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문제 정의
- 본 논문에서는 오염물질에 대한 생물독성 및 생물영향평가에 많이 이용되는 해산 요각류의 성장과 분자수준에서의 생체지표를 이용하여 오염의 정도가상이한 퇴적물 시료의 용출수 노출에 따른 생물 영향측정의 가능한지 여부를 확인하고, 이를 바탕으로 향후 퇴적물 평가에 용출수와 실험생물의 활용 방향을 제시하고자 한다.
- 본 논문에서는 오염의 정도가 다른 두 퇴적물 시료의 용출수에 해산 요각류를 노출시켜 개체 및 분자수준에서의 영향을 관찰하였다. 용출수 노출에 대해서는 치사율 관찰이 되지 않았으나 성장 관찰을 위해 유생을 노출 시킨 경우 유생(Nauplius) 1-3 단계에서 탈피 하지 못하고 죽는 개체를 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서는 퇴적물의 생물영향평가를 위한 용출수 노출 실험의 가능성을 평가하고자 오염의 정도가 다른 두 정점의 표층 퇴적물을 이용해 만든 용출수에 해산 요각류를 노출시켜 생물의 개체 및 분자 수준에서 변화를 관찰하였다. 그 결과 유생의 성장과 분자생체지표의 발현에서 오염된 퇴적물의 용출수에서 대조군과 유의한 차이를 보였고 용출수의 희석 정도와 노출 시간에 따라서 농도와 시간 의존적인 발현 경향을 보였다.
제안 방법
- 급·만성 실험에는 100%의 용출수를 이용하여 두 시료를 비교하였으며 성장은 12일간 24시간 간격으로 관찰하였다. 10 개체의 유생을 노출 시켰으며 용출수는 3일에 한 번 교환해 주었다. 먹이는 기존 연구에 따라 성장단계별로 공급하였고 3번 반복 수행하였다(Lee 2004).
- 05). 12일 동안 관찰에서 보여진 유생의 성장 단계별 조성은 N1-N3, N4-N6(유생, Nauplius 1-6), C1-C2(copepodid1-2), C3-C4(copepodid3-4), 성체(adult)의 총 5단계로 나누어 나타내었다(Figure 2). 대조군(control)에 노출된 유생은 12일간의 노출 동안 치사한 개체가 관찰되지 않았으나 실험군(test)에서는 copepodid 단계까지 성장하지 못하고 유생단계에서 죽는 개체를 확인할 수 있었으며, 12일 동안 약 36±11.
- Total RNA는 TRIZOLⓇ 시약을 이용하여 추출하고, 1μg의 RNA를 이용하여 cDNA를 제작하였다(SuperScript III RT kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
- 앞서 준비한 농도가 다른 용출수에 약 500개체를 노출 시켜 24시간째 농도(0, 25, 50, 75, 100%)에 따른 발현 변화를 관찰하였다. 그리고 농도에 따라 유의하게 발현 한 유전자에 대해 추가로 시간에 따른 발현을 확인하기 위해 실험군 시료로 제조한 100%의 용출수에 6, 12, 24, 48시간 동안 요각류를 노출 시킨 후 노출 시간에 따른 RNA 시료를 확보하였다.
- 급·만성 실험에는 100%의 용출수를 이용하여 두 시료를 비교하였으며 성장은 12일간 24시간 간격으로 관찰하였다.
- 이를 위해 150μm mesh사이즈의 체로 알 주머니(egg sac)를 달고 있는 암컷 성체를 제거한 대량의 생물 시료를 확보하여 다시 12시간 동안 배양 후 150 μm mesh사이즈로 여과하여 알을 달고 있는 개체(> 150μm)를 분리, 현미경 하에서 선별하였다. 노출 실험을 위해서는 12-well 배양판(12-well plate)에 용출수 4mL를 실험용량으로 하여 노출 시킨 후 96시간 동안의 치사율을 관찰하였다
- 배양기는 24°C, 12h light/12h dark photoperiod를 유지하였으며, 15 psu (practical salinity unit)의 인공 해수(Instant Ocean Sea Salt, United pet group, Inc. Cincinnati, OH USA)(pH 7.9~8.2)에서 배양하며 먹이로는 조류 Tetraselmis suecica를 공급하였다.
