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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 두릅나무의 항고혈압 효과를 알아보고자 수컷 선천성 고혈압 쥐 (spontaneously hypertensive rat, SHR)에 에탄올 추출물을 투여 후, 항고혈압 약물인 amlodipine의 효과와 비교하였다.
제안 방법
- 4. MDA contents in the (A) heart, (B) kidney, (C) liver, and (D) brain of SHR treated with vehicle (control, C), Aralia elata (10 mg/kg, A10; 50 mg/kg, A50) and amlodipine (10 mg/kg, Am) at the end of the experiment. Data are presented as the mean SEM.
- 내피 비의존성 혈관 이완성은 내피세포를 제거한 흉대동맥에서 NE 10−7M로 전 수축시킨 후 SNP를 최종 농도 10−3M이 되도록 누적 투여하여(10−10~10−3M) 관찰하였으며, 실험군과 대조군 사이의 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 5B).
- 내피세포 비의존성 이완 실험은 흉대동맥 환상 절편 내부에 18-Gage의 척추 천자침을 삽입하여 몇 차례 회전시켜 내피세포를 제거한 혈관에서 NE 10−7M로 혈관을 전 수축시킨 후 NO donor인 sodium nitroprusside(SNP)를 누적 적용하여 각 군의 이완반응을 관찰하였다.
- 내피세포 의존성 이완실험은 내피세포가 건재한 혈관에 10−7M의 norepinephrine(NE)을 처리하여 혈관을 전 수축시킨 후 acetylcholine(Ach)을 누적 적용하여 이완반응을 관찰하고, pD2(−Log EC50)를 계산하였다.
- 혈압은 간접법(tail cuff method)으로 매주 측정하였다. 먼저 실험동물을 36oC에서 15~20분간 안정시킨 후, tail cuff와 pulse transducer(MLT 1050; ADInstruments, USA)를 꼬리에 부착하고, pulse transducer를 physiograph recorder에 연결하여 수축기 혈압을 측정하였다.
- 실험 최종일에 모든 실험동물을 CO2 gas로 희생시킨 후 복대정맥으로 혈액을 채취하고 심장, 간, 신장 및 뇌를 적출하였다. 장기의 중량 변화를 보기 위하여 각각 적출된 장기의 무게를 실험동물의 체중으로 나누어 장기 무게 지표(organ weight index)를 구하였다.
- 두릅나무는 음지에서 건조한 후 미세하게 잘라 10배 부피의 95% 에탄올을 가하여 침출시킨 후 상등액을 여과했다. 여과된 침출물을 회전농축기로 농축 후 동결건조하여 건 고물(에탄올 추출물)을 만들었다. 에탄올 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹인 후 생리식염수로 희석, DMSO 농도가 최종 5% 이하가 되게 하여 실험에 사용하였다.
- gas로 희생시킨 후 복대정맥으로 혈액을 채취하고 심장, 간, 신장 및 뇌를 적출하였다. 장기의 중량 변화를 보기 위하여 각각 적출된 장기의 무게를 실험동물의 체중으로 나누어 장기 무게 지표(organ weight index)를 구하였다.
- 본 연구에서의 모든 동물실험은 제주대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 하에 수행되었다(2007-0021). 투여 처리는 2가지 농도의 두릅나무 에탄올 추출물 투여군(10 mg/kg, 50mg/kg), amlodipine 투여군(10 mg/kg), 그리고 대조군(5% DMSO)으로 나누어 8주간 1일 1회 경구 투여하였다.
- 혈관의 이완성을 조사하기 위해 흉대동맥을 적출하여 3~5mm의 환상 절편(aortic ring)을 만들고 Krebs solution(in mM, NaCl 120, KCl 4.75, Glucose 6.4, NaHCO3 25, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2 and CaCl2 1.7)으로 채운 organ bath에 현수하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 14주령의 수컷 선천성 고혈압 쥐를 대한바이오링크사(대한민국)로부터 구매하여 일주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사료와 물은 자유롭게 공급하였으며, 명암주기가 12시간 단위로 조절되는 실험동물실에서 사육하였다.
