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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 각 목장에서 유방염으로 진단받은 젖소의 우유를 전통적인 배양법과 파이로시퀀싱을 이용한 동정법을 비교하여 파이로시퀀싱을 이용한 동정법의 유효성을 조사하였다. 또한 주요 유방염 원인균으로 분리된 세균의 항생제 감수성을 확인한 후 천연 항균제인 난백과 라이소자임의 감수성을 조사하였다.
제안 방법
- 시료를 멸균 생리식염수로 10−3 ~10−5 희석하여 5% 면양혈 액한천배지(Hangang, Korea)에 도말한 후 37℃ 항온기에서 18시간 배양하였다.
- 집락의 크기, 모양 및 용혈 유형에 따라 분류한 후 각각의 집락을 채취하여 Tryptic soy broth에서 18시간 배양한 후 그람양성균인 경우 GP ID card, 그람음성균인 경우 GN ID card에 배양균을 접종하여 VITEK 2 compact(bioMérieux, France) 기기에 장착한 후 균종을 동정하였으며 동정 신뢰도 95% 이상인 결과만을 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 각 목장에서 유방염으로 진단받은 젖소의 우유를 전통적인 배양법과 파이로시퀀싱을 이용한 동정법을 비교하여 파이로시퀀싱을 이용한 동정법의 유효성을 조사하였다. 또한 주요 유방염 원인균으로 분리된 세균의 항생제 감수성을 확인한 후 천연 항균제인 난백과 라이소자임의 감수성을 조사하였다.
- 유방염 주요 원인균의 닭 및 오리의 난백과 라이소자임에 대한 감수성을 평가하기 위하여, 닭과 오리의 알을 70% 에탄올 솜으로 깨끗하게 세척한 후 무균적으로 난백을 분리한후 동량의 멸균 생리식염수를 첨가하였다. 계란 난백으로부터 정제한 라이소자임(Sigma-Aldrich, USA)을 멸균 생리식 염수에 3 mg/mL 농도로 용해했다.
- 중합효소연쇄반응은 16S rRNA 유전자의 V1에서 V3 부분을 증폭할수 있는 프라이머를 사용하였으며, 바코드 프라이머로 27F(5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC–TCAG-ACGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3’)와 518R(5’-CCATCTCA TCCCTGCGT GTCTCCGAC-TCAG-X-AC-WTTA CCGC GGCTGCTGG-3’(밑줄 그은 염기서열은 표적 유전자 서열이며 X는 바코드를 나타냄)를 사용하여 95℃로 5분 변성 후 95℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초의 반응을 30회 반복한 후 72℃로 5분간 중합효소연쇄반응을 수행하여 미생물 유전체를 증폭하였다.
- 시료로부터 얻은 리드(reads)는 고유의 바코드에 의해 분류하였고, 바코드, 링커 및 프라이머 염기서열은 제거하였으며, 비특이적인 염기서열을 2개 이상 가지고 있거나 low quality score(average score < 25) 또는 300 염기쌍보다 작은 경우는 분석에서 배제하였다.
- 중합효소연쇄반응은 16S rRNA 유전자의 V1에서 V3 부분을 증폭할수 있는 프라이머를 사용하였으며, 바코드 프라이머로 27F(5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC–TCAG-ACGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3’)와 518R(5’-CCATCTCA TCCCTGCGT GTCTCCGAC-TCAG-X-AC-WTTA CCGC GGCTGCTGG-3’(밑줄 그은 염기서열은 표적 유전자 서열이며 X는 바코드를 나타냄)를 사용하여 95℃로 5분 변성 후 95℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초의 반응을 30회 반복한 후 72℃로 5분간 중합효소연쇄반응을 수행하여 미생물 유전체를 증폭하였다. 증폭산물은 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)로 정제하였으며, 동일 농도의 증폭산물을 혼합한후 비특이적인 증폭산물을 Agencourt AMPure Beads Kit(Beckman Coulter, USA)로 제거하였다. 정제된 증폭산물의품질과 크기를 DNA 7500 chip과 Bioanalyzer 2100(Agilent, USA)으로 확인한 후, GS Junior Sequencing System (Roche, USA)으로 염기서열을 결정하였다.
- 증폭산물은 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)로 정제하였으며, 동일 농도의 증폭산물을 혼합한후 비특이적인 증폭산물을 Agencourt AMPure Beads Kit(Beckman Coulter, USA)로 제거하였다. 정제된 증폭산물의품질과 크기를 DNA 7500 chip과 Bioanalyzer 2100(Agilent, USA)으로 확인한 후, GS Junior Sequencing System (Roche, USA)으로 염기서열을 결정하였다.
