최근 3차원 세포 배양이 가능해 지면서 세포의 부피, 3차원 형태 등을 보다 정확하게 확인할 수 있게 되었다. 일반적으로 세포의 3차원 단층 정보는 공초점 현미경 또는 전자 현미경과 같은 특수한 현미경을 이용하여 관찰 해야 한다. 그러나 공초점 현미경은 일반 현미경에 비해 비용이 비싸며, 촬영 시간이 오래 걸린다. 따라서 일반적으로 사용되는 광학 현미경으로 세포의 3차원 형태복원을 하는 방법이 필요하다. 본 논문에서는 다초점 형광 영상을 기반으로 영상의 추정된 초점 값(focus estimator value)을 이용해 세포를 3차원으로 형태 복원하는 방법을 제안한다. 먼저 3차원으로 배양된 세포를 광학 현미경으로 초점을 변경 하면서 다초점 영상들을 촬영한다. 이후 영상에서 circular Hough transform을 이용하여 세포 군집의 대략적인 위치를 ROI(Region Of Interest)로 정한다. 획득한 ROI에 MSBF(Modified Sliding Band Filter)를 적용하여 ROI 내에 세포 군집의 외곽선을 추출하고, 추출된 외곽선을 기준으로 추정 초점 값을 구한다. 계산된 초점 값과 현미경의 NA(Numerical Aperture)을 이용하여 깊이를 고려한 세포 군집의 외곽선을 추출하고 추출된 외곽선을 통해 세포들을 3차원으로 형태 복원한다. 복원 결과는 세포 영상의 in-focus가 된 부분들을 하나로 합친 영상과 비교하여 검증한다.
최근 3차원 세포 배양이 가능해 지면서 세포의 부피, 3차원 형태 등을 보다 정확하게 확인할 수 있게 되었다. 일반적으로 세포의 3차원 단층 정보는 공초점 현미경 또는 전자 현미경과 같은 특수한 현미경을 이용하여 관찰 해야 한다. 그러나 공초점 현미경은 일반 현미경에 비해 비용이 비싸며, 촬영 시간이 오래 걸린다. 따라서 일반적으로 사용되는 광학 현미경으로 세포의 3차원 형태복원을 하는 방법이 필요하다. 본 논문에서는 다초점 형광 영상을 기반으로 영상의 추정된 초점 값(focus estimator value)을 이용해 세포를 3차원으로 형태 복원하는 방법을 제안한다. 먼저 3차원으로 배양된 세포를 광학 현미경으로 초점을 변경 하면서 다초점 영상들을 촬영한다. 이후 영상에서 circular Hough transform을 이용하여 세포 군집의 대략적인 위치를 ROI(Region Of Interest)로 정한다. 획득한 ROI에 MSBF(Modified Sliding Band Filter)를 적용하여 ROI 내에 세포 군집의 외곽선을 추출하고, 추출된 외곽선을 기준으로 추정 초점 값을 구한다. 계산된 초점 값과 현미경의 NA(Numerical Aperture)을 이용하여 깊이를 고려한 세포 군집의 외곽선을 추출하고 추출된 외곽선을 통해 세포들을 3차원으로 형태 복원한다. 복원 결과는 세포 영상의 in-focus가 된 부분들을 하나로 합친 영상과 비교하여 검증한다.
As 3D cell culture has recently become possible, it has been able to observe a 3D shape of cell and volume. Generally, 3D information of a cell should be observed with a special microscope such as a confocal microscope or an electron microscope. However, a confocal microscope is more expensive than ...
As 3D cell culture has recently become possible, it has been able to observe a 3D shape of cell and volume. Generally, 3D information of a cell should be observed with a special microscope such as a confocal microscope or an electron microscope. However, a confocal microscope is more expensive than a conventional microscope and takes longer time to capture images. Therefore, there is a need for a method that can reconstruct the 3D shape of cells using a common microscope. In this paper, we propose a method of reconstructing 3D cells using the focus estimator value from multi-focal fluorescence images of cells. Initially, 3D cultured cells are captured with an optical microscope by changing the focus. Then the approximate position of the cells is assigned as ROI (Region Of Interest) using the circular Hough transform in the images. The MSBF (Modified Sliding Band Filter) is applied to the obtained ROI to extract the outlines of the cell clusters, and the focus estimator values are computed based on the extracted outlines. Using the computed focus estimator values and the numerical aperture (NA) of the microscope, we extract the outline of the cell cluster considering the depth and reconstruct the cells into 3D based on the extracted outline. The reconstruction results are examined by comparing with the combined in-focus portions of the cell images.