- 시약을 이용하여 추출하고, 1μg의 RNA를 이용하여 cDNA를 제작하였다(SuperScript III RT kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 분자생체지표로는 P.nana에서 기 연구된 12개의 항산화 및 오염물질에 반응하는 유전자를 대상으로 하여 primer를 제작하고 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR, AriaMx Real-TimePCR System G8830A, Serial No. MY15245245, Agilent Technologies)을 수행하였다(Table 1). 분석은 3회 반복하였으며 housekeeping 유전자는 18s rRNA를 이용하였다.
- mRNA발현을 위한 노출 대상은 copepodid와 성체를 이용하였다. 앞서 준비한 농도가 다른 용출수에 약 500개체를 노출 시켜 24시간째 농도(0, 25, 50, 75, 100%)에 따른 발현 변화를 관찰하였다. 그리고 농도에 따라 유의하게 발현 한 유전자에 대해 추가로 시간에 따른 발현을 확인하기 위해 실험군 시료로 제조한 100%의 용출수에 6, 12, 24, 48시간 동안 요각류를 노출 시킨 후 노출 시간에 따른 RNA 시료를 확보하였다.
- 요각류의 성장 실험은 유생을 이용하여 수행하였다. 유생시료 확보를 위해서 급성실험을 위한 암컷 성체 확보 단계와 같은 절차를 거쳐 생애 첫 번째 알주머니를 가진 암컷 성체를 분리하고 이로부터 부화한 지 12시간 미만의 유생을 선별하여 이용하였다.
- 용출수 준비를 위한 오염 퇴적물과 대조군 퇴적물 시료는 동결 건조하여 냉동 보관하였고(-20°C), USEPA에서 제시하는 방법과 최근 연구 논문을 바탕으로 수정하여 제조하였다(USEPA 1991; Novelli et al. 2006).
- 실험과정 동안 용출수는 필요 시 마다 새롭게 제조하여 이용하였다. 용출수의 생물영향을 확인하기 위하여 퇴적물을 이용하여 준비한 용출수를 100%로 하고, 필요 시 인공 해수와 혼합된 25%, 50%, 75%의 용출수를 만들었다
- 2μm의 membrane filter를 이용하여 부유 입자를 제거하였다(Figure 1). 용출수의 염분은 염분 측정 굴절계(ATAGO, MASTER-S28M, Japan)를 이용하여 측정 후 실험생물을 유지한 환경과 동일하도록 고염분(80psu)으로 제조된 stock solution소량을 첨가하여 15psu로조절하였다. 실험과정 동안 용출수는 필요 시 마다 새롭게 제조하여 이용하였다.
- 요각류의 성장 실험은 유생을 이용하여 수행하였다. 유생시료 확보를 위해서 급성실험을 위한 암컷 성체 확보 단계와 같은 절차를 거쳐 생애 첫 번째 알주머니를 가진 암컷 성체를 분리하고 이로부터 부화한 지 12시간 미만의 유생을 선별하여 이용하였다. 알을 가진 암컷 성체만을 분리하여 12시간 이후 100μm mesh 사이즈의 체로 분리하여 체를 통과한 유생을 분리하였다.
- 이를 위해 150μm mesh사이즈의 체로 알 주머니(egg sac)를 달고 있는 암컷 성체를 제거한 대량의 생물 시료를 확보하여 다시 12시간 동안 배양 후 150 μm mesh사이즈로 여과하여 알을 달고 있는 개체(> 150μm)를 분리, 현미경 하에서 선별하였다.
