Probiotic 기능을 가진 미생물을 함유한 양어용 생균제가 넙치의 성장, 선천성면역 및 항병능에 미치는 영향 Effects of Probiotic Microbes on Growth Performance, Innate Immunity, and Pathogen Sensitivity in Cultured Olive Flounder원문보기
생균제는 성장촉진, 면역증진 및 질병예방에서 넙치 Paralichthys olivaceus 치어의 양식에서 우수한 생산효과로 적용될 수 있다. 성장률, 선천성면역 및 항병력을 증강시킬 수 있는 생균제의 효과를 조사하기위해 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 및 Lactobacillus plantarum (BSL-LAB)이 혼합되어있는 생균제와 NBS (nitrifying bacteria con- sortium) 분말을 사료에 첨가 또는 수조에 투입하여 시험을 수행하였다. 생균제 첨가사료는 7주간 투여하였고 3가지의 생균제 조합 시험군 모두에서 넙치의 성장과 항병력에서 대조군에 비해 높은 유효성을 발휘 하였다. 어병세균에 대한 항병력의 긍정적인 결과는 생균제에 대한 면역기능의 향상으로 나타난 효과이며 상기 시험결과로 볼 때, 넙치치어 양식에서 생균제의 혼합첨가는 성장 및 선천성면역 뿐만 아니라 질병저항성에 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
생균제는 성장촉진, 면역증진 및 질병예방에서 넙치 Paralichthys olivaceus 치어의 양식에서 우수한 생산효과로 적용될 수 있다. 성장률, 선천성면역 및 항병력을 증강시킬 수 있는 생균제의 효과를 조사하기위해 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 및 Lactobacillus plantarum (BSL-LAB)이 혼합되어있는 생균제와 NBS (nitrifying bacteria con- sortium) 분말을 사료에 첨가 또는 수조에 투입하여 시험을 수행하였다. 생균제 첨가사료는 7주간 투여하였고 3가지의 생균제 조합 시험군 모두에서 넙치의 성장과 항병력에서 대조군에 비해 높은 유효성을 발휘 하였다. 어병세균에 대한 항병력의 긍정적인 결과는 생균제에 대한 면역기능의 향상으로 나타난 효과이며 상기 시험결과로 볼 때, 넙치치어 양식에서 생균제의 혼합첨가는 성장 및 선천성면역 뿐만 아니라 질병저항성에 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
Probiotic principles can be applied in aquaculture for the purpose of growth and immunity stimulation, disease prevention and eventually better production performance. This study was to assess effects of combinations of microbes containing two Bacillus sp., plus one Lactobacillus sp. as the basal pr...
Probiotic principles can be applied in aquaculture for the purpose of growth and immunity stimulation, disease prevention and eventually better production performance. This study was to assess effects of combinations of microbes containing two Bacillus sp., plus one Lactobacillus sp. as the basal preparation (BSL-LAB), and additional Nitrosomonas sp. (nitrifying bacteria consortium, NBS) in olive flounder (Paralichthys olivaceus). The effects examined were growth parameters, hematologic parameters, innate immunity and pathogen challenge test. Fish were assigned to 4 treatments as Control (no probiotics), Group A (Bacillius and Lactobacillus to culture water), Group B (Bacillius and Lactobacillus both in water and feed), Group C (same as Group B with additional Nitrosomonas in feed). Fish were allocated to the above 4 groups, each group being composed of triplicate 30 fish, for a 7-week feeding in the laboratory. Positive effects were observed both in growth and pathogen sensitivity with all three probiotic combinations. Such effects were attributed to improved innate immune functions. This result indicates that the tested probiotic microbes are beneficial to olive flounder aquaculture.
Probiotic principles can be applied in aquaculture for the purpose of growth and immunity stimulation, disease prevention and eventually better production performance. This study was to assess effects of combinations of microbes containing two Bacillus sp., plus one Lactobacillus sp. as the basal preparation (BSL-LAB), and additional Nitrosomonas sp. (nitrifying bacteria consortium, NBS) in olive flounder (Paralichthys olivaceus). The effects examined were growth parameters, hematologic parameters, innate immunity and pathogen challenge test. Fish were assigned to 4 treatments as Control (no probiotics), Group A (Bacillius and Lactobacillus to culture water), Group B (Bacillius and Lactobacillus both in water and feed), Group C (same as Group B with additional Nitrosomonas in feed). Fish were allocated to the above 4 groups, each group being composed of triplicate 30 fish, for a 7-week feeding in the laboratory. Positive effects were observed both in growth and pathogen sensitivity with all three probiotic combinations. Such effects were attributed to improved innate immune functions. This result indicates that the tested probiotic microbes are beneficial to olive flounder aquaculture.
