대부분의 경우 축산물 식육 원재료로부터 추출한 genomic DNA를 이용한 방법들로, 축산물 가공식품에서 직접 적용한 사례는 거의 존재하지 않는다. 본 실험에서도, 기존에 제시된 여러 primer 조합으로 축산물 가공식품으로부터 추출한 genomic DNA를 대상으로 소고기 성분 검출을 적용해보았으나, 비특이적 반응 산물이 생기거나 PCR 반응 억제 등의 다소 부정확한 결과가 나타났다. 그 이유 중 하나가 PCR 반응에 사용된 genomic DNA의 농도에 의한 것이라 사료되었다.
본 실험에서도 축산물 식육 원재료로부터 추출한 genomic DNA를 대상으로 한 PCR 반응은, 축산물 가공식품으로부터 추출한 genomic DNA 보다 훨씬 더 낮은 농도(20 fg/L)에서도 잘 수행되지만, 축산물 가공식품에서는 이 농도에서 PCR이 일부분만 수행되거나 전혀 되지 않았다. 이를 해결하기 위해서, 축산물 가공식품으로부터 추출한 genomicDNA량을 점차적으로 증가시켜 반복적으로 수행해 본 결과, 축산물 가공식품으로부터 소고기 성분의 첨가 유무를 정확하게 판별할 수 있는 PCR 조건을 확립 할 수 있었다. 이에 본 실험에서 사용한 primer 서열, 주형 DNA 농도 및 PCR 조건을 적용한다면 축산물 가공식품으로부터 소고기 성분의 함유 유무를 정확하게 조사할 수 있을 것으로 기대된다.
이를 위해, 축산물 가공식품으로부터 PCR 반응 동안 변이가 생기지 않는 pfu 중합효소를 사용하여 PCR 반응산물을 획득한 후, dATP를 이용하여 A tailing 실시하고, pGEMⓇ-T Easy vector에 cloning을 실시하여 clone을 확보했다. 확보된 clone을 이용하여 획득한 PCR 반응산물의 염기서열을 확인해 본 결과, 각각의 PCR 반응산물은 표적 유전자와의 상동성이 95% 이상 높게 나타났다.
후속연구
이를 해결하기 위해서, 축산물 가공식품으로부터 추출한 genomicDNA량을 점차적으로 증가시켜 반복적으로 수행해 본 결과, 축산물 가공식품으로부터 소고기 성분의 첨가 유무를 정확하게 판별할 수 있는 PCR 조건을 확립 할 수 있었다. 이에 본 실험에서 사용한 primer 서열, 주형 DNA 농도 및 PCR 조건을 적용한다면 축산물 가공식품으로부터 소고기 성분의 함유 유무를 정확하게 조사할 수 있을 것으로 기대된다.
본 실험에서는 축산물 가공식품으로부터 소고기 성분을 정확하게 검출할 수 있는 새로운 PCR 방법을 제시하고자 하였다. 본 실험에 사용된 방법으로 PCR 반응을 수행하면 축산물 가공식품을 대상으로 소고기 성분의 함유 유무를 정확히 규명할 수 있을 것으로 기대되며, 나아가 식품 원료의 허위 기재로 인한 소비자 건강보호 및 종교에 의한 금지 식품 조사 등에 대한 과학적 식품 감시가 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
미토콘드리아 유전자는 어떤 특징을 보유하고 있어 품종의 유전적 유연관계 및 유전적 차이를 구명하는데 유용하게 활용될 수 있는가?
이런 단점을 보완하기 위해서 보다 더 정확하고 감도가 뛰어난 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction,PCR)법을 이용한 유전자 수준에서 검사하는 진단법이 개발되어 오고 있다[6]. 특히, 미토콘드리아 유전자는 염기치환율이 유전체 DNA 보다 빠르고, 상이한 DNA 분자 사이에 유전자 조환이 발생하지 않는 모성유전을 하며[7] 종간 및 동종 내에 염기치환에 의한 많은 돌연변이를 보유하고 있어[8,9] 품종의 기원, 품종의 유전적 유연관계 및 유전적 차이를 구명하는데 매우 유용한 도구로 이용되어 왔다[10-13]. 이런 이유로 축산물 가공식품으로부터 특정 식육 원재료 물질의 혼합 유무를 조사하기 위하여 미토콘드리아 DNA를 표적으로 하는 PCR법이 개발되어 왔다.
식육 원재료 감별법 중 면역혈청침강반응, 미량겔 확산법 그리고 한천겔 확산법의 단점은 무엇인가?
일반적으로 축산물 가공식품으로부터 축산물의 가공기준 및 성분규격으로 채택된 식육 원재료 감별법은 glycogen 검사법,지방검사법 및 자비법이 있으나 감별기준이 모호하거나 검사자의 주관적인 판단에 의해 결정되는 단점이 있다. 또 다른 방법으로는 면역혈청침강반응, 미량겔 확산법 그리고 한천겔 확산법이 있으나 다른 종의 단백질과 교차반응이 일어날 수 있는 단점이 있다[5]. 이런 단점을 보완하기 위해서 보다 더 정확하고 감도가 뛰어난 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction,PCR)법을 이용한 유전자 수준에서 검사하는 진단법이 개발되어 오고 있다[6].
축산물 가공식품은 어떤 이유 때문에 안정성 및 신뢰성의 문제가 발생하는가?
우리나라에서의 축산물 소비는 고도 경제 성장 및 서구화된 식생활의 변화 등에 축산물 가공식품 위주로 폭발적으로 증가해 왔다[1]. 그러나 축산물 가공식품은 식육 원재료를 직접 보고 구매하는 것과 다르게 가공과정에서 그 식육 원재료를 눈으로 확인 할 수 없기에 안정성 및 신뢰성 등의 문제점을 가지고 있다[2]. 이로 인해 최근 값싼 식품원료를 사용하거나 식품의 원재료명을 허위로 기재한 가짜 식품의 제조 및 유통으로 인하여 식품의 안정성에 대한 불안감이 높아지고 있으며[3], 종교적 이유, 알러지 물질과 같은 건강에 대한 우려 등과 같은 문제를 일으키기도 한다[4].
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