- 여과된 침출물을 회전농축기로 농축 후 동결건조하여 건 고물(에탄올 추출물)을 만들었다. 에탄올 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹인 후 생리식염수로 희석, DMSO 농도가 최종 5% 이하가 되게 하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 그룹 간 유의차 비교를 위해 Duncan’s multiple range test를 실시하였고, p 값이 0.05미만일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
- 모든 실험결과는 mean ± SEM으로 나타내었으며, 통계분석은 SPSS Program(ver. 12.0 for Windows; SPSS, USA)을 이용, ANOVA 분석하였다.
- 혈관의 수축·이완반응은 고정된 환상 절편의 다른 한쪽을 isometric force-displacement transducer(FT03, Grass; ADInstruments)에 연결시켜 physiograph recorder(PowerLab/400; ADInstruments)로 기록하고, Chart7 program으로 분석하였다.
이론/모형
- 조직의 MDA함량은 thiobarbituric acid reactive substance assay [34]를 이용하여 측정하였다. 조직에 1.
- 혈압은 간접법(tail cuff method)으로 매주 측정하였다. 먼저 실험동물을 36oC에서 15~20분간 안정시킨 후, tail cuff와 pulse transducer(MLT 1050; ADInstruments, USA)를 꼬리에 부착하고, pulse transducer를 physiograph recorder에 연결하여 수축기 혈압을 측정하였다.
- 채취한 혈액을 EDTA가 포함된 시험관에 넣어 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장 내 NO의 농도는 Miranda 등 [21]의 방법으로 측정하였다. 혈장에 2배 부피의 에탄올을 가하여 850 × g로 10분간 원심분리하여 단백질을 제거하였다.
성능/효과
- amlodipine 10 mg/kg을 투여한군에서 또한 30.40 ± 1.52 µM로 증가했으나, 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군보다 낮은 수준의 증가폭을 나타내었다(Fig. 3)
- 간에서의 MDA는 대조군에서는 0.45 ± 0.02 nmole/mg, 추출물 10 mg/kg와 50 mg/kg 투여군에서는 각각 0.36 ± 0.03 nmole/mg, 0.29 ± 0.03 nmole/mg로 나타나 대조군에 비하여 투여 용량이 많을수록 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 간의 경우에는 대조군 3.70 ± 0.07, 추출물 10 mg/kg과 50 mg/kg 투여군에서 각각 3.20 ± 0.09, 2.97 ± 0.18, 그리고 amlodipine 10 mg/kg 투여군에서 3.02 ± 0.15로 나타나, 모든 투여군이 대조군보다 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다(p < 0.05, p < 0.01) (Fig. 2C).
- 2 mmHg 감소한 것으로 나타났다. 결과적으로 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군은 amlodipine 10 mg/kg을 투여한 군과 비슷한 혈압강하 효과를 보였다(Fig. 1A). 반면 심박수는 모든 처리군에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다(Fig.
- 두릅나무의 에탄올 추출물과 amlodipin의 혈관내피세포 반응성 및 기능에 미치는 영향을 관찰한 결과 Ach에 대한 혈관 이완반응, 즉 혈관내피세포 의존성 이완반응은 두릅나무의 에탄올 추출물과 amlodipine을 투여한 군에서 많이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 SNP에 대한 혈관 이완반응 즉, 혈관내피세포 비의존성 이완반응은 처리군 간의 유의적인 차이가 없는 것을 관찰하였다. 혈관내피세포는 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 흡연, 동맥경화증과 같은 여러 위험인자에 의하여 손상을 받으며 [17, 18], 특히 과산화물(superoxide)과 같은 활성산소류에 의해 혈관내피세포 확장인자인 NO가 불활성화되어 내피세포 기능 이상이 유발된다[9, 11, 24].
- 뇌에서의 MDA는 대조군에서는 1.91 ± 0.06 nmole/mg였으며, 추출물 10 mg/kg과 50 mg/kg 투여군에서는 각각 1.76 ± 0.06 nmole/mg, 1.53 ± 0.06 nmole/mg로 대조군에 비하여 투여 용량이 많을수록 감소하였다.