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문제 정의
sp. 등도 생균제의 중요 성분으로 사용되고 있으며 (Cha et al., 2012) 본 연구에서는 생균제로 주목받고 있는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum 균주 3종과 질화박테리아를 혼합하여 경구투여 및 수중투여로 어류에게 미치는 영향을 평가하였다.
제안 방법
공격시험을 위해 배양액을 멸균 생리식염수로 1×107cfu/mL이 되도록 조절하여 0.1mL씩 복강 주사 (1×106 cfu/fish)하였다.
먼저 hematocrit는 micro- hematocrit법으로 capillary tube에 혈액을 넣고 원심분리기 (HA-200, 한일과학, 강릉)에서 5분간 5,000× g으로 원심 분리 후 혈구부분의 비율을 측정하였다.
사육수조는 278(W) × 75(L) × 55(H) cm 크기의 FRP수조 (수량 200 L 수준으로 유지, 수온 22±2℃, 염도 30 psu)에 지속적으로 폭기하면서 사육하였다. 모든 시험구는 수조당 30마리씩 3반복으로 시행하였으며, 7주간의 성장시험 종료 후, 일부는 혈액과 두신 백혈구 세포에 대한 시험에 나머지는 공격시험을 실시하였다.
성장시험이 종료된 넙치를 군당 10마리씩 임의로 포획하여 AQUI-S®(Lower Hutt, New Zealand)로 마취하고 미부혈관에서 얻은 혈액으로 부터혈청의 분리를 위해 4℃에서 응고시킨 후 3,000 × g에서 10분간 원심분리하였다. 백혈구 분리를 위해 넙치를 개복하여 복막을 제거한 후 두신을 무균적으로 적출하였다. 적출한 두신을 nylon mesh위에서 부드럽게 압착하여 백혈구를 유출하였고 Histopaque1077 (Sigma)을 이용하여 2,500 × g에서 30분간 원심분리하였다 (Secombes et al.
백혈구의 세포 수는 1 × 106 cell/mL로 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)용액에 부유시켜 식세포의 활성산소 생성능 분석에 사용하였다.
, 2012). 분리된 buffy-coat 부근에서 백혈구만을 분리하여 혈구계산판을 이용하여 계수하였다. 백혈구의 세포 수는 1 × 106 cell/mL로 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)용액에 부유시켜 식세포의 활성산소 생성능 분석에 사용하였다.
, 2004). 생균제는 효능 효과에 따라 주로 Lactobacillius, Bacillus 및 Bifidobacterium속 등의 균주를 많이 이용하고 있으며 본 연구에서는 Bacillus subtilis, Bacillus li cheniformis 그리고 Lactobacillus plantarum을 이용하여 제조한 생균제를 어류에 적용하여 어류 성장에 미치는 효과, 선천성면역 및 항병성 등에서의 유용성 유무를 넙치에서 평가하였다.
생균제는 성장촉진, 면역증진 및 질병예방에서 넙치 Paralichthys olivaceus 치어의 양식에서 우수한 생산효과로 적용될 수 있다. 성장률, 선천성면역 및 항병력을 증강시킬 수 있는 생균제의 효과를 조사하기위해 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 및 Lactobacillus plantarum (BSL-LAB)이 혼합되어있는 생균제와 NBS (nitrifying bacteria con- sortium) 분말을 사료에 첨가 또는 수조에 투입하여 시험을 수행하였다.
성장시험이 종료된 넙치를 군당 10마리씩 임의로 포획하여 AQUI-S®(Lower Hutt, New Zealand)로 마취하고 미부혈관에서 얻은 혈액으로 부터혈청의 분리를 위해 4℃에서 응고시킨 후 3,000 × g에서 10분간 원심분리하였다.
