Inflammation is a pathophysiological process that is known to be involved in numerous diseases. Microbial infection or tissue injury activates inflammatory responses, resulting in the induction of proinflammatory proteins including inducible nitric oxide synthase (iNOS). Aster yomena is used in trad...
Inflammation is a pathophysiological process that is known to be involved in numerous diseases. Microbial infection or tissue injury activates inflammatory responses, resulting in the induction of proinflammatory proteins including inducible nitric oxide synthase (iNOS). Aster yomena is used in traditional Korean remedies. Here, we investigated the effects of ethanol extracts of Aster yomena (EAY) on the expression of iNOS induced by ovalbumin (OVA), one of the major egg allergens, or lipopolysaccharide (LPS), a Toll-like receptor 4 agonist. EAY inhibited OVA- or LPS-induced $NF-{\kappa}B$ activation. EAY also suppressed OVA- or LPS-induced iNOS expression and nitrite production. These results suggest that EAY has the specific mechanism for anti-inflammatory responses and the potential to be developed as a potent anti-inflammatory and anti-allergic drug.
Inflammation is a pathophysiological process that is known to be involved in numerous diseases. Microbial infection or tissue injury activates inflammatory responses, resulting in the induction of proinflammatory proteins including inducible nitric oxide synthase (iNOS). Aster yomena is used in traditional Korean remedies. Here, we investigated the effects of ethanol extracts of Aster yomena (EAY) on the expression of iNOS induced by ovalbumin (OVA), one of the major egg allergens, or lipopolysaccharide (LPS), a Toll-like receptor 4 agonist. EAY inhibited OVA- or LPS-induced $NF-{\kappa}B$ activation. EAY also suppressed OVA- or LPS-induced iNOS expression and nitrite production. These results suggest that EAY has the specific mechanism for anti-inflammatory responses and the potential to be developed as a potent anti-inflammatory and anti-allergic drug.
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문제 정의
그래서 우리는 이번 연구를 통해서 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 OVA에 의해서 유도된 NF-κB 활성화와 활성화된 NF-κB에 의해서 유도되는 유전자인 iNOS의 발현을 어떻게 조절하는지 알아보고자 한다.
그러므로 이번 연구에서 우리는 염증을 유발하는데 중요한 요소인 NF-κB 활성화와 iNOS 발현을 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 조절할 수 있는지 연구하였다.
다음 실험으로 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 NF-κB 활성화에 의해서 유도되는 유전자인 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다.
미래에는 쑥부쟁이 추출물이 TRIF-dependent 신호전달 시스템을 어떻게 조절하여 NF-κB 활성화와 iNOS 발현을 억제하는지 그 작용기전을 규명하고자 한다.
쑥부쟁이 에탄올 추출물은 OVA과 LPS에 의해서 유도된 NF-κB 활성화와 iNOS 발현을 억제하였다. 이러한 결과는 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 염증 조절물질로써 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다.
이번 연구에서 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 계란 알러젠 중의 하나인 OVA 또는 TLR4 agonist인 LPS에 의해서 유도된 iNOS 발현에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 우 리는 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 OVA 또는 LPS에 의해 유도된 NF-κB 활성화와 iNOS 발현을 억제하는 것을 밝혀내었다.
제안 방법
Supernatant 100 μl씩 96 well plate에 넣고, 분주기를 사용하여 Griess reagent (1% sulfanilamide and 0.1% naphthylethylene diamine in a 2.5% phosphoric acid solution) 150 μl를 첨가하였다.
5% phosphoric acid solution) 150 μl를 첨가하였다. 공기를 제거한 후 플레이트 리더기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 sodium nitrite 용액이 사용되었다.
발광효소의 활성화는 β-galactosidase의 활성화를 측정하여 표준화시켰다.
, 2015). 세포 생존율은 잘 알려진 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-)4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)을 사용한 색깔변화에 의해서 평가하였다. 세포 생존율 시험은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega)을 가지고 제조사의 방법에 따라서 측정하였다.