- 두릅나무의 에탄올 추출물 10, 50 mg/kg, amlodipine 10mg/kg을 8주간 투여하여 마지막 날 내피세포가 건재한 흉대동맥에서 NE 10−7M로 전 수축시킨 후 Ach를 최종 농도 10−3M이 되도록 누적 투여하여(10−10~10−3M) 이완효과를 관찰한 결과 대조군에서는 최대 22.13 ± 0.89% 이완성이 관찰되었고 두릅나무의 에탄올 추출물 10 mg/kg과 50 mg/kg 투여군에서는 각각 34.60 ± 3.16%, 46.12 ± 3.25%(pD2: 6.31 ± 0.14)로 투여 용량이 많을수록 혈관이완 효과가 증가하는 결과를 보였다.
- 두릅나무의 에탄올 추출물과 amlodipine 10 mg/kg을 8주간 투여하여 각 조직에서 MDA 양을 측정한 결과 심장에서는 대조군이 1.21 ± 0.10 nmole/mg이었으며 추출물 10 mg/kg, 50 mg/kg 투여군에서는 각각 1.05 ± 0.06 nmole/mg, 0.93 ± 0.02 nmole/mg로 대조군에 비하여 투여 용량이 많을수록 감소하였다.
- 두릅나무의 에탄올 추출물과 amlodipin의 혈관내피세포 반응성 및 기능에 미치는 영향을 관찰한 결과 Ach에 대한 혈관 이완반응, 즉 혈관내피세포 의존성 이완반응은 두릅나무의 에탄올 추출물과 amlodipine을 투여한 군에서 많이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 SNP에 대한 혈관 이완반응 즉, 혈관내피세포 비의존성 이완반응은 처리군 간의 유의적인 차이가 없는 것을 관찰하였다.
- 혈관내피세포는 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 흡연, 동맥경화증과 같은 여러 위험인자에 의하여 손상을 받으며 [17, 18], 특히 과산화물(superoxide)과 같은 활성산소류에 의해 혈관내피세포 확장인자인 NO가 불활성화되어 내피세포 기능 이상이 유발된다[9, 11, 24]. 따라서 투여군의 혈관 내피세포 의존성 이완반응이 증가한 것은 선천성 고혈압 쥐에서 활성산소류가 혈관 확장물질인 NO의 이용도를 저하해 결과적으로 내피세포 의존성 이완반응의 저하를 유발하게 되며, 두릅나무의 에탄올 추출물과 amlodipine에 의해 호전될 수 있는 것으로 판단된다.
- 모든 처리군에서 대조군보다 유의한 감소가 관찰되었다(p < 0.05, p < 0.01).
- 고혈압에서는 산화적 손상 때문에 조직의 MDA의 함량이 증가하게 되며, 그 때문에 항산화 효과가 있는 약물의 투여 시 체내의 산화적 손상을 감소시켜줌으로써 조직 내 MDA 함량이 감소한다는 보고가 있다 [6, 23]. 본 연구에서도 두릅나무 에탄올 추출물과 amlodipine이 조직 내 MDA 함량을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 두릅나무 에탄올 추출물과 amlodipine의 항산화 효과에 의한 것이라 판단할 수 있다.
- 선천성 고혈압 쥐에 두릅나무의 에탄올 추출물을 투여한 실험군의 혈압을 8주간 측정한 결과 1주째부터 대조군과 비교하여 모두 유의하게 혈압이 강하되었다. 특히 50 mg/kg 투여군은 amlodipine 10 mg/kg 투여군과 유사한 수준의 혈압강화 효과를 보여, 고혈압 치료제로서의 가능성을 제시하였다.
- 신장 무게 비율은 대조군에서 0.61 ± 0.03, 추출물 10 mg/kg과 50 mg/kg 투여군에서 각각 0.55 ± 0.02, 0.51 ± 0.01으로 나타났고, amlodipine 10 mg/kg 투여군에서는 0.51 ± 0.01이었다(Fig. 2B).
- 신장에서의 MDA는 대조군에서는 0.72 ± 0.06 nmole/mg이었으며 추출물 10 mg/kg, 50 mg/kg 투여군에서는 각각 0.62 ± 0.05 nmole/mg, 0.47 ± 0.05 nmole/mg로, 대조군에 비하여 투여 용량이 많을수록 감소하였다.