- 시료의 richness and diversity는 Chao1 estimation과 Shannon diversity index(3% distance)로 결정하였고 [11], 시료 간 서로 다른 리드 크기를 비교하기 위해 리드 크기를 동등화하는 무작위 부분추출(random subsampling)을 수행하였다. 커뮤니티 간의 전체 계통 거리는 Fast UniFrac으로 예측하였으며 Principal Coordinate Analysis로 시각화하였다 [11]. 시료 간의 operational taxonomic unit(OTU)를 비교하기 위해 CLcommunity 프로그램의 XOR 분석기술로 공통 OTUs(shared OTUs)를 얻었다 (ChunLab).
- 시료 간의 operational taxonomic unit(OTU)를 비교하기 위해 CLcommunity 프로그램의 XOR 분석기술로 공통 OTUs(shared OTUs)를 얻었다 (ChunLab). 이렇게 확보한 데이터를 기초로 유방염 혼합원유와 정상원유 내 마이크로바이옴의 빈도를 비교하였다.
- 유방염 혼합원유 내 마이크로바이옴을 조사하기 위해 16S rRNA 유전자 파이로시퀀싱을 수행하였고, 실험 결과의 재현성을 확인하기 위해 동일 시료에 대해 16S rRNA 유전자 파이로시퀀싱을 반복 실시하였다. 그 결과 세균 종의 빈도와우점 순서가 유사하여 재현성이 확인되었다(Table 2).
- 농장에서 의뢰된 유방염 원유를 혼합한 후 농장별로 16S rRNA 유전자 파이로시퀀싱을 수행하여 세균배양 동정법 결과와 비교하였다(Table 3). 그 결과 PMM6 농장의 경우 세균배양법으로는 S.
- 5%인 것으로 보고된 바 있다 [22]. 기존 연구는 농장과 상관없이 유방염 젖소 개체 단위에서 원인균의 빈도를 조사하였으나, 본 연구에서는 농장 단위에서 원인균의 빈도를 조사하였다. 그 이유는 동일한 농장의 젖소 간에는 원인균의 수평감염 가능성이 높고, 그로 인해 농장별 시료 수 차이에 의한 원인균 빈도의 왜곡이 발생할 수 있기 때문이다.
- 그 이유는 동일한 농장의 젖소 간에는 원인균의 수평감염 가능성이 높고, 그로 인해 농장별 시료 수 차이에 의한 원인균 빈도의 왜곡이 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 유방염은 개체보다는 우군 단위 즉, 농장 단위에서 관리되는 것이 효율적이라 판단하여 농장별 원인균의 빈도를 조사하였다. 따라서, 본 연구의 원인균 빈도와 기존 연구 결과를 직접 비교하기는 어렵지만, S.
- Müller Hinton Broth (BD)로 2진 희석한 닭 및 오리 난백과 라이소자임 100 µL를 각 well에 분주한 후, 18시간 배양한 S. aureus(PMB2), S. hemolyticus(PMB6), S. chromogenes(PMB12), Streptococcus uberis(PMB21), L. garvieae(PMB39), E. faecalis(ADL1), K. rosea(PMB165)를 Müller Hinton Broth로 5 × 104 colonyforming unit/100 µL가 되도록 희석하여 96-well 배양용기에첨가(시료당 2개 well)한 후 교반하였고, 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후 세균이 자라지 않은 최고 희석배수의 평균을 항균역가로 하였다.
- 유전자 추출 및 중합효소연쇄반응은 ChunLab(Korea)에서수행하였다. 원유 내의 전체 미생물 유전체는 원유에 라이소 자임(30 mg/mL; Sigma-Aldrich) 및 mutanolysin 20 U를 첨가하고 37℃에서 60분간 반응시킨 후 QIAamp DNA Stool Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 추출하였다 [5]. 중합효소연쇄반응은 16S rRNA 유전자의 V1에서 V3 부분을 증폭할수 있는 프라이머를 사용하였으며, 바코드 프라이머로 27F(5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC–TCAG-ACGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3’)와 518R(5’-CCATCTCA TCCCTGCGT GTCTCCGAC-TCAG-X-AC-WTTA CCGC GGCTGCTGG-3’(밑줄 그은 염기서열은 표적 유전자 서열이며 X는 바코드를 나타냄)를 사용하여 95℃로 5분 변성 후 95℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초의 반응을 30회 반복한 후 72℃로 5분간 중합효소연쇄반응을 수행하여 미생물 유전체를 증폭하였다.