시험 사료는 넙치 치어용 펠렛사료 (Fish Top Power No. 5, 우성사료, 대전)를 사용하였고, BSL/LAB를 수조내로 투입하는 경우에는 주 1회씩 별도로 사육수조 내로 투여 (1×1012 cells each/ton)하였다.
2010)분말을(주)제일바이오에서 조제하여 시험에 사용하였다. 시험군의 구성은 먼저, 사료 및 사육수에 BSL/LAB가 첨가되지 않은 대조군을 구성하였고 나머지 시험군은 모두 BSL/LAB를 동량으로 수중투여하고 group A는 일반사료, group B는 BSL/LAB를 사료에 0.05% 첨가, group C는 BSL/LAB를 0.05% 및 NBS를 0.1% 첨가하여 투여하였다 (Table 1). 시험 사료는 넙치 치어용 펠렛사료 (Fish Top Power No.
공격시험 기간 동안 22±2℃의 수온으로 유지하였다. 시험어는 각 군당 20마리씩 3반복으로 시행하였고 14일 동안 누적폐사율을 평가하였다.
시험제제가 일반 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 시험개시 시점과 종료시점에 체중과 사료 소비량을 측정하여 사료계수 (feed-conversion ratio), 일간성장률 (specific growth rate)을 산출하였다.
식세포의 활성산소 생성능은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원능을 이용하여 분석하였다 (Bridle et al., 2005). 넙치 두신에서 분리한 백혈구를 96 well plate에 200 μL씩 분주한 후 120 × g 에서 5분간 원심분리하였다.
6 g의 넙치를 사용하였다. 어류는 실험실 수조에 수용 후 서서히 대조군 사료의 급이량을 증가시키면서 2주간에 걸쳐 순치를 진행하였다. 사육수조는 278(W) × 75(L) × 55(H) cm 크기의 FRP수조 (수량 200 L 수준으로 유지, 수온 22±2℃, 염도 30 psu)에 지속적으로 폭기하면서 사육하였다.
어류의 선천면역계 중 세포성 면역의 일종인 식세포의 활성산소 생성능을 측정하였다. 그 결과, BSL/LAB만 투여한 군 (Group B)과 BSL/LAB과 NBS를 함께 투여한 시험군 (Group C)에서는 대조군과 통계학적으로 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig.
적출한 두신을 nylon mesh위에서 부드럽게 압착하여 백혈구를 유출하였고 Histopaque1077 (Sigma)을 이용하여 2,500 × g에서 30분간 원심분리하였다 (Secombes et al., 1990; Sheikhzadeh et al., 2012).
먼저 hematocrit는 micro- hematocrit법으로 capillary tube에 혈액을 넣고 원심분리기 (HA-200, 한일과학, 강릉)에서 5분간 5,000× g으로 원심 분리 후 혈구부분의 비율을 측정하였다. 적혈구 및 백혈구수의 측정은 Hayem 용액으로 10배와 100배씩 희석하고 Thomas hemocytometer(Marienfeld, Lauda Kӧnigshofen, Germany)에 놓고 광학현미경 (Olympus CX31, Tokyo, Japan)으로 관찰, 계수하였다.
5, 우성사료, 대전)를 사용하였고, BSL/LAB를 수조내로 투입하는 경우에는 주 1회씩 별도로 사육수조 내로 투여 (1×1012 cells each/ton)하였다. 제조한 사료는 일일 투여량을 어체중의 2%로 조절하여 매일 2회에 나누어 7주간 투여하였다.
투여종료 후 일부의 어류를 대상으로 생균제 첨가 사료 투여가 넙치의 항병력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 그람음성 세균인 Edwardsiella tarda KCTC 122679 균주로 공격시험을 하였다. 즉, 시험 균주를 brain-heart infusion 배지에 접종하고 30℃, 48 시간 배양 후 계열희석하여 균수를 측정하였다. 공격시험을 위해 배양액을 멸균 생리식염수로 1×107cfu/mL이 되도록 조절하여 0.