As 3D cell culture has recently become possible, it has been able to observe a 3D shape of cell and volume. Generally, 3D information of a cell should be observed with a special microscope such as a confocal microscope or an electron microscope. However, a confocal microscope is more expensive than a conventional microscope and takes longer time to capture images. Therefore, there is a need for a method that can reconstruct the 3D shape of cells using a common microscope. In this paper, we propose a method of reconstructing 3D cells using the focus estimator value from multi-focal fluorescence images of cells. Initially, 3D cultured cells are captured with an optical microscope by changing the focus. Then the approximate position of the cells is assigned as ROI (Region Of Interest) using the circular Hough transform in the images. The MSBF (Modified Sliding Band Filter) is applied to the obtained ROI to extract the outlines of the cell clusters, and the focus estimator values are computed based on the extracted outlines. Using the computed focus estimator values and the numerical aperture (NA) of the microscope, we extract the outline of the cell cluster considering the depth and reconstruct the cells into 3D based on the extracted outline. The reconstruction results are examined by comparing with the combined in-focus portions of the cell images.
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문제 정의
명시야 현미경 세포 영상에 MSBF 를 적용하여 세포가 위치하는 깊이를 추정하는 연구도 소개되었다⑸. 각 세포의 깊이에 따른 영상마다외곽선을 MSBF 를 이용하여 검출하고, 외곽선 부분의 focus estimator value 를 구한다.
본 논문에서는 세포의 다초점 형광 영상과 세포의 깊이를 추정하여 세포의 3차원 형태를 복원하는 방법을 제시한다. ECM (Extra-Cellular Matrix) 을 이용하여 피부암 세포를 3 차원으로 배양한 후, 광학 현미경을 통해 피부암 세포를 다초점으로 촬영한다.
과 같은 형태로되어 있다. 본 연구에서는 단일 세포가 아닌 well전체에 대한세포군집을3 차원으로 형태 복원하고자한다.
제안 방법
태를 복원하였다. 3 차원으로 배 양한 세포를 광학 현미경으로 다초점으로 촬영하였으며 , 획 득한 영 상으로부터 circular Hough transform 을 이용하여 대략적인 세포의 위치를 ROI 영역으로 설정하였다. 설정된 ROI 에 MSBF 를 적용하여 초점 추정 값을 계산한후 이를통해 깊이를고려하여 공초점 현미경 영 상과 유사한 세포의 단층 영 상을 생 성 하였다.
제시한다. ECM (Extra-Cellular Matrix) 을 이용하여 피부암 세포를 3 차원으로 배양한 후, 광학 현미경을 통해 피부암 세포를 다초점으로 촬영한다. 영상에서 세포 군집의 대략적인 위치를 파악하기 위해, 각 영상마다 초점이 맞는 부분들을 합하여 하나의 영상으로 합성 한 후, 세포 군집 이 위 치하는 ROKRegion Of InterestX 찾아낸다.
STORMfstochastic optical reconstruction microscopy) 이라는 현미경을 개발하고, 형광 영상 촬영시 불투명한 세포 z 위치를 추정하여 3차원 가시화 및 분석하는 방법이 제안되 었다[14]. 이 연구에서는。ptical astigmatisin 에따른 세포 영상의 blur 의 수치를 이용하여 영상의 해상도를 기반으로 세포의 z 위치를 추정하였다. 하지만 이 방법은 STORM 이 라는 광학 현미 경에서만사용 가능하다.
깊이를 추정하는 연구도 소개되었다⑸. 각 세포의 깊이에 따른 영상마다외곽선을 MSBF 를 이용하여 검출하고, 외곽선 부분의 focus estimator value 를 구한다. 획득된 각 깊이에 따른 세포의 focus estimator value 는 영상에서 세포의 깊이를 추정하기 위해 사용 된다.
한다. 그리고 각 세포의 ROI 내에 존재하는 피부암 세포군집의 형태를 유지하면서 노이즈를 제거하기 위해 morphological closing 과 anisotropic difiiision 을 사용한다,
계 산된 focus estimator value 는 최종적인 깊이에 따른 세포의 외곽선을 추출하는데 이용되며, 이를 통해 최종적으로 공초점 현미 경영상과 유사한 해당 세포의 단층 영상을 생성한다. 그리고 생성된 세포의 단층 영상으로부터 VTK 를 활용하여 최종적인 3 차원 형태 모델을 재구성 한다.
그리고 획득한 외곽선 정보를 이용하여 세포의 단층 영상을 생성한다. 먼저 모든 ROI 영 역에 대하여 전처리 과정으로 morphological closing, anisotropic difhision[l이을 적용한다.