대상 데이터
- 2014년 12월부터 2016년 12월까지 전국 62개 젖소목장에서 유방염으로 진단된 748개 원유 시료를 받아 냉장 또는 냉동 보관하여 실험에 사용하였다. 유방염의 진단은 캘리포니아 밀크테스트를 이용하여 각 목장의 착유자의 판단으로 이루어졌으며 관능검사를 통해 분변 오염이 확인되지 않는 시료만을 사용하였다.
- 2014년 12월부터 2016년 12월까지 전국 62개 젖소목장에서 유방염으로 진단된 748개 원유 시료를 받아 냉장 또는 냉동 보관하여 실험에 사용하였다. 유방염의 진단은 캘리포니아 밀크테스트를 이용하여 각 목장의 착유자의 판단으로 이루어졌으며 관능검사를 통해 분변 오염이 확인되지 않는 시료만을 사용하였다. 파이로시퀀싱을 위한 유방염 혼합원유는 목장에서 2015년 1월부터 8월까지 수집하여 냉장 보관한 원유를 이용하였고, 정상원유는 서울대학교 평창캠퍼스의 실험목장에서 1 mL 당 체세포수 50,000개 미만인 원유를 혼합하여 바로 실험에 사용하였다.
- 유방염의 진단은 캘리포니아 밀크테스트를 이용하여 각 목장의 착유자의 판단으로 이루어졌으며 관능검사를 통해 분변 오염이 확인되지 않는 시료만을 사용하였다. 파이로시퀀싱을 위한 유방염 혼합원유는 목장에서 2015년 1월부터 8월까지 수집하여 냉장 보관한 원유를 이용하였고, 정상원유는 서울대학교 평창캠퍼스의 실험목장에서 1 mL 당 체세포수 50,000개 미만인 원유를 혼합하여 바로 실험에 사용하였다. 파이로시퀀싱을 위한 농장별 유방염 원유 시료는 시료별로 동량을 혼합하여 냉동보관 후 실험에 사용하였다.
- 파이로시퀀싱을 위한 유방염 혼합원유는 목장에서 2015년 1월부터 8월까지 수집하여 냉장 보관한 원유를 이용하였고, 정상원유는 서울대학교 평창캠퍼스의 실험목장에서 1 mL 당 체세포수 50,000개 미만인 원유를 혼합하여 바로 실험에 사용하였다. 파이로시퀀싱을 위한 농장별 유방염 원유 시료는 시료별로 동량을 혼합하여 냉동보관 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 커뮤니티 간의 전체 계통 거리는 Fast UniFrac으로 예측하였으며 Principal Coordinate Analysis로 시각화하였다 [11]. 시료 간의 operational taxonomic unit(OTU)를 비교하기 위해 CLcommunity 프로그램의 XOR 분석기술로 공통 OTUs(shared OTUs)를 얻었다 (ChunLab). 이렇게 확보한 데이터를 기초로 유방염 혼합원유와 정상원유 내 마이크로바이옴의 빈도를 비교하였다.
이론/모형
- hydrophila/A. cavieae 11주, Klebsiella oxytoca 6주, Hafnia(H.) alvei 3주 등 총 262주에 대해 겐타마이신, 설파메톡사졸/트라이메토프림, 스트렙토마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 노플록사신, 네오마이신, 클록사실린 항균제 디스크(BD, USA)를 사용하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (USA)에서 제시한 디스크 확산법에 따라 항균제 감수성 검사를 하였다 [6].
- 유전자 추출 및 중합효소연쇄반응은 ChunLab(Korea)에서수행하였다. 원유 내의 전체 미생물 유전체는 원유에 라이소 자임(30 mg/mL; Sigma-Aldrich) 및 mutanolysin 20 U를 첨가하고 37℃에서 60분간 반응시킨 후 QIAamp DNA Stool Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 추출하였다 [5].
- 데이터 분석은 기존의 방법에 따라 수행하였다 [5, 14, 16]. 시료로부터 얻은 리드(reads)는 고유의 바코드에 의해 분류하였고, 바코드, 링커 및 프라이머 염기서열은 제거하였으며, 비특이적인 염기서열을 2개 이상 가지고 있거나 low quality score(average score < 25) 또는 300 염기쌍보다 작은 경우는 분석에서 배제하였다.
