선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- , 2006). 본 연구에서는 국내 최초로 환자의 피부 병소로부터 N. takedensis를 분리, 동정한 경험을 보고함으로써, 임상미생물 검사실에서 N. takedensis를 분리 동정하는 데 필요한 실질적인 기초 자료를 제시하고자 한다.
- 본 연구에서는 한국에서 임상환자로부터 N. takedensis의 분리 경험을 통해 배양배지에서 집락 특징과 배양 시간에 따른 배지에서의 형태적 특성, 배지에 따른 염색에서 균의 형태, 생화학적 시험의 특징, 약제 감수성 검사 등 임상미생물 검사실에서 이 세균을 분리 동정할 때 도움이 될 수 있는 여러 가지 기초 자료들을 정리하였다. 이러한 기초적인 정보들은 추후 임상에서 분리 동정 될 수 있는 N.
- takedensis를 분리하였고, 16S rRNA sequencing 기법을 이용, 최종 동정하였다. 본 증례를 통해 N. takedensis 균의 형태, 집락의 성상, 생화학적 특성, 항균제 감수성 패턴 등을 보고 하고, 향후 임상미생물 검사실 에서 N. takedensis 균을 분리 동정할 때, 도움이 될 수 있는 자료들을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 를 종(species) 수준까지 확진하기 위해 16S rRNA gene을 이용하여, 염기서열 분석(sequencing)을 실시하였다. 5% SBAP, chocolate agar에서 배양, 분리된 순수한 집락으로부터 추출한 genomic DNA를 template DNA 로 사용하였으며, 16S rRNA gene을 타겟으로 하여 중합 효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 얻어진 증폭산물을 염기서열 분석을 하였다.
- Casein, tyrosine, xanthine 등의 분해 능을 보기 위한 실험 에서는 상품화된 배지(Nocardia ID Quad plate)의 국내 반입이 쉽지 않아, 직접 배지를 제조하여 실험을 진행하였다. 이러한 기질들을 이용하는 균들은 균 주위 집락 주변에 투명한 후광(halo)이 나타났으며(Fig.
- 그람염색과 AFB 염색은 5% SBAP에서 배양된 순수 집락을 선택 도말한 슬라이드와 thioglycollate broth에서 배양된 균주를 도말한 슬라이드를 염색한 후, 현미경으로 검경하여 비교 관찰하였다. 그 결과, 모두 긴 형태의 그람양성 막대균 모양을 관찰할 수 있었고(Fig.
- 그리고 Sensitire panel를 이용 Broth microdilution method Kit에 각각 100 μL씩 분주한 후, kit well을 전용 필름으로 덮고 35℃, 산소환경에서 3일간 배양 후, 결과를 확인하였다.
- 그리고 Sensitire panel를 이용 Broth microdilution method Kit에 각각 100 μL씩 분주한 후, kit well을 전용 필름으로 덮고 35℃, 산소환경에서 3일간 배양 후, 결과를 확인하였다. 디스크 확산법은 5일간 배양한 N. takedensis 균주를 멸균 증류수에 균을 풀어 0.5 MacFarland 농도를 맞춘 후, 5% SBAP와 Muller Hinton agar 배지에 접종하여 디스크를 놓고 35℃, 산소환경에서 3일, 5일 배양 후, 결과를 확인하였다.
- 6-Dhydroxypurine, Sigma, Germany), Citrate 시험은 직접 배지를 제조하여 검사를 시행하였고, Urease 검사는 API 20E kit (bioMerieux, France)를 사용하였다. 또한, 카탈라아제 시험(Catalase test)과 MIO (Motility, indole, ornithine) 배지를 이용한 운동성 시험, 옥시다아제 시험 (Oxidase test) 등을 시행하였다.
- Norcardia spp.를 종(species) 수준까지 확진하기 위해 16S rRNA gene을 이용하여, 염기서열 분석(sequencing)을 실시하였다. 5% SBAP, chocolate agar에서 배양, 분리된 순수한 집락으로부터 추출한 genomic DNA를 template DNA 로 사용하였으며, 16S rRNA gene을 타겟으로 하여 중합 효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 얻어진 증폭산물을 염기서열 분석을 하였다.
- 본 연구에서는 한국에서 처음으로 환자의 팔 주변 병소의 검체를 배양하여 N. takedensis를 분리하였고, 16S rRNA sequencing 기법을 이용, 최종 동정하였다. 본 증례를 통해 N.
