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문제 정의
- , 2015).따라서 본 연구는 차후 수요가 급증할 것으로 기대되는 참지네고사리의 기내 포자발아, 전엽체 증식 및 포자체 형성에 적합한배지 및 배양토 등 생육단계별 증식조건을 구명하고 균일 묘를 생산하고자 수행되었다.
제안 방법
- 또한 배지의 구성 물질 중 질소급원의 총 농도와 비율을 달리하여 전엽체에 질소급원이 미치는 영향을 구명하였다. MS배지의 stock solution 조성 중 질소원으로 첨가되는 NH4NO3와 KNO3의 stock 용액을 조절하여 질소급원의 총 농도(NH4+:NO3-=1:2)를 각각 30, 60, 120mM로 조절하였으며, 질소급원의 비율은 NH4Cl와 KNO3를 사용하여 각각0:60, 20:40, 40:20, 60:0mM로 달리한 배지를 조성하였다. Sucrose의 농도별 실험을 제외한 모든 배지는 sucrose 3%를 첨가하여 사용하였다.
- 기내 계대 배양된 전엽체는 배지를 제거하고 다찌가렌(Hymexazol 30%, Dongbu Agrotech, Korea) 1,000배 희석 액에 1시간동안 침지하여 살균한 다음 5회 수세하였다. 수세한 전엽체 1.
- 확보된 전엽체를 재료로 전엽체 증식을 위한 배지를 선발하고자, 1/8, 1/4, 1/2, 1, 2배로 조절한 MS와 Knop배지를 재료로 하였으며, 선발된 배지의 종류를 기본으로 sucrose를 각각 0, 1, 2, 3, 4%로 첨가하여 sucrose가 전엽체의 증식 및 형태형성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 또한 배지의 구성 물질 중 질소급원의 총 농도와 비율을 달리하여 전엽체에 질소급원이 미치는 영향을 구명하였다. MS배지의 stock solution 조성 중 질소원으로 첨가되는 NH4NO3와 KNO3의 stock 용액을 조절하여 질소급원의 총 농도(NH4+:NO3-=1:2)를 각각 30, 60, 120mM로 조절하였으며, 질소급원의 비율은 NH4Cl와 KNO3를 사용하여 각각0:60, 20:40, 40:20, 60:0mM로 달리한 배지를 조성하였다.
- 이후 분쇄한 전엽체를 토양표면에 균일하게 접종하였으며, 저면관수를 실시하고 상부에 유리판을 덮어 상대습도(72±2%)를 유지하였다. 또한 토양표면에 전엽체의 형성이 시작되면 접합체의 수정을 유도하기 위하여 1일 1회 두상관수를 실시하였다.
- 모든 실험은 200mL 배양 병에 각 배지를 30mL씩 분주한 다음 전엽체를 300mg씩 메스로 다져서 접종하였으며 멸균 수 1mL를 첨가하였다. 배양 8주 후 꺼내어 전엽체의 형태형성을 관찰하고, 생체 증가량을 분석하였다.
- 배지는 변형 Knop(1865) 배지와 농도를 1/8, 1/4, 1/2, 1배로 달리한 MS배지를 각각30mL씩 페트리접시(90×15mm, 10090, SPL Life Sciences Co. Ltd., Korea)에 분주하였으며, 포자 희석액과 멸균 수를 각각1mL씩 배지에 접종하였다.
- 기내 계대 배양된 전엽체는 배지를 제거하고 다찌가렌(Hymexazol 30%, Dongbu Agrotech, Korea) 1,000배 희석 액에 1시간동안 침지하여 살균한 다음 5회 수세하였다. 수세한 전엽체 1.0g과 증류수 25mL를 플라스틱 비커에 넣고 핸드 블렌더(V8000, Boowon, Korea)로 10초간 분쇄하였다.
- , Korea)로 포자만 분리한 다음 4±1°C의 저온저장고에 보관하면서 발아실험에 사용하였다. 이후 발아실험에서 획득한 전엽체를 MS배지(Murashige and Skoog, 1962)에 8주 간격으로 계대배양하면서 전엽체 증식 및 포자체 형성의 실험재료로 사용하였다.