- 시료로부터 얻은 리드(reads)는 고유의 바코드에 의해 분류하였고, 바코드, 링커 및 프라이머 염기서열은 제거하였으며, 비특이적인 염기서열을 2개 이상 가지고 있거나 low quality score(average score < 25) 또는 300 염기쌍보다 작은 경우는 분석에서 배제하였다. 키메라 서열은 forward half 와 reverse half 염기서열을 BLASTn 검색으로 비교하는 bellerophone method로 배제하였다 [13]. 각 염기서열의 taxonomic classification을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열의 데이터베이스인 EzBioCloud database(ChunLab)를 사용 하였다.
- 키메라 서열은 forward half 와 reverse half 염기서열을 BLASTn 검색으로 비교하는 bellerophone method로 배제하였다 [13]. 각 염기서열의 taxonomic classification을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열의 데이터베이스인 EzBioCloud database(ChunLab)를 사용 하였다. 시료의 richness and diversity는 Chao1 estimation과 Shannon diversity index(3% distance)로 결정하였고 [11], 시료 간 서로 다른 리드 크기를 비교하기 위해 리드 크기를 동등화하는 무작위 부분추출(random subsampling)을 수행하였다.
- 각 염기서열의 taxonomic classification을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열의 데이터베이스인 EzBioCloud database(ChunLab)를 사용 하였다. 시료의 richness and diversity는 Chao1 estimation과 Shannon diversity index(3% distance)로 결정하였고 [11], 시료 간 서로 다른 리드 크기를 비교하기 위해 리드 크기를 동등화하는 무작위 부분추출(random subsampling)을 수행하였다. 커뮤니티 간의 전체 계통 거리는 Fast UniFrac으로 예측하였으며 Principal Coordinate Analysis로 시각화하였다 [11].
성능/효과
- 배양법에 의한 원인균 동정 결과를 바탕으로 62개 목장의 748개 시료 각각에서 분리 동정된 균종을 목장별 출현 빈도로 Table 1에 제시하였다. 모든 시료에서 2종 이상의 세균의 복합감염이 확인되었고, 그람음성균에 비해 그람양성균의 빈도가 높았으며, Staphylococcus 종, Enterococcus 종, Streptococcus 종, Kocuria 종 순으로 높은 빈도를 보였다. 원인균으로는 E.
- 모든 시료에서 2종 이상의 세균의 복합감염이 확인되었고, 그람음성균에 비해 그람양성균의 빈도가 높았으며, Staphylococcus 종, Enterococcus 종, Streptococcus 종, Kocuria 종 순으로 높은 빈도를 보였다. 원인균으로는 E. faecalis 37.1%, S. aureus 35.5%, S.chromogenes 25.8%, K. rosea 21.0%, S. hemolyticus 14.5%, Streptococcus uberis 14.5%, Streptococcus dysgalactiae ssp.equisimilis 14.5%, A. viridans 9.7%, L. garvieae 8.1%, Dermatococcus nishinomiyaensis 8.1%의 비율로 농장에서 분리되었다. 그람음성균으로는 Escherichia coli 14.
- 유방염 혼합원유 내 마이크로바이옴을 조사하기 위해 16S rRNA 유전자 파이로시퀀싱을 수행하였고, 실험 결과의 재현성을 확인하기 위해 동일 시료에 대해 16S rRNA 유전자 파이로시퀀싱을 반복 실시하였다. 그 결과 세균 종의 빈도와우점 순서가 유사하여 재현성이 확인되었다(Table 2). 유방염 혼합원유에는 Lactococcus 종 29.
- 그 결과 세균 종의 빈도와우점 순서가 유사하여 재현성이 확인되었다(Table 2). 유방염 혼합원유에는 Lactococcus 종 29.7/27.2%(L. raffinolactis20.5/19.1%, L. chungangensis 7.0/6.4%, L. lactis group 2.2/ 1.7%), Enterococcus 종 19.0/19.3%(E. pseudoavium group 15.8/15.9%, E. malodoratus group 3.2/3.4%), Clostridium 종 17.2/15.9%(Clostridium [C.] estertheticum group 15.1/ 13.6%, C. bowmanii 2.1/2.3%), Yersinia 종 5.2/5.0% (Yersinia kristensenii 2.9/2.4%, Yersinia massiliensis 2.3/ 2.6%), Pseudomonas 종 4.8/4.7%(Pseudomonas [P.] gessardii group 2.2/2.9%, P. cedrina group 2.6/1.8%)의 세균들이우점하고 있었으며 유방염과 관련된 것으로 알려진 E.faecalis, E. faecium, S. marcescens 등의 세균들은 1% 미만의 빈도를 보였다. 정상원유의 경우 Sterolibacterium 종4.