이 연구에서는 원구 모델로 세포의 위치를 3차원 가시화 하였다. 또한 전문가가 수동으로 구한 실측 자료와 비교하여 추정 값을 검증하였다.
또한 해당 영상을 초점별로 비교하여 확인하였다. 완벽하지 않지만 어느정도 유사하게 단층영상으로 만든 것을 확인할 수 있다 (Figure 13 참조).
계산된 6값을 이용하여 Figure 11과 같이 세포군집을 깊이에 따라줄여 나간다. 모든R0I 에 대하여 이를 수행하여 영상들을 깊이에 따라 배치하여 공초점 현미경에서 촬영된 단층 영상과 유사한 형태의 영상을 생성하고, VTK 를이 용하여 세 포를 3차원 형태로 재 구성 한다.
Figure 2는 ECM 을 이용하여 세포를 배 양하는 방법을 도식화한 것이다. 배양된 표본은 광학 현미경 인 Operetta 를 이용하여 배 양된 plate 의 well 안의 세포를 촬영 하였다.
본 논문에서는 ECM 방식으로 3차원 배양한 세포를 Operetta 라는 광학 현미경을 통해 다초점 형광 영상으로 촬영하여 사용한다.
본 논문에서는 ECM 을 이용하여 피부암 세포를 배 양하였다. Figure 2는 ECM 을 이용하여 세포를 배 양하는 방법을 도식화한 것이다.
본 논문의 세포 위치 추출 방법은 추출 범위 가 겹쳐도 상관없기 때문에 circular Hough transform 을 이용하여 빠르게 ROI 를 추출 한다. 그리고 각 세포의 ROI 내에 존재하는 피부암 세포군집의 형태를 유지하면서 노이즈를 제거하기 위해 morphological closing 과 anisotropic difiiision 을 사용한다,
본 단계에서는 전 단계에서 획득한ROI 영역 영상에 MSBF 를 적용하고, 이를 통해 깊이가고려된 외곽선을 추정한다. 그리고 획득한 외곽선 정보를 이용하여 세포의 단층 영상을 생성한다.
본 연구는 세포의 다초점 형광영상으로부터 세포의 3 차원형 태를 복원하였다. 3 차원으로 배 양한 세포를 광학 현미경으로 다초점으로 촬영하였으며 , 획 득한 영 상으로부터 circular Hough transform 을 이용하여 대략적인 세포의 위치를 ROI 영역으로 설정하였다.
본 연구에서는 보편적 인 Hydrogel 을 이용한 ECM 을 통해 세 포를 배양하는 방식을 채 택 하였다.
본 연구에서도 MSBF 기반으로 대략적인 세포의 외곽선을 추출하여 3차원 형태를 복원한 후, 오픈 라이브러 리 인 VTK를 이 용하여 시 각화 한다.
SBF(Sliding Band Filter)를 활용하여 흉골 부위의 결절을 검출하는 연구[9] 에서는 영상 내에서 흉골의 결절 부분이라 생 각된 후보군 영역 에 SBF 를 적용하여 결절 된 부분인지를 확인하였다. 본 연구에서도 이와 유사한 MSBF(ModifySlidingBandFilter)를 사용하여 세포를 검출한다.
이 렇게 계산된 초점 값과 현미 경의 NA(Numerical ApertureX 이용하여 공초점 현미경 영상과 같은 단층영상을 생성해 낼 수 얏I다. 생성된 단층영상으로부터 VTK (Visualization ToolKit) [6]를 사용하여 피부암 세포를 3 차원으로 재구성한다. 일반광학 현미 경 의 다초점 영 상으로부터 의 세포 군집의 3차원 형태복원 방법은 약물에 따른 3차원 형태 변이 측정을 통해 개인 맞춤형 약물치료에 기여할 수 있다.
3 차원으로 배 양한 세포를 광학 현미경으로 다초점으로 촬영하였으며 , 획 득한 영 상으로부터 circular Hough transform 을 이용하여 대략적인 세포의 위치를 ROI 영역으로 설정하였다. 설정된 ROI 에 MSBF 를 적용하여 초점 추정 값을 계산한후 이를통해 깊이를고려하여 공초점 현미경 영 상과 유사한 세포의 단층 영 상을 생 성 하였다. 3차원 가시화는 오픈 라이브러 리 인 VTK 의 marching cubes interpolation 과 Laplacian smoothing 을 사용하였다.