- 0μmol·m-2·s-1, 광주기 16/8(light/dark)시간으로 조절되었으며, 14주간 재배하였다. 이후 처리별로 본 엽과 뿌리가 정상적으로 형성된 포자체의 수를 계수하였으며, 균일한 포자체 10개체를 선발하여, 생체 중, 건체 중, 초장, 초 폭, 엽장, 엽 폭, 엽수 및 SPAD(SPAD-502, Minolta, Japan)의 값을 조사하였다.
- 포자발아 및 전엽체 증식의 배양환경은 온도 25±1°C, 광량 30±1.0μmol·m-2·s-1, 광주기 16/8시간으로 조절되었으며, 발아 후 전엽체의 발달과정 및 형태형성은 실체현미경(SZ51, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
- , Korea)에 분주하였으며, 포자 희석액과 멸균 수를 각각1mL씩 배지에 접종하였다. 포자발아의 조사는 접종일로부터 2일 간격으로 32일 동안 실시하였고, 실체현미경(Eclipce E600, Nikon, Japan)을 이용하여 가 근이 돌출된 포자를 기준으로 계수하였으며, 발아율(%)로 수치화 하였다.
- 포자에서 획득한 전엽체를 실험의 재료로 사용하고자 8주 간격으로 MS배지에 계대배양하면서 전엽체를 증식하였다. 확보된 전엽체를 재료로 전엽체 증식을 위한 배지를 선발하고자, 1/8, 1/4, 1/2, 1, 2배로 조절한 MS와 Knop배지를 재료로 하였으며, 선발된 배지의 종류를 기본으로 sucrose를 각각 0, 1, 2, 3, 4%로 첨가하여 sucrose가 전엽체의 증식 및 형태형성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 포자의 소독 및 접종방법은 Jeong and Lee(2006)와 Shin(2007)의 연구방법을 변형하여 수행하였다. 정선된 포자 50mg을15mL 코니칼 튜브에 넣어 1차 증류수로 24시간 침지하였다.
- 포자체 형성의 배양환경은 온도 25±1°C, 광량 43±2.0μmol·m-2·s-1, 광주기 16/8(light/dark)시간으로 조절되었으며, 14주간 재배하였다.
- 포자에서 획득한 전엽체를 실험의 재료로 사용하고자 8주 간격으로 MS배지에 계대배양하면서 전엽체를 증식하였다. 확보된 전엽체를 재료로 전엽체 증식을 위한 배지를 선발하고자, 1/8, 1/4, 1/2, 1, 2배로 조절한 MS와 Knop배지를 재료로 하였으며, 선발된 배지의 종류를 기본으로 sucrose를 각각 0, 1, 2, 3, 4%로 첨가하여 sucrose가 전엽체의 증식 및 형태형성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 또한 배지의 구성 물질 중 질소급원의 총 농도와 비율을 달리하여 전엽체에 질소급원이 미치는 영향을 구명하였다.
대상 데이터
- 2013년 1월 24일에 전라남도 완도군 신지면 일대에서 참지네고사리 식물체를 채집하여 청주시의 무 가온 비닐하우스에 정식한 다음 성숙기인 6월 중순에 포자 엽을 수확하였다. 포자 엽은 7일간 종이상자에 넣어 음건한 후 100μm의 sieve(Chunggye Co.
- 배양토는 원예용 상토(Hanareum no. 2, Shinsung MineralCo. Ltd., Korea), 피트모스(Sunshine, Sun Gro Hort., Canada), 펄라이트(Newpershine no. 2, GFC. Co. Ltd., Korea), 마사토(2mm, Samgye Masato, Korea)의 비율을 달리한 8종류의 배양토를 사용하였다. 배양토를 75×75×83mm 사각화분(Cosmo Corporation, USA)에 담아 503×335×195mm 플라스틱상자(SPC532, SH Plastic, Korea)에 배치하였다.
- 선행 연구에서 선발된 1MS 배지의 sucrose의 농도를 달리한 다음 전엽체를 300mg씩 접종하여 8주간 배양하였다. 연구의결과, 1%와 2% 처리 구에서 생체중이 각각 6.