- marcescens 등의 세균들은 1% 미만의 빈도를 보였다. 정상원유의 경우 Sterolibacterium 종4.0%, Sulfuritalea 종 6.7%(Sulfuritalea hydrogenivorans 3.5%, Sulfuritalea sp. 3.2%)와 배양되지 않는 세균들이 3% 이하(AM713401 3.0%, JN679120 3.0%, AB186832 2.0%, AB269814 2.0% 등)의 빈도를 보여 특정 세균의 빈도는 높지 않았고, 유방염 원인균으로는 유일하게 S. chromogenes (0.4%)가 검출되었다(Table 2). 유방염 혼합원유와 정상원유에 분포하는 세균들 중에서 Pseudomonas 종의 다양성에 차이가 관찰되었는데 유방염 혼합원유에서 정상원유에 비해 다양한 Pseudomonas 종이 확인되었다.
- 4%)가 검출되었다(Table 2). 유방염 혼합원유와 정상원유에 분포하는 세균들 중에서 Pseudomonas 종의 다양성에 차이가 관찰되었는데 유방염 혼합원유에서 정상원유에 비해 다양한 Pseudomonas 종이 확인되었다.
- 농장에서 의뢰된 유방염 원유를 혼합한 후 농장별로 16S rRNA 유전자 파이로시퀀싱을 수행하여 세균배양 동정법 결과와 비교하였다(Table 3). 그 결과 PMM6 농장의 경우 세균배양법으로는 S. aureus, Serratia liquefaciens group, R.planticola가 동정되었으나 파이로시퀀싱법으로는 Enterobacter aerogenes(7.5%)와 Serratia plymuthica(7.0%)가 높은 빈도를 보였고, S. aureus는 검출되지 않았으나 Serratia liquefaciens group(3.2%)과 R. planticola(0.7%)는 검출되었다. PMM7 농장의 경우 파이로시퀀싱법으로는 P.
- PMM8−PMM12의 각 농장은 P.meridiana(36.9%), P. meridiana group(36.6%), P. caeni(10.3%), P. fragi group(26.2%), P. meridiana group(46.7%)가 상대적으로 높은 우점도를 보였고, 세균배양법과 일부 유사하지만 다른 유방염 동정 결과를 보였다.
- 주요 유방염 원인균 262주의 항생제 내성률을 조사하여 Table 4에 제시하였다. S. aureus 분리주의 경우, 겐타마이신 (37.1%), 설파메톡사졸/트라이메토프림(37.1%), 암피실린 (21.0%), 테트라사이클린(35.5%) 클록사실린(35.5%)에 대해 비교적 낮은 내성률을 보였으나, 스트렙토마이신(87.1%) 및 네오마이신(75.8%)에 대해서는 높은 내성률을 보였으며, 모든 항생제에 내성을 보인 경우(3%)도 있었다. E.
- 8%)에 대해서는 높은 내성률을 보였으며, 모든 항생제에 내성을 보인 경우(3%)도 있었다. E. faecalis (22.7%)와 L. garvieae(23.3%)는 암피실린을 제외한 모든 항생제에 대해 상대적으로 높은 내성률을 보였고, 분리주의 11.4%와 10.0%는 검사한 항생제 모두에 대해 내성을 보였다. S.
- 0%는 검사한 항생제 모두에 대해 내성을 보였다. S. chromogenes(0.0%), K. rosea(7.1%), A. viridans(0.0%)는모두 겐타마이신에 대한 내성률이 가장 낮았고, Streptococcus uberis는 암피실린(4.8%)에 대한 내성률이 가장 낮았다. 그람음성균의 경우 스트렙토마이신, 암피실린, 테트라사 이클린, 클록사실린에 대한 내성률이 비교적 높았으며 Klebsiella oxytoca와 R.
- 8%)에 대한 내성률이 가장 낮았다. 그람음성균의 경우 스트렙토마이신, 암피실린, 테트라사 이클린, 클록사실린에 대한 내성률이 비교적 높았으며 Klebsiella oxytoca와 R. planticola 분리주 66.7%와 14.3%는 모든 항생제에 내성을 보였다. 각 항생제의 평균 내성률을 비교해 보면 노플록사신(31.
- 3%는 모든 항생제에 내성을 보였다. 각 항생제의 평균 내성률을 비교해 보면 노플록사신(31.9%), 겐타마이신(34.5%), 설파메톡사졸/트라이메토프림(42.1%)의 내성률이 비교적 낮았다.