ECM (Extra-Cellular Matrix) 을 이용하여 피부암 세포를 3 차원으로 배양한 후, 광학 현미경을 통해 피부암 세포를 다초점으로 촬영한다. 영상에서 세포 군집의 대략적인 위치를 파악하기 위해, 각 영상마다 초점이 맞는 부분들을 합하여 하나의 영상으로 합성 한 후, 세포 군집 이 위 치하는 ROKRegion Of InterestX 찾아낸다. 각 ROI 내의 하나의 세포 군집 (또는 일부)에 대하여 외곽선을 추출하고, in-focus 된 깊이를 찾기위 한 지표인 추정 초점 값 (foous estimator valueX 구한다[5].
일정 수치 미만의 값을 가진 영상에서는 세포가 존재하지 않는다고 판단하였다. 이 연구에서는 원구 모델로 세포의 위치를 3차원 가시화 하였다. 또한 전문가가 수동으로 구한 실측 자료와 비교하여 추정 값을 검증하였다.
ECM 과 유사한 속성을 가지고 있는 인조 Hydrogel 을 이용하여 세포를 배양하여 관찰하는 방법이 제안되 었다[2]. 이 연구에서는 자연적 인 Hydrogel 로 배양한 세포 군집과 인조 Hydrogel 로 배양한 세포 군집을 비교하였다[2]. 다른 연구에서는 ECM을 연골세포와동일한세포 기질을 사용하고, 연골 조직 복구를 위한 3차원 세포 배 양법을 제 안하였다[3].
이렇게 생 성 된 단층 영 상을Figure 14 과 같이 VTK의 maiching cubes interpolation 과 Laplacian smoothing 을 이용하여 3 차원으로 세포의 형태를 재구성하였다.
대상 데이터
영상에서 x, y 는 각각 1 zzm 에 1360X 1024로 촬영된 영 상으로 총 50 장의 5 ㎛~(49 X 5)㎛ 의 focus 를 가진 형광영상이다. 본 논문에서는 불필요한 부분을 줄이기 위해 해당 데이터에서 세포가촬영되지 않ewell 바깥부분을 잘라 내어 1198 X 1024 의 크기의 영상으로 사용하였다. Figure 4 는 앞서 언급한 배양방법을통해 획득한 피부암세포 영상이다.
이론/모형
설정된 ROI 에 MSBF 를 적용하여 초점 추정 값을 계산한후 이를통해 깊이를고려하여 공초점 현미경 영 상과 유사한 세포의 단층 영 상을 생 성 하였다. 3차원 가시화는 오픈 라이브러 리 인 VTK 의 marching cubes interpolation 과 Laplacian smoothing 을 사용하였다.
다음 단계는 설정된 높이까지 세포가 위치한부분의 외곽선을 줄여 나간다. 이를 위해 현미 경마다 가지고 있는 NA(Numerical Aperture)를 이용한다. Figure 10 처럼 현미 경의 굴절각(们에 따라 상이 맺히는 성질을 이용하여 외곽선을 세포 군집 자체의 높이까지 줄여 나간다.
성능/효과
같다. 모델이 일부 복원되지 않은 부분이 있지만 세포 형태와 유사하게 잘 복원 되 었으며, 실제로 모델을 위에서 보았을 때 Figure 15 와 같이 형태가 유사한지를 비교 해 보았으며, 유사도는 matlab 을 이용해 확인했으며, 약 89%였다. 또한VTK 자체 함수를 이용하여 해당모델의 부피 또한 측정 이 가능하다.
이로써 3 차원으로 배양된 세포를 다초점 형광 영상으로 촬영한 데이터를 통해 공초점 현미경 없이도 세포의 3 차원형 태를 관찰할 수 있음을 보여 주었다. 향후 보다 정확한 형태복원을 위해서는 3차원 단층 정보를 제공하는 공초점 현미 경영상을 이용하여 단층 영상을 비교하거 나 또는 3 차원으로 형태를 복원하여 결과를 비교하는 실험을 진행해 봐야 할것이다.
후속연구
향후 보다 정확한 형태복원을 위해서는 3차원 단층 정보를 제공하는 공초점 현미 경영상을 이용하여 단층 영상을 비교하거 나 또는 3 차원으로 형태를 복원하여 결과를 비교하는 실험을 진행해 봐야 할것이다. 또한 배양 당시 겹쳐져 있거나위 아래에 붙어서 보이지 않는 세포에 대한 연구가 필요하다
태를 관찰할 수 있음을 보여 주었다. 향후 보다 정확한 형태복원을 위해서는 3차원 단층 정보를 제공하는 공초점 현미 경영상을 이용하여 단층 영상을 비교하거 나 또는 3 차원으로 형태를 복원하여 결과를 비교하는 실험을 진행해 봐야 할것이다. 또한 배양 당시 겹쳐져 있거나위 아래에 붙어서 보이지 않는 세포에 대한 연구가 필요하다
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