- 생화학적 시험을 위한 Casein, L-Tyrosin (Sigma, Germany), Xanthine (2.6-Dhydroxypurine, Sigma, Germany), Citrate 시험은 직접 배지를 제조하여 검사를 시행하였고, Urease 검사는 API 20E kit (bioMerieux, France)를 사용하였다. 또한, 카탈라아제 시험(Catalase test)과 MIO (Motility, indole, ornithine) 배지를 이용한 운동성 시험, 옥시다아제 시험 (Oxidase test) 등을 시행하였다.
- 실험에는 5% sheep blood agar plate(이하 5% SBAP), chocolate agar, thioglycollate broth, 3% Ogawa 배지, MacConkey agar 배지를 사용하였고, 35℃, 5% CO2 조건하에서 배양한 후, 시간에 따라 최대 5주간 발육하는 집락의 형태학적 성상을 관찰하였다.
- 모든 염색은 제공된 시약업체가 추천하는 표준법에 의거해 수행하였다. 현미경 검경을 통해 균의 염색성과 형태학적 특징을 관찰하였으며, 배지에서 자란 집락과 thioglycollate broth에서 자란 균을 도말하여, 각각의 형태학적 특징들을 비교 관찰하였다.
- 이 이온들을 전기장으로 가속시킨 후진공 상태에서 1 m 거리의 flight tube를 비행하여 검출기에 도달하도록 한다. 후에 각각의 이온들이 검출기에 도달하는데 걸린 시간을 분자량으로 환산하여 분석하고자 하는 균주를 동정해 낸다. 이번 실험에서는 VITEK MS -Mycobacteria / Nocardia spp.
대상 데이터
- 대조군으로 Streptomyces spp.(임상 균주)와 N. farcinica (The Korean Association of Quality assurance for Clinical Laboratory sample: MI113)을 사용하였다(Fig. 5(A)-a, (B)-a, and (C)-a), (Table 1).
- This study was supported by BB21 (Brain Busan21), Republic of Korea.
- 부산지역 모 병원에 입원 중인 환자의 팔 주위 피부 병소에서, 3일 간격으로 1, 2회차 배양 의뢰된 각 검체로부터 균을 분리하였고, 16S ribosomal RNA(이하 rRNA) gene 을 이용하여 N. takedensis로 최종 동정된 균주(Genbank of the National Center for Biotechnology Information strain WE30 : 99.56% 일치)를 본 연구의 실험 균주로 사용하였다.
- 염색시약은 Gram stain kit(영동제약, Korea)와 Acid-fast bacilli (AFB) stain kit(Ziehl-Neelsen, 영동제약, Korea)를 사용하였다. 모든 염색은 제공된 시약업체가 추천하는 표준법에 의거해 수행하였다.
이론/모형
- 항균제 감수성 검사는 Broth Microdilution Method Kit (Thermo Scientific Sensititre Rapid and Slow growing mycobacterium MIC plates, USA)와 디스크 확산법(disk diffusion test)을 사용하여 결과를 비교하였다. Broth microdilution method를 활용한 MIC (minimum inhibitory concentration)의 측정방법은 아래와 같이 수행하였다. 5% SBAP에서 5일정도 배양한 N.
- VITEK MS (bioMerieux, France: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) system 을 이용하였다. 방법의 일반적인 검사원리는 다음과 같다.
- 이번 실험에서는 VITEK MS -Mycobacteria / Nocardia spp. kit를 이용하여 제조사의 지침에 준하여 검사를 수행하였다.
- 염색시약은 Gram stain kit(영동제약, Korea)와 Acid-fast bacilli (AFB) stain kit(Ziehl-Neelsen, 영동제약, Korea)를 사용하였다. 모든 염색은 제공된 시약업체가 추천하는 표준법에 의거해 수행하였다. 현미경 검경을 통해 균의 염색성과 형태학적 특징을 관찰하였으며, 배지에서 자란 집락과 thioglycollate broth에서 자란 균을 도말하여, 각각의 형태학적 특징들을 비교 관찰하였다.
- 항균제 감수성 검사는 Broth Microdilution Method Kit (Thermo Scientific Sensititre Rapid and Slow growing mycobacterium MIC plates, USA)와 디스크 확산법(disk diffusion test)을 사용하여 결과를 비교하였다. Broth microdilution method를 활용한 MIC (minimum inhibitory concentration)의 측정방법은 아래와 같이 수행하였다.