- S. aureus에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 평균 384배, 256배, 192배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. S.
- aureus에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 평균 384배, 256배, 192배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. S. hemolyticus에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 8,192배, 2,048배, 8,192배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. S.
- hemolyticus에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 8,192배, 2,048배, 8,192배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. S. chromogenes에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 3,072배, 1,024배, 2,048배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. Streptococcus uberis에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 192배, 0배, 126배 희석 배수까지 항균효능을 보였다.
- chromogenes에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 3,072배, 1,024배, 2,048배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. Streptococcus uberis에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 192배, 0배, 126배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. L.
- Streptococcus uberis에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 192배, 0배, 126배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. L. garvieae에대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 768배, 512배, 768배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. E.
- garvieae에대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 768배, 512배, 768배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. E. faecalis 에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 48배, 32배, 32배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. K.
- rosea에 대해서는 닭의 난백, 라이소자임, 오리 난백은 각각 4,096배, 2,048배, 2,048배 희석 배수까지 항균효능을 보였다. 따라서 주요 젖소 유방염 원인균에 대해 닭의 난백이 상대적으로 높은 항균 효능을 보였다.
- 또한, 유방염은 개체보다는 우군 단위 즉, 농장 단위에서 관리되는 것이 효율적이라 판단하여 농장별 원인균의 빈도를 조사하였다. 따라서, 본 연구의 원인균 빈도와 기존 연구 결과를 직접 비교하기는 어렵지만, S. aureus와 CNS인 S. chromogenes 및 S. hemolyticus의 빈도가 비교적 높다는 점에서는 유사했고, E. faecalis의 빈도가 가장 높고 대장균의 빈도가 상대적으로 낮은 점과 Streptococcus uberis(14.5%)와 Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis(14.
- 8%) 빈도를 보였다 [24]. 또한, 그람양성균으로 K. rosea, L. garvieae 그리고 그람음성균으로 R. planticola, Klebsiella oxytoca, H. alvei와 같은 원인균이 검출되어 원인균의 다양성 면에서 차이를 보였다. 한편, VITEK 2 System을 이용한 세균 동정과정에서 CNS가 Kocuria 종으로 잘못 동정 되는 경우가 보고된 바 있다 [2].
- 한편, VITEK 2 System을 이용한 세균 동정과정에서 CNS가 Kocuria 종으로 잘못 동정 되는 경우가 보고된 바 있다 [2]. 따라서, Kocuria 종을 CNS로 판단한다면 이전 연구와 마찬가지로 CNS에 의한 유방염이 가장 많은 목장에서 유방염을 일으킨다고 볼 수 있으나 동정 신뢰도 95% 미만인 결과는 포함하지 않아 이러한 가능성은 낮은 것으로 판단된다. 그러나 향후 최적의 분자동정법을 이용한 추가 검증이 필요할 것으로 생각한다.
- 2%로 우점하는 것으로 보고되었다 [32]. 본 연구에서는 S. chromogenes(25.8%)의 빈도가 가장 높아 전국 농장에 대한 연구결과와 차이를 보였지만 경기 북부 및 미국 테네시주의 결과와 유사하여 원인균의 지역적 차이가 있음을 알 수 있었다 [21].
- 유방염 원유의 경우 파이로시퀀싱법과 세균배양법의 결과가 유사하였으나 세균배양법으로 검출되지 않는 병원성 세균들을 포함하여 다양한 마이크로바이옴이 검출되는 것으로 보고되었다 [4, 23]. 본 연구의 유방염 혼합원유는 유산균의 빈도가 가장 높았는데, 정상원유에서 L.lactis의 빈도(70~91%)가 높은 데 비해 유방염 혼합원유에서 L. lactis는 2.0%였고 L. raffinolactis의 빈도(19.8%)가 높았다 [20]. 최근 Lactococcus 종의 유방염 관련성이 보고되고 있는데, 특히 L.