쑥부쟁이 에탄올 추출물의 세포 독성을 측정하기 위해서 MTS assay를 사용하여 세포 생존율을 확인하였다. 쑥부쟁이 에탄올 추출물은 200 μg/ml의 농도에서 93% 이상 의 세포 생존율을 보여주었다(Fig.
대상 데이터
그 밖의 다른 시약들은 Sigma-Aldrich 회사로부터 구입하였다.
RAW 264.7 cells (a murine monocytic cell line, ATCC TIB-71)은 10% (v/v) FBS, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 포함하고 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였으며, 세포들은 5% CO2/air 를 포함하고 있는 37℃ 배양기 안에서 배양하였다.
iNOS 항체는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)와 β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
실험에 사용한 ovalbumin은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), LPS는 List Biological Lab (San Jose, CA, USA)로부터 구입하였다. iNOS 항체는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)와 β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
쑥부쟁이 잎은 전라남도 농업기술센터에서 구입하였다. 쑥부쟁이 건조된 잎은 4시간 동안 87℃에서 50% 에탄올을 가지고 추출하였다.
공기를 제거한 후 플레이트 리더기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 sodium nitrite 용액이 사용되었다.
이론/모형
2A, 2B). 다음으로 쑥부쟁이 에탄올 추출물은 OVA 또는 LPS에 의해서 유도된 iNOS 단백질 발현을 억제시키는 것을 Western blotting 방법을 통하여 확인하였다(Figs. 3A, B). 또한 쑥부쟁이 에탄올 추출물은 OVA 또는 LPS에 의해서 유도된 iNOS에 의한 생성물인 nitrite의 생성을 억제하였다(Figs.
다음 실험으로 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 NF-κB 활성화에 의해서 유도되는 유전자인 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 먼저 발광효소 유전자 분석법이 사용되었다. iNOS 발광효소 유전자 분석법에 의하면 쑥부쟁이 에탄올 추출물은 OVA 또는 LPS에 의해서 유도된 iNOS 발현을 억제시켰다(Figs.
먼저 우리는 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 계란 알러 젠인 OVA 또는 LPS에 의해서 유도된 NF-κB 활성화에 어떤 영향을 미치는지 발광효소 유전자 분석법(luciferase assay)을 활용해서 알아보았다.
발광효소 유전자 분석은 선행 연구에서 사용한 방법에 의하여 분석하였다(Youn et al., 2006c). 발광효소 plasmid 와 HSP70-β-galactosidase plasmid는 Superfect transfection 시약(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 세포 안으로 transfection 시켰다.
발광효소 plasmid 와 HSP70-β-galactosidase plasmid는 Superfect transfection 시약(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 세포 안으로 transfection 시켰다. 발광효소의 활성화는 luciferase assay system (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다. 발광효소의 활성화는 β-galactosidase의 활성화를 측정하여 표준화시켰다.
세포 생존율은 잘 알려진 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-)4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)을 사용한 색깔변화에 의해서 평가하였다. 세포 생존율 시험은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega)을 가지고 제조사의 방법에 따라서 측정하였다.
세포 생존율 시험은 선행 연구에 사용하였던 방식을 따라 하였다(Ahn et al., 2015). 세포 생존율은 잘 알려진 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-)4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)을 사용한 색깔변화에 의해서 평가하였다.
성능/효과
3A, B). 또한 쑥부쟁이 에탄올 추출물은 OVA 또는 LPS에 의해서 유도된 iNOS에 의한 생성물인 nitrite의 생성을 억제하였다(Figs. 4A, B).
우 리는 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 OVA 또는 LPS에 의해 유도된 NF-κB 활성화와 iNOS 발현을 억제하는 것을 밝혀내었다.
후속연구
그래서 우리는 이번 연구를 통해서 쑥부쟁이 에탄올 추출물이 OVA에 의해서 유도된 NF-κB활성화와 활성화된 NF-κB에 의해서 유도되는 유전자인 iNOS의 발현을 어떻게 조절하는지 알아보고자 한다. 이러한 연구는 천연 추출물을 활용한 알러지 예방 및 치료제 개발에 초석이 될 것으로 기대한다.
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