- 항균제 감수성 검사는 Sensitire panel를 이용한 broth microdilution method를 이용하여 검사를 시행하였다. Clinical and Laboratory Standard lnstitute (CLSI) guideline에 따라 감수성을 확인한 결과, amoxicillin/clavulanic acid, ciprofloxacin은 내성 clarithromycin, imipenem은 중간내성을 보였고 나머지 약제에는 모두 감수성을 보였다.
성능/효과
- brasiliensis에 비해 매우 작고, 배지를 파고 드는 듯한 거친 과립상의 특징을 보였다. 2주 동안의 추가 배양 후에는 배지 주변으로 뻗어나는 하얀색의 공기균사를 볼 수가 있었고, 3~4주 동안의 추가 배양을 수행한 결과, 하얀색의 공기균사가 집락 표면을 덮어버리는 것이 특징으로 나타났다.
- 배양 시간을 연장하면 선명한 카로틴 색소의 많은 균체들이 기벽에 붙어서 자라는 것을 볼 수 있었다. 3% Ogawa 배지에서는균 계대 배양 3일이 지난 후, 집락 형태가 관찰되었고, 1주일 추가 배양 시, 둥근 모양의 짙은 카로틴 색의 집락 들을 확인할 수 있었다. 이러한 집락 특징들은 카로틴 색소를 띄는 NTM (Non-tuberculous mycobacteria) 균종들과 유사한 형태를 보였다(Fig.
- 5% SBAP, chocolate agar, thioglycollate broth에 균을 접종 하고 35℃, CO2 조건하에서 3~4일 배양한 결과, 0.2~0.3mm 정도의 아주 작은 집락을 확인하였으나, 색소는 육안 으로 관찰할 수 없었다. 5일 추가 배양 후에는 카로틴 색소를 띈(Fig.
-
5% SBAP에서 자란 순수 집락으로 카탈라아제 시험과 옥시다아제 시험을 수행하였고, 그 결과 카탈라아제 양성, 옥시다아제 음성의 결과를 보였다. 또한, MIO 배지에서
- CLSI (Clinical and Laboratory Standard lnstitute) guideline (2007)에 따라서 항균제 감수성 결과를 확인한 결과, broth microdilution method에서는 amoxicillin/clavulanic acid, ciprofloxacin은 내성, clarithromycin, imipenem은 중간내성을 보였고, 나머지 약제에 대해서는 모두 감수성 결과를 보였다. 디스크 확산 검사는 5% SBAP와 Mueller Hinton agar 에서 함께 실험을 수행하였으나, Mueller Hinton agar에서는 균의 발육이 불량하여 결과를 최종 판독하지 못하였다(Table 2).
- 항균제 감수성 검사는 Sensitire panel를 이용한 broth microdilution method를 이용하여 검사를 시행하였다. Clinical and Laboratory Standard lnstitute (CLSI) guideline에 따라 감수성을 확인한 결과, amoxicillin/clavulanic acid, ciprofloxacin은 내성 clarithromycin, imipenem은 중간내성을 보였고 나머지 약제에는 모두 감수성을 보였다. Mueller-Hinton agar와 5% SBAP를 사용하여 디스크 확산 검사도 함께 수행해 보았으나 일부 논문에 나와 있는 Nocardia 균종의 약제 감수성 결과와는(Park et al.
- N. takedensis는 다른 Nocardia 균종들처럼 아주 느리게 성장하기 때문에 환자의 검체에서 직접 배양 시에는 최소 3~5일 정도 배양해야 육안적으로 집락의 형태를 볼수 있었다. 집락은 N.
- 3A, 3B, and 3C). TSI (Triple sugar iron)와 citrate 검사에서는 결과가 모두 음성, urease 검사에서는 양성 결과가 도출되었다(Fig. 3C and 3D).
- 그람염색과 AFB 염색은 5% SBAP에서 배양된 순수 집락을 선택 도말한 슬라이드와 thioglycollate broth에서 배양된 균주를 도말한 슬라이드를 염색한 후, 현미경으로 검경하여 비교 관찰하였다. 그 결과, 모두 긴 형태의 그람양성 막대균 모양을 관찰할 수 있었고(Fig. 4), Ziehl-Neelsen 법을 이용한 AFB 염색상에서는 부분적으로(partially) acidfast bacilli를 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 그람염색 상에서는 5% SBAP 얻어진 순수 집락을 도말한 슬라이드보다 thioglycollate broth에서 배양된 균주를 이용한 슬라이드에서 N. takedensis의 가지 친 긴 형태의 그람양성 막대균 모양이 더 선명하게 확인되었다(Fig. 4). AFB 염색에서는 그람염색 상에서 보인 가지 친 형태의 그람양성 막대균이 아닌 짧은 막대균이 뭉쳐 있는 것을 확인할 수 있었고(Fig.