- 0%인 것은 다양한 마이크로바이오타의 상호작용 결과인 것으로 추정되었다 [7]. 정상원유의 경우 유방염과 관련이 없는 환경세균(Sterolibacterium 종, Sulfuritalea 종 등)과 난배양성 세균이 주종을 이루었으며 S. chromogenes만이 낮은 빈도로 검출되었고, 유산균은 검출되지 않아 유방염 혼합원유와 큰 차이를 보였다 [17, 28]. 이러한 결과는 체세포및 세균 수 1등급인 정상원유와 유방염 원유에 존재하는 세균 종 분포의 차이를 극명하게 보여주는 결과이며 향후 세균 수만 1등급인 원유와 마이크로바이옴 비교연구를 통해 국내 원유 내 체세포 수 증가 원인균을 동정하기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
- 이러한 결과는 체세포및 세균 수 1등급인 정상원유와 유방염 원유에 존재하는 세균 종 분포의 차이를 극명하게 보여주는 결과이며 향후 세균 수만 1등급인 원유와 마이크로바이옴 비교연구를 통해 국내 원유 내 체세포 수 증가 원인균을 동정하기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다. 유방염 원유의 원인균을 세균배양법과 파이로시퀀싱법으로 비교한 결과 일부 일치하였으나 파이로시퀀싱법 적용 시 Pseudomonas 종이 대부분의 시료에서 높은 빈도로 검출된 것은 예상하지 못한 결과였다. Pseudomonas 종은 국내 유방염에서 11.
- 유방염 원유의 원인균을 세균배양법과 파이로시퀀싱법으로 비교한 결과 일부 일치하였으나 파이로시퀀싱법 적용 시 Pseudomonas 종이 대부분의 시료에서 높은 빈도로 검출된 것은 예상하지 못한 결과였다. Pseudomonas 종은 국내 유방염에서 11.1%의 빈도를 보이는 것으로 알려져 있으나 본 연구에서는 파이로시퀀싱을 수행한 7개 농장 중 6개 농장에서 우점균으로 검출되었고, 외국의 경우 원인균이 P. aeruginosa인 것과 달리 P.meridiana의 농장별 빈도가 높아 차이를 보였다 [21, 24]. 국가별로 유방염 원인균에는 차이가 있고, 기존 국내 연구결과에서는 파이로시퀀싱법을 사용하지 않아 이러한 차이의 직접적인 원인을 알 수 없으나 유방염 원인균의 배양성 차이와 난배양성 세균과 사균도 검출하는 파이로시퀀싱법의 특징이 결합된 결과로 추정되며, 이러한 결과로 볼 때 앞으로는 P.
- 7%)은 달랐다 [22]. S. aureus는 2012년 분리주의 경우 스트렙토마이신(16.7%), 네오마이신(6.7%), 테트라사이클린(16.7%), 겐타마이신(0%)에 비교적 낮은 내성을 보였으나 암피실린(73.0%)에 대해서는 높은 내성을 보였는데, 본 연구결과에서는 스트렙토마이신(87.1%)과 네오마이신(75.8%)에 대한 내성이 높고 암피실린(21.0%) 내성은 상대적으로 낮아 차이를 보였다 [22]. Escherichia coli는 2001~2004년 분리주의 경우 테트라사이클린(49%), 스트렙토마이신(60%), 암피실린(38%)에 대한 내성이 높았지만, 2012년 분리주의 경우 네오마이신(13.
- 2%)에 대한 내성이 감소한 것으로 보였다. 그러나 본 연구에서는 겐타마이신(44.4%)을 제외한 위의 항생제에 대해 88.9%~100%의 높은 내성을 보였다. 2012년 연구와 본 연구의 결과가 차이를 보이는 이유는 사용되는 항생제 연고의 변화 및 의뢰 농장의 반복적인 항생제 사용의 결과인 것으로 추정되었다 [19, 22].
- 검사한 모든 항생제에 내성을 보인 분리주의 비율이 높았던 E. faecalis(11.4%)의 경우 유방염에서의 빈도가 높으므로 관심이 필요하지만, Klebsiella oxytoca(66.7%), R. planticola(14.3%), L. garvieae(10.0%)에 대해서도 지속적인 항생제 내성 모니터링이 필요한 것으로 판단되었다.
- 5%가 존재하는 것으로 알려져 있다 [1, 18]. 본 연구에서는 난백에서 정제한 라이소자임뿐만아니라 닭과 오리 난백의 항균효능을 측정하였는데, 예상한대로 S. aureus는 192~384배의 희석배수에서, E. faecalis는 48~32배의 희석배수에서 감수성을 보여 높은 내성을 보였다. Streptococcus uberis는 난백에 대해 100배 이상의 희석배수에서 감수성을 보였지만 검사한 최고농도의 라이소자임에 대해서도 감수성이 전혀 없었다.