- 퇴적물 용출수에 노출된 요각류의 생체지표 분석을 위해 기존 연구에서 발표된 항산화효소 및 환경 스트레스에 대해 발현하여 생체지표 가능성이 판단되었던 유전자를 선별하였다(Table 1). mRNA발현을 위한 노출 대상은 copepodid와 성체를 이용하였다.
- 해산 요각류 P. nana의 분자생체지표는 산화스트레스에 대한 반응, 단백질 샤페론 기능에 관여하는 열충격 단백질(heat shock protein), Phase I 관련 CYP450 효소로 나누어 그 발현 변화를 확인하였다. 실험군의 요각류는 대부분의 모든 유전자에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Figure 3, p<0.
대상 데이터
- 퇴적물 용출수에 노출된 요각류의 생체지표 분석을 위해 기존 연구에서 발표된 항산화효소 및 환경 스트레스에 대해 발현하여 생체지표 가능성이 판단되었던 유전자를 선별하였다(Table 1). mRNA발현을 위한 노출 대상은 copepodid와 성체를 이용하였다. 앞서 준비한 농도가 다른 용출수에 약 500개체를 노출 시켜 24시간째 농도(0, 25, 50, 75, 100%)에 따른 발현 변화를 관찰하였다.
- 급성 노출 실험에는 2세대 배양을 거쳐 생애 첫 번째 알을 가진 성체 암컷을 이용하였다. 이를 위해 150μm mesh사이즈의 체로 알 주머니(egg sac)를 달고 있는 암컷 성체를 제거한 대량의 생물 시료를 확보하여 다시 12시간 동안 배양 후 150 μm mesh사이즈로 여과하여 알을 달고 있는 개체(> 150μm)를 분리, 현미경 하에서 선별하였다.
- 그러나 대조군 퇴적물(control)에서는 대부분의 유전자에서 농도에 따른 유의한 차이를 보이지 않았다. 시간에 따른 mRNA 수준에서의 발현 변화는 농도에 대한 실험에서 유의한 증가를 보이는 4개의 유전자(hsp70, CuZn-SOD, GST-omega, CYP3027F1)에 대해 실험군 시료를 대상으로 분석하였다. 모든 지표 유전자에서 시간 유의하게 증가하는 경향을 보였다(Figure 4).
- 실험에 이용한 해산 요각류 P. nana는 현장에서 채집, 분리하여 약 4년간 한국해양과학기술원 생물 배양실에서 유지하였다. 배양기는 24°C, 12h light/12h dark photoperiod를 유지하였으며, 15 psu (practical salinity unit)의 인공 해수(Instant Ocean Sea Salt, United pet group, Inc.
- 퇴적물은 오염 우려 지역인 시화호 상류 정점의 표층 퇴적물(Test, T)과 대조군 시료로 시화호 외측(Control, C)의 표층 퇴적물을 이용하였다. 많은 이전 연구에서 시화호 내측과 외측에서의 퇴적물 내 오염물질(중금속, PAH, PCDD/F) 농도가 유의하게 차이 난다고 보고 된 바 있으며(Shin 2008, Ra et al.
데이터처리
- Significant differences according to the exposure times were analyzed by ANOVA(Tukey’s post hoc test; p < 0.05).
- 결과는 평균과 표준편차로 표시하였다. 결과의 등 분산검정에는 Levene 검정법을 이용하였으며, 농도 및 시간에 따른 평균 비교는 Tukey의 사후검정 분석을 따랐다(one-way ANOVA, p<0.
- 결과의 등 분산검정에는 Levene 검정법을 이용하였으며, 농도 및 시간에 따른 평균 비교는 Tukey의 사후검정 분석을 따랐다(one-way ANOVA, p<0.05).
- 오염의 정도가 다른 두 정점의 퇴적물 노출에 대한 성장 및 분자생체지표의 발현 차이는 student t-test를 이용하였다(p<0.05).