- Chloramphenicol를 첨가한 SDA (Sabouraud dextrose agar) 배지에서는 발육이 거의 되지 않았다. 그러나 chloramphenicol을 첨가하지 않은 배지에서는 노란색의 집락이 느리게 발육하는 것을 확인할 수있었고, MacConkey agar에서는 발육이 확인되지 않았다.
- 다만 항균제 디스크 zone 크기와 비교해 보면 broth microdilution method와 대체로 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Table 2).
-
5% SBAP에서 자란 순수 집락으로 카탈라아제 시험과 옥시다아제 시험을 수행하였고, 그 결과 카탈라아제 양성, 옥시다아제 음성의 결과를 보였다. 또한, MIO 배지에서
운동성의 유무와 인돌 생성능을 확인한 검사에서는 모두 음성 결과가 도출되었다(Fig. 3A, 3B, and 3C). TSI (Triple sugar iron)와 citrate 검사에서는 결과가 모두 음성, urease 검사에서는 양성 결과가 도출되었다(Fig. - 3E) 둥근 모양의 작은 집락을 확인할 수 있었다. 배양 2주 후에는 배지를 파고드는 듯한 건조한 느낌의 둥근 집락과 함께 그 주변으로 약하게 생성된 공기 균사를 확인할 수 있었고, 배양 3주 후에는 집락 주변으로 뻗어나가는 하얀색의 공기균사를 볼 수 있었다. 그리 고 4~5주 후에는 집락 가장자리에 하얀색의 공기균사들이 집락 주변을 감싸며 뻗어나가고, 둥근 모양의 집락을 덮어 버리는 현상도 확인할 수 있었다(Fig.
- 를 종(species) 수준까지 확진하기 위해 16S rRNA gene을 이용하여, 염기서열 분석(sequencing)을 실시하였다. 염기서열을 GenBank sqeuence database의 BLAST Similarity searching program으로 비교하였을 때 GenBank accession number: WE30 N. takedensis와 688 bp 부분이 99.56%가 일치하여, N. takedensis로 최종 동정되었다.
- takedensis는 다른 Nocardia 균종들처럼 아주 느리게 성장하기 때문에 환자의 검체에서 직접 배양 시에는 최소 3~5일 정도 배양해야 육안적으로 집락의 형태를 볼수 있었다. 집락은 N. brasiliensis와 비슷하나 카로틴 색소 (주황색)가 더 선명하고 크기가 N. brasiliensis에 비해 매우 작고, 배지를 파고 드는 듯한 거친 과립상의 특징을 보였다. 2주 동안의 추가 배양 후에는 배지 주변으로 뻗어나는 하얀색의 공기균사를 볼 수가 있었고, 3~4주 동안의 추가 배양을 수행한 결과, 하얀색의 공기균사가 집락 표면을 덮어버리는 것이 특징으로 나타났다.
- takedensis로 최종 동정 후에 여러 실험을 통해 저자가 비교 배양한 결과, CO2 환경 하에서도 무리 없이 발육이 잘되었다. 특히, thioglycollate broth 표면에 균들이 뭉쳐서 발육하고 시간이 흐르면서 기벽으로 공기균 사가 뻗어 올라가는 것을 볼 수 있었고, 카로틴 색소 형성도 잘 나타났다. 그러나 기존의 연구들에서 N.
후속연구
- takedensis의 분리 경험을 통해 배양배지에서 집락 특징과 배양 시간에 따른 배지에서의 형태적 특성, 배지에 따른 염색에서 균의 형태, 생화학적 시험의 특징, 약제 감수성 검사 등 임상미생물 검사실에서 이 세균을 분리 동정할 때 도움이 될 수 있는 여러 가지 기초 자료들을 정리하였다. 이러한 기초적인 정보들은 추후 임상에서 분리 동정 될 수 있는 N. takedensis 균주에 대한 진단 및 치료에 있어 많은 도움이 되리라 기대한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.