- faecalis는 48~32배의 희석배수에서 감수성을 보여 높은 내성을 보였다. Streptococcus uberis는 난백에 대해 100배 이상의 희석배수에서 감수성을 보였지만 검사한 최고농도의 라이소자임에 대해서도 감수성이 전혀 없었다. 이에 반해, S.
- Streptococcus uberis는 난백에 대해 100배 이상의 희석배수에서 감수성을 보였지만 검사한 최고농도의 라이소자임에 대해서도 감수성이 전혀 없었다. 이에 반해, S. chromogenes, S. hemolyticus, K. rosea 및 L. garvieae의 경우 라이소자임에 대해 상대적으로 높은 감수성을 보였다. 평가에 사용한 라이소자임은 실제 난백에 존재하는 농도보다 높은 농도를 사용하였는데, 모든 경우에서 닭의 난백이 라이소자임 대비 높은 항균효능을 보였다.
- garvieae의 경우 라이소자임에 대해 상대적으로 높은 감수성을 보였다. 평가에 사용한 라이소자임은 실제 난백에 존재하는 농도보다 높은 농도를 사용하였는데, 모든 경우에서 닭의 난백이 라이소자임 대비 높은 항균효능을 보였다. 이러한 이유는 라이소자임 이외에도 gallin과 같은 항균 펩타이드가 존재하기 때문이며 [10], 유방염 치료에 대한 난백의 잠재적 유용성을 시사하는 부분이다.
후속연구
- 따라서, Kocuria 종을 CNS로 판단한다면 이전 연구와 마찬가지로 CNS에 의한 유방염이 가장 많은 목장에서 유방염을 일으킨다고 볼 수 있으나 동정 신뢰도 95% 미만인 결과는 포함하지 않아 이러한 가능성은 낮은 것으로 판단된다. 그러나 향후 최적의 분자동정법을 이용한 추가 검증이 필요할 것으로 생각한다. CNS의 경우 국가와 지역에 따라 빈발하는 종에 차이를 보이는데 국내 전국 농장의 CNS 빈도는 S.
- chromogenes만이 낮은 빈도로 검출되었고, 유산균은 검출되지 않아 유방염 혼합원유와 큰 차이를 보였다 [17, 28]. 이러한 결과는 체세포및 세균 수 1등급인 정상원유와 유방염 원유에 존재하는 세균 종 분포의 차이를 극명하게 보여주는 결과이며 향후 세균 수만 1등급인 원유와 마이크로바이옴 비교연구를 통해 국내 원유 내 체세포 수 증가 원인균을 동정하기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다. 유방염 원유의 원인균을 세균배양법과 파이로시퀀싱법으로 비교한 결과 일부 일치하였으나 파이로시퀀싱법 적용 시 Pseudomonas 종이 대부분의 시료에서 높은 빈도로 검출된 것은 예상하지 못한 결과였다.
- meridiana의 농장별 빈도가 높아 차이를 보였다 [21, 24]. 국가별로 유방염 원인균에는 차이가 있고, 기존 국내 연구결과에서는 파이로시퀀싱법을 사용하지 않아 이러한 차이의 직접적인 원인을 알 수 없으나 유방염 원인균의 배양성 차이와 난배양성 세균과 사균도 검출하는 파이로시퀀싱법의 특징이 결합된 결과로 추정되며, 이러한 결과로 볼 때 앞으로는 P. aeruginosa 이외의 Psueudomonas 종에 대한 관심이 필요할 것으로 보인다.
- 결론적으로, 주요 원인균을 제외한 유방염 원인균의 빈도는 농장, 국가, 항생제 사용 이력에 따라 차이를 보이고, 파이로시퀀싱법을 사용하여 유방염 원유 내 마이크로바이옴을 연구하는 경우, 더욱 다양한 정보를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한 유방염 원인균에 대한 난백의 감수성을 확인하였고, 기존 항생제에 난백을 병용하는 경우 항생제 내성균 저감에 도움이 될 것으로 기대되나, 난백을 실제 유방염 치료에 이용하기까지는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각한다.
- 결론적으로, 주요 원인균을 제외한 유방염 원인균의 빈도는 농장, 국가, 항생제 사용 이력에 따라 차이를 보이고, 파이로시퀀싱법을 사용하여 유방염 원유 내 마이크로바이옴을 연구하는 경우, 더욱 다양한 정보를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한 유방염 원인균에 대한 난백의 감수성을 확인하였고, 기존 항생제에 난백을 병용하는 경우 항생제 내성균 저감에 도움이 될 것으로 기대되나, 난백을 실제 유방염 치료에 이용하기까지는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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