이론/모형
- 발현량은2-△△Ct method를 이용하여 계산하였다(Livak & Schmittgen 2001).
성능/효과
- 본 실험에서는 퇴적물의 생물영향평가를 위한 용출수 노출 실험의 가능성을 평가하고자 오염의 정도가 다른 두 정점의 표층 퇴적물을 이용해 만든 용출수에 해산 요각류를 노출시켜 생물의 개체 및 분자 수준에서 변화를 관찰하였다. 그 결과 유생의 성장과 분자생체지표의 발현에서 오염된 퇴적물의 용출수에서 대조군과 유의한 차이를 보였고 용출수의 희석 정도와 노출 시간에 따라서 농도와 시간 의존적인 발현 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 용출수를 이용한 생물영향평가의 가능성을 보여주며, 향후 퇴적물의 오염 및 생물영향평가에 있어 오염물질의 정량적 분석 방법과 함께 보완적인 방법으로 이용 될 수 있을 것이라 사료된다.
- 논문에서 비록 용출수에서 오염물질의 농도를 분석하여 생물 반응과 직접 비교하지는 않았으나 실험군과 대조군 시료에서의 생물 반응 차이를 통해 오염된 퇴적물의 용출수 오염에 대한 생물 반응이 오염을 비교하고 생물 영향을 추정하는 데에 화학적인 분석의 보완적인 방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 실제로 용출수를 이용한 연구들에서는 그 제조 방법에 따라 또는 오염물질의 존재 형태에 따라 용출수의 오염물질 농도가 다를 수 있음을 언급하였다(Nam & An 2014).
- 대조군(control)에 노출된 유생은 12일간의 노출 동안 치사한 개체가 관찰되지 않았으나 실험군(test)에서는 copepodid 단계까지 성장하지 못하고 유생단계에서 죽는 개체를 확인할 수 있었으며, 12일 동안 약 36±11.5%의 치사율을 보였다.
- 실험군은 대조군에 비해 1~2일가량의 저해된 성장률을 보였고 성체까지 성장 개체의 비율은 대조군에서는 78.6±2.1%, 실험군에서는 68.4±1.5%로 유의한 차이를 보였다(Figure 2, p<0.05).
- 05). 특히, GST-omega는 최대 3배의 발현 증가를 보였으며, 그 밖에도 CuZn-SOD, hsp70,CYP450 유전자는 1.5배 이상의 증가를 보였다. 그러나 대조군 퇴적물(control)에서는 대부분의 유전자에서 농도에 따른 유의한 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 용출수를 이용한 생물영향평가의 가능성을 보여주며, 향후 퇴적물의 오염 및 생물영향평가에 있어 오염물질의 정량적 분석 방법과 함께 보완적인 방법으로 이용 될 수 있을 것이라 사료된다. 그러나 다양한 연구 사례를 바탕으로 보았을 때 용출수를 이용한 기존 연구에서의 용출수 제작 방법(퇴적물 대 용매의 비율, 혼합방법, 시간, 광주기, 분리방법, 여과 및 원심분리 속도 등)이 다양하고 시료에 존재하는 오염물질의 존재 형태에 따라 용출수의 화학적 조성에 가변성이 있을 수 있기 때문에 보다 많은 자료의 축적을 통해 향후 활용성에 대한 평가와 활용 기준이 제시되어야 한다고 판단된다.
- 또한, 오염의 생물 영향 경로가 수계를 통한 노출(water phase exposure)로 제한된다는 점을 감안하여 볼 때 실제 퇴적물에 서식하고 섭식을 통한 노출 가능성이 있는 생물에 대해서는 더 큰 영향이 있을 수 있을 수 있다고 예측된다. 그리고 오염물질의 존재와 결합 형태에 따라 퇴적물에서 물 층으로 용출될 수 있는 부분이 달라질 수 있기 때문에 이에 대한 정확한 판단을 위해서는 퇴적물 시료의 전함량 분석이 아닌 생물이용성을 고려한 화학 분석 결과가 함께 비교되어야 할 필요성이 있을 것으로 판단된다.