투여종료 후 일부의 어류를 대상으로 생균제 첨가 사료 투여가 넙치의 항병력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 그람음성 세균인 Edwardsiella tarda KCTC 122679 균주로 공격시험을 하였다. 즉, 시험 균주를 brain-heart infusion 배지에 접종하고 30℃, 48 시간 배양 후 계열희석하여 균수를 측정하였다.
혈액학적 측정 항목은 hematocrit, 적혈구수, 백혈구수를 측정하였다. 먼저 hematocrit는 micro- hematocrit법으로 capillary tube에 혈액을 넣고 원심분리기 (HA-200, 한일과학, 강릉)에서 5분간 5,000× g으로 원심 분리 후 혈구부분의 비율을 측정하였다.
대상 데이터
본 연구에서 사용된 미생물은 Bacillus속의 Bacillus subtilis와 Bacillus licheniformis, Lactobacillus속의 Lactobacillus plantarum 균주로 구성되어 제조된 분말 (BSL/LAB)과 nitrifying bacteria con- sortium (Nitrosomonas sp., Kim et al. 2010)분말을(주)제일바이오에서 조제하여 시험에 사용하였다. 시험군의 구성은 먼저, 사료 및 사육수에 BSL/LAB가 첨가되지 않은 대조군을 구성하였고 나머지 시험군은 모두 BSL/LAB를 동량으로 수중투여하고 group A는 일반사료, group B는 BSL/LAB를 사료에 0.
전남 완도 소재 육상 수조식 양식장에서 구입한 평균 어체중 8.2±0.6 g의 넙치를 사용하였다.
데이터처리
데이터를 평균 ± 표준편차 (mean ± S.D.)로 표현하고 시험군간 평균의 통계학적 유의성 검정을 위해 ANOVA분석 후 Newman-Keuls 검정을 post-hoctest로 사용하였다.
이론/모형
혈청의 라이소자임 활성은 turbidometric method를 이용하여 용균능을 분석하였다 (Parry et al., 1965). 즉, 혈청 50 μL와 Micrococcus lysodeikticus(2 mg/mL, Sigma, Tokyo, Japan) 950 μL를 혼합하여 25℃에서 4분 30초간 반응시키면서 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
7주간 투여 후 E. tarda에 대한 공격시험 결과는 대조군의 최종 생존률이 10%인 반면, 생균제 첨가 급이 및 사육수중 투여그룹에서는 모두 40% 이상의 생존율을 보였다. 치어기 넙치사료 내 Bacillus spp.
BSL/LAB과 NBS를 같이 투여한 시험군 (GroupC)에서 최종 체중의 유의성 있는 증가가 관찰되었으며 이 효과는 일간성장률에 반영되었다 (Table 2). 사료계수에서는 통계학적으로 유의성 있는 변화가 나타나지는 않았다.
2b). BSL/LAB을 수중내 투여하면서 일반사료를 급이한 시험군 (Group A)은 대조군과 통계학적으로 유의성 있는 차이가 존재하지는 않았지만, 평균값에서는 증가경향이 확인되었다.
어류의 선천면역계 중 세포성 면역의 일종인 식세포의 활성산소 생성능을 측정하였다. 그 결과, BSL/LAB만 투여한 군 (Group B)과 BSL/LAB과 NBS를 함께 투여한 시험군 (Group C)에서는 대조군과 통계학적으로 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig. 2b). BSL/LAB을 수중내 투여하면서 일반사료를 급이한 시험군 (Group A)은 대조군과 통계학적으로 유의성 있는 차이가 존재하지는 않았지만, 평균값에서는 증가경향이 확인되었다.
본 시험의 결과를 통해 Bacillus속의 Bacillus subtilis와 Bacillus licheniformis, Lactobacillus속의Lactobacillus plantarum 균주와 NBS (nitrifying bacteria consortium)박테리아의 혼합 첨가급이는 넙치 치어의 증체율뿐만 아니라 선천성 면역반응도 증가시켜 E. tarda에 대한 질병저항성을 향상시킴을 관찰하였다. 이런 결과들은 생균제를 어류의 첨가제로 적용한다면 어류 양식생산성에 긍정적인 효과를 얻을 것을 시사한다.