데이터처리
- 모든 실험은 4반복으로 수행하였으며, 평균과 표준오차 범위를 구하고 SASversion9.3(SASinstitute Inc., USA)의 Duncan’smultiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- MS배지의 구성 물질 중 질소급원의 총 농도를 달리하여 전엽체를 접종한 결과, 30, 60 및 120mM 처리 구에서 생체중이 초기 접종 량 대비 각각 17.0, 15.7 및 14.3배 증가하였으나, 농도 간의 유의적인 차이는 없었다(Fig. 6). 또한 모든 처리 구에서 전엽체가 판 형태로 분열한 다음 심장형(60, 120mM)과 주걱 형(30mM)의 전엽체로 발달되었으나, 30과 60mM 처리 구에서만 생식기관인 장정기가 관찰되었다(S.
- 본 연구에서 원예 상토를 첨가한 처리구의 포자체 발생 및 생육의 촉진은 토양 내의 다양한 화학적 특성이 영향을 미친 것으로 생각되었다. 그 중 원예 상토와 마사토를 혼용한 처리 구에서 포자체의 발생이 가장 우수하였는데, 이는 원예 상토의 화학적 특성과 마사 토 입자의 물리적 배수성이 포자체의 발생 및 생육에 유리한 기상환경을 제공한 것으로 생각되었다. 마찬가지로 펄라이트도 마사 토와 유사한 배수성을 제공한 것으로 보인다(Kimand Kim, 2011).
- 83개(cm2 당)로 가장 많았다. 다음으로 원예 상토 : 펄라이트2:1(v:v) 혼용 처리구와 상토를 단 용한 순으로 각각 0.62, 0.54개(cm2 당) 발생하였으며, 두 처리구 간의 유의적 차이는 없었다(Table 1). 특히 원예 상토를 단 용한 처리 구에서는 원예 상토: 마사 토를 2:1(v:v)로 혼용한 것에 비해 지상부와 지하부의 생체 중 및 건체중이 유의적으로 우수하였으며, 초장, 초폭, 엽수, 엽장, 엽 폭 및 SPAD의 측정값도 모두 높은 수치를 기록하였다(Table 2).
- 본 연구에서 참지네고사리 전엽체는 배지 내에 sucrose를 첨가하지 않거나 고농도로 첨가하였을 때 생육뿐만 아니라 생식기관의 형성까지 억제되는 것을 알 수 있었다. 따라서 배지 내 sucrose 농도는 2%로 조절하는 것이 참지네고사리 전엽체의 생육 및 기관형성에 적합한 것으로 판단되었다.
- 의 비율이 높을 때 생식기관의 발달에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 생각되었다. 따라서 질소급원의 총 농도를 60mM로 고정하고 질소급원의 비율을 20:40mM로 조절하는 것이 참지네고사리 전엽체의 생육 및 생식기관의 발달에 적합한 조건으로 판단되었다.
- , 2015)가 있으므로 참지네고사리는 포자발아 후 전엽체로의 발달 및 초기생육에 높은 농도의 구성 물질을 요구하지는 않는 것으로 생각되었다. 따라서 참지네고사리의 포자는 Knop배지에 파종하는 것이 포자발아에 요구되는 기간을 단축하며, 형태형성이 우수한 전엽체를 획득할 것으로 생각되었다.
- 6). 또한 모든 처리 구에서 전엽체가 판 형태로 분열한 다음 심장형(60, 120mM)과 주걱 형(30mM)의 전엽체로 발달되었으나, 30과 60mM 처리 구에서만 생식기관인 장정기가 관찰되었다(S. 2). 특히 60mM 처리 구에서는 30mM 처리 구에 비해 다수의 장정기를 확인할 수 있었으므로,질소급원의 첨가가 참지네고사리 전엽체의 생육을 촉진하는 데 효과적이며 적정 질소급원의 총 농도는 60mM로 생각되었다.
- 따라서 참지네고사리의 포자체 형성에는 원예 상토와 마사토를 2:1(v:v)로 혼용한 배양토가 적합하며, 추후 육묘 시 원예 상토의 비율을 높인다면 포자체의 생육을 촉진할 수 있을 것으로 생각되었다. 또한 재배의 편의성을 고려하여 본 연구에서와 같이 저면관수를 실시할 경우 피트모스는 혼용하지 않는 것이 좋을 것으로 판단되었다.
- 반면 0:60 및 60:0mM로 한 가지 질소급원만 사용한 배지에서는 혼용한 배지에 비해 전엽체의 증식이 유의적으로 억제되었다. 처리별 전엽체의 발달을 관찰한 결과, 모든 처리에서 판 형태의 전엽체로 분열하였으며 주걱 형(0:60mM), 심장형(20:40, 40:20,60:0mM)의 전엽체로 발달되었다.