- 2012b). 따라서 용출수를 이용한 실험 결과는 퇴적물에 존재하는 오염물질이 특정 조건에서 생물에게 미칠 수 있는 복합적인 영향을 보여주어 영향 기반 모니터링(effect-based monitoring)기법을 위한 매체로서의 활용 가능성을 보여준다. 실제로 퇴적물의 용출수와 패시브 샘플러(passive sampler)의 추출물을 이용한 생물평가에서 퇴적물에서 정성 및 정량평가를 하지 않은 생물 영향 물질에 대한 가능성을 평가할 수 있음이 시사된 바 있다(Vathaak et al.
- 실제 용출수를 이용한 유사 연구들이 퇴적물과 수분의 함량비, 용출 단계의 속도, 온도, 여과 여부 등에 다양한 기준을 가지고 적용하고 있기 때문에 이러한 실험적 가변성이 퇴적물의 물리화학적 특징에 따라 용출수의 오염물질 농도에 영향을 미칠 수 있음을 간과해서는 안 될 것이다. 또한, 오염의 생물 영향 경로가 수계를 통한 노출(water phase exposure)로 제한된다는 점을 감안하여 볼 때 실제 퇴적물에 서식하고 섭식을 통한 노출 가능성이 있는 생물에 대해서는 더 큰 영향이 있을 수 있을 수 있다고 예측된다. 그리고 오염물질의 존재와 결합 형태에 따라 퇴적물에서 물 층으로 용출될 수 있는 부분이 달라질 수 있기 때문에 이에 대한 정확한 판단을 위해서는 퇴적물 시료의 전함량 분석이 아닌 생물이용성을 고려한 화학 분석 결과가 함께 비교되어야 할 필요성이 있을 것으로 판단된다.
- 실제로 용출수를 이용한 연구들에서는 그 제조 방법에 따라 또는 오염물질의 존재 형태에 따라 용출수의 오염물질 농도가 다를 수 있음을 언급하였다(Nam & An 2014). 이번 실험 역시 용출수 제작을 통한 노출은 유기오염물질의 분배계수(log Kow)에 따라 수층으로의 용출 정도가 다를 수 있을 것이기에 해산 요각류에서 관찰된 이러한 생체지표의 변화는 용출수에 존재하는 다양한 오염물질이 미치는 복합적인 영향으로 해석해 볼 수 있다. 이는 용출수를 이용한 실험이 오염물질에 대한 단독적인 평가로 이어지는 데에 있어서의 한계를 가지며 매체에 대한 평가 방법의 하나로 이용되어야 함을 보여준다.
- 그 결과 유생의 성장과 분자생체지표의 발현에서 오염된 퇴적물의 용출수에서 대조군과 유의한 차이를 보였고 용출수의 희석 정도와 노출 시간에 따라서 농도와 시간 의존적인 발현 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 용출수를 이용한 생물영향평가의 가능성을 보여주며, 향후 퇴적물의 오염 및 생물영향평가에 있어 오염물질의 정량적 분석 방법과 함께 보완적인 방법으로 이용 될 수 있을 것이라 사료된다. 그러나 다양한 연구 사례를 바탕으로 보았을 때 용출수를 이용한 기존 연구에서의 용출수 제작 방법(퇴적물 대 용매의 비율, 혼합방법, 시간, 광주기, 분리방법, 여과 및 원심분리 속도 등)이 다양하고 시료에 존재하는 오염물질의 존재 형태에 따라 용출수의 화학적 조성에 가변성이 있을 수 있기 때문에 보다 많은 자료의 축적을 통해 향후 활용성에 대한 평가와 활용 기준이 제시되어야 한다고 판단된다.
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