본 연구에서 생균제 및 질화박테리아를 동시에 첨가하여 제조한 사료를 7주동안 경구투여한 시험군 (Group C)의 성장을 대조군에 비해 촉진하였으며 그 결과가 일간성장률 증가로도 관찰되었다. 이는 어류양식에서 사육수중 질소노폐물의 축적은 성장 및 면역에 부적절한 영향을 초래하기 때문에(Snieszko, 1974) 본 연구에서는 질화박테리아의 원활한 질화작용으로 성장률에 긍정적인 영향을 받았다고 생각된다.
생균제 첨가사료는 7주간 투여하였고 3가지의 생균제 조합 시험군 모두에서 넙치의 성장과 항병력에서 대조군에 비해 높은 유효성을 발휘 하였다. 어병세균에 대한 항병력의 긍정적인 결과는 생균제에 대한 면역기능의 향상으로 나타난 효과이며 상기 시험결과로 볼 때, 넙치치어 양식에서 생균제의 혼합첨가는 성장 및 선천성면역 뿐만 아니라 질병저항성에 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
선천성 면역능 측정의 지표인 lysozyme과 식세포 활성산소 생성능 시험의 결과에서, lysozyme의 활성이 모든 생균제 투여군에서 관찰되었다. Ly- sozyme은 어류에서 비특이적 방어기작을 수행하는 대표적인 성분으로 자연계에 넓게 분포하는 효소이다.
병원성 세균 공격시험
시험제제를 투여한 모든 군에서 대조군과 비교하여 Edwardsiella tarda에 의해 유발되는 치사효과에 유의성 있는 방어작용을 발휘하였다 (Fig. 3). 특히 BSL/LAB의 수중내 투여 (Group A)만으로도 대조군에 비해 높은 생존능을 발휘하였다 (45.
어류의 선천면역계 중 체액성 면역의 일종인 라이소자임 활성도를 측정한 결과, 일반사료를 투여한 대조군을 제외한 나머지 시험군 모두 (GroupA, B, C) 통계적으로 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig. 2a).
생균제 첨가사료는 7주간 투여하였고 3가지의 생균제 조합 시험군 모두에서 넙치의 성장과 항병력에서 대조군에 비해 높은 유효성을 발휘 하였다. 어병세균에 대한 항병력의 긍정적인 결과는 생균제에 대한 면역기능의 향상으로 나타난 효과이며 상기 시험결과로 볼 때, 넙치치어 양식에서 생균제의 혼합첨가는 성장 및 선천성면역 뿐만 아니라 질병저항성에 좋은 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
3). 특히 BSL/LAB의 수중내 투여 (Group A)만으로도 대조군에 비해 높은 생존능을 발휘하였다 (45.0% vs 10.0%).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
생균제의 특징은 무엇인가?
생물학적 제제인 생균제를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 생균제는 살아있는 유익미생물이며 섭취에 의하여 숙주동물의 장내 미생물의 균형유지, 장내 유해 세균의 증식억제 및 소화효율 증진 등의 기능을 통하여 가축의 생산성 증가 효과가 있고, 대장에 존재하는 미생물총 중에서 Bifido- bacteria와 Lactobacillius의 성장을 선택적으로 자극하는 것으로 알려져 있다 (Choi et al., 2011).
생균제 (probiotics)가 주목받는 이유는 무엇인가?
우리나라는 지난 40여 년간 급속한 양식기술의 발달로 연안 해역의 양식어장이 급격히 확대되고 있으나 장기적인 어장사용과 시설과다 설치로 어장의 저질노화 및 질병의 빠른 전파로 단위 면적당 생산량 감소로 인한 피해가 증가되고 있어 (NFRDI, 1993), 양식생물의 질병억제를 위해 사용되는 항생제 대신 친환경적이며 숙주의 성장률 및 선천성 면역에 효과가 있다고 알려진 생균제 (probiotics)의 관심이 높아지고 있다 (Fuller, 1989).
FAD에서 인정한 유익 미생물 중 생균제로 사용되는 대표적 세균은 무엇인가?
, 2010; Todorova and Kozhuharova, 2010). Lactobacillus 속 세균은 생균제로 널리 이용되고 있는 대표적인 세균으로 미국식품의약국(FDA)에서 안전하다고 인정한 미생물이며 (Dattaet al., 1995; Leal-Sánchez et al.
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