- 1A). 발아개시는 모든 배지에서 4일로 조사되었으며, 1/2MS와 Knop배지의 초기발아속도는 다른 배지에 비해 빠른 상승세를 나타내었다. 발아된 포자는 전엽체로 발달하는데, Ramirez-Trejo et al.
- 배양토의 종류를 달리하여 전엽체를 배양한 결과, 원예 상토를 단용 또는 혼용한 처리 구에서 포자체의 형성과 생육이 우수하였으며, 특히 원예 상토 : 마사 토 2:1(v:v)의 혼용 처리 구에서 포자체의 형성이 0.83개(cm2 당)로 가장 많았다. 다음으로 원예 상토 : 펄라이트2:1(v:v) 혼용 처리구와 상토를 단 용한 순으로 각각 0.
- 본 연구에서 원예 상토를 첨가한 처리구의 포자체 발생 및 생육의 촉진은 토양 내의 다양한 화학적 특성이 영향을 미친 것으로 생각되었다. 그 중 원예 상토와 마사토를 혼용한 처리 구에서 포자체의 발생이 가장 우수하였는데, 이는 원예 상토의 화학적 특성과 마사 토 입자의 물리적 배수성이 포자체의 발생 및 생육에 유리한 기상환경을 제공한 것으로 생각되었다.
- 반면 Asplenium vidalii의 전엽체는 sucrose 1-2%를 첨가한 배지에서 생육이 증진되었다(Oh and Lee, 2002). 본 연구에서 참지네고사리 전엽체는 배지 내에 sucrose를 첨가하지 않거나 고농도로 첨가하였을 때 생육뿐만 아니라 생식기관의 형성까지 억제되는 것을 알 수 있었다. 따라서 배지 내 sucrose 농도는 2%로 조절하는 것이 참지네고사리 전엽체의 생육 및 기관형성에 적합한 것으로 판단되었다.
- 본 연구의 결과, 참지네고사리 전엽체의 정상적인 발달 및 생육을 위해서는 질소급원의 혼용이 효과적이며, 질소급원 중 NH4+에 비해 NO3-의 비율이 높을 때 생식기관의 발달에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 생각되었다. 따라서 질소급원의 총 농도를 60mM로 고정하고 질소급원의 비율을 20:40mM로 조절하는 것이 참지네고사리 전엽체의 생육 및 생식기관의 발달에 적합한 조건으로 판단되었다.
- 따라서 영양물질의 요구 도는 종마다 다소 차이가 있는 것으로 생각되었다. 본 연구의 결과, 참지네고사리 전엽체의 증식에 적합한 배지는 생식기관이 발생하여 포자체 형성에 유리할 것으로 생각되는 1MS배지로 판단되었다.
- 선행 연구에서 선발된 1MS 배지의 sucrose의 농도를 달리한 다음 전엽체를 300mg씩 접종하여 8주간 배양하였다. 연구의결과, 1%와 2% 처리 구에서 생체중이 각각 6.0, 6.2g으로 무 처리에 비해 현저히 높았으며, 3%와 4% 처리 구에서는 무 처리구와 유의미한 차이가 없었다(Fig. 5).
- Kim and Kim(2011)의 연구에서 피트모스의 함량이 높을수록 식물생육에 유리한 공극률을 유지한다고 보고된 바 있으나,본 연구에서는 토양 내 피트모스의 비율이 높을수록 전엽체 형성 및 포자체의 발생이 현저히 억제되었다(Table 1). 이와 같은 결과는 높은 공극률과 보수력을 지닌 피트모스로 인하여 토양 내의 함수율이 증가하면서 기상률이 감소하여 전엽체와 포자체의 생육에 부정적인 영향을 미쳤을 것으로 생각되었다. Gruda and Schnizler(2004)는 식물 생육에 적합한 토양조건으로 토양내의 적정 공극률과 기상률의 수치는 각각 85% 및 20-30%, 20-30%이며, 통기성과 보수력의 적합한 균형이 요구된다고 보고하였다.
- 전엽체 증식에 적합한 배지를 선정하고자 종류 및 농도를 달리한 배지에 접종한 결과, Knop배지에서 생체중이 5.8g으로 초기 접종 량 대비 19.3배가 증가하였다(Fig. 3). 반면 MS 계열의 배지에서는 2MS 배지에서 생체중이 0.
- 전엽체의 형태 및 기관의 발달을 관찰한 결과, 모든 처리 구에서 판 형태의 분열조직으로 발달하였으며, 1/4, 1/2, 1MS 및 Knop배지에서는 가 근의 돌출도 확인되었다(Fig. 4). 판 형태로 분열된 전엽체는 1MS를 제외한 모든 처리가 주걱형의 형태를 갖췄으며, 1MS는 심장형의 전엽체 형태가 관찰되었다.
- 질소급원의 총 농도를 60mM로 고정한 다음 NH4+와 NO3- 간의 농도 비율을 달리하여 전엽체를 배양한 결과, 질소급원을20:40 및 40:20mM로 조절한 배지에서 전엽체의 생체중이 각각 4.7, 4.6g으로 가장 컸으나, 유의적인 차이는 없었다(Fig. 7).
- 참지네고사리 포자는 모든 배지조건에서 80%이상 발아가 진행되어, 배지의 종류와 농도에 관계없이 발아력이 우수하였다 (Fig. 1A). 발아개시는 모든 배지에서 4일로 조사되었으며, 1/2MS와 Knop배지의 초기발아속도는 다른 배지에 비해 빠른 상승세를 나타내었다.
- 참지네고사리의 발아된 포자로부터 전엽체의 형태형성을 관찰한 결과, Knop배지에서는 전엽체로의 발달이 가장 빠르게 진행되었으며, 필라멘트, 판 형태의 분열조직 및 다수의 가 근이 관찰되었다(Fig. 2A). 반면 MS계통의 배지에서는 전엽체로의 형태형성이 다소 억제되었는데, 특히 1/2MS배지에서는 가 근의 길이가 짧고, 초기분열의 시작단계인 필라멘트 형 원사 체에 머물러 동일기간 동안 Knop배지에 비해 전엽체로의 발달이 미진하였다(Fig.
- 반면 0:60 및 60:0mM로 한 가지 질소급원만 사용한 배지에서는 혼용한 배지에 비해 전엽체의 증식이 유의적으로 억제되었다. 처리별 전엽체의 발달을 관찰한 결과, 모든 처리에서 판 형태의 전엽체로 분열하였으며 주걱 형(0:60mM), 심장형(20:40, 40:20,60:0mM)의 전엽체로 발달되었다. 또한 질소급원을 20:40mM로 조절한 처리 구에서는 장정기의 발달이 확인되었다(S.
- 처리별 전엽체의 형태형성은 0-3% 처리 구에서 가 근이 돌출된 판 형태로 분열되었으며, 심장형(1, 3%)과 주걱 형(0, 2%)의 전엽체로 발달되었다. 또한 1, 2 및 3% 처리 구에서는 생식기관인 장정기의 형성이 확인되었다(S.
- 2). 특히 60mM 처리 구에서는 30mM 처리 구에 비해 다수의 장정기를 확인할 수 있었으므로,질소급원의 첨가가 참지네고사리 전엽체의 생육을 촉진하는 데 효과적이며 적정 질소급원의 총 농도는 60mM로 생각되었다.
- 54개(cm2 당) 발생하였으며, 두 처리구 간의 유의적 차이는 없었다(Table 1). 특히 원예 상토를 단 용한 처리 구에서는 원예 상토: 마사 토를 2:1(v:v)로 혼용한 것에 비해 지상부와 지하부의 생체 중 및 건체중이 유의적으로 우수하였으며, 초장, 초폭, 엽수, 엽장, 엽 폭 및 SPAD의 측정값도 모두 높은 수치를 기록하였다(Table 2).
후속연구
- 따라서 참지네고사리의 포자체 형성에는 원예 상토와 마사토를 2:1(v:v)로 혼용한 배양토가 적합하며, 추후 육묘 시 원예 상토의 비율을 높인다면 포자체의 생육을 촉진할 수 있을 것으로 생각되었다. 또한 재배의 편의성을 고려하여 본 연구에서와 같이 저면관수를 실시할 경우 피트모스는 혼용하지 않는 것이 좋을 것으로 판단되었다.
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