- 이상의 결과와 같이 두릅나무의 에탄올 추출물은 선천적 고혈압 쥐에서 내피세포를 통한 혈관 이완성의 증대, 지질과산화의 완화, 그리고 장기 손상 방어 등의 효과가 있는 것이 관찰되어, 우수한 항고혈압 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 체중에 대한 심장 무게 비율은 대조군에서 0.47 ± 0.01이었으며, 두릅나무의 에탄올 추출물 10 mg/kg과 50 mg/kg 투여군은 각각 0.40 ± 0.01, 0.36 ± 0.02로 대조군보다 유의하게 투여 용량이 많을수록 감소하는 경향을 보였다(p < 0.05, p < 0.01).
- 추출물 50 mg/kg 투여군과 amlodipine 10 mg/kg 투여군에서는 1주일째에 각각 159.2 ± 1.5, 158.9 ± 1.4 mmHg로 빠르게 감소하였고, 강하된 혈압이 투여기간 동안 비교적 안정하게 지속되었다.
- 4 mmHg로 빠르게 감소하였고, 강하된 혈압이 투여기간 동안 비교적 안정하게 지속되었다. 투여 마지막인 8주째의 혈압 측정 결과 투여 전보다 10 mg/kg 투여군은 평균 34.2 mmHg, 50 mg/kg 투여군은 38.3 mmHg, amlodipine 10 mg/kg 투여군은 39.2 mmHg 감소한 것으로 나타났다. 결과적으로 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군은 amlodipine 10 mg/kg을 투여한 군과 비슷한 혈압강하 효과를 보였다(Fig.
- 투여군의 MDA 함량을 비교한 결과 투여 용량이 많을수록 그 수치가 감소함을 관찰하였고 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군은 amlodipine을 투여한 군과 비슷한 수준의 감소효과를 보였다. MDA는 생체 내 지질 과산화의 최종산물로서 생체 내의 산화적 손상을 평가하는 지표가 된다.
- 투여군의 장기 중량 변화를 관찰한 결과 대조군과 비교하여 모두 유의성 있는 중량감소가 나타났다. 특히 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군의 심장, 신장, 그리고 간은 amlodipine 10 mg/kg을 투여한 군보다 중량의 감소 폭이 더욱 크거나 유사한 것으로 나타났다.
- 투여군의 혈장에서 NO 농도를 비교한 결과, 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군에서 유의한 증가 효과가 나타났다. NO는 soluble guanylate cyclase의 heme prosthetic group과 결합하여 세포 내 cyclic GMP level을 증가시켜 혈관 평활근의 이완을 초래한다 [7].
- 선천성 고혈압 쥐에 두릅나무의 에탄올 추출물을 투여한 실험군의 혈압을 8주간 측정한 결과 1주째부터 대조군과 비교하여 모두 유의하게 혈압이 강하되었다. 특히 50 mg/kg 투여군은 amlodipine 10 mg/kg 투여군과 유사한 수준의 혈압강화 효과를 보여, 고혈압 치료제로서의 가능성을 제시하였다. 반면 심박수는 대조군과 비교할 때 유의한 변화는 관찰되지 않았는데, 따라서 두릅 추출물의 항고혈압 효능은 심박출량보다는 말초혈관 저항의 감소에 기인하는 것으로 생각된다.
- 투여군의 장기 중량 변화를 관찰한 결과 대조군과 비교하여 모두 유의성 있는 중량감소가 나타났다. 특히 두릅나무의 에탄올 추출물 50 mg/kg을 투여한 군의 심장, 신장, 그리고 간은 amlodipine 10 mg/kg을 투여한 군보다 중량의 감소 폭이 더욱 크거나 유사한 것으로 나타났다. 고혈압은 여러 장기에 손상을 주는데, 특히 심장, 신장 및 뇌에 손상을 준다.
- 혈장의 NO 양을 측정한 결과 대조군에서는 10.73 ± 1.12µM, 두릅나무의 에탄올 추출물 10 mg/kg, 50 mg/kg 투여군에서 각각 17.51 ± 3.84 µM, 47.69 ± 2.94 µM로 투여 용량이 많을수록 증가함을 보였다.
후속연구
- 또한 근본적인 치료가 불가능하기 때문에 이러한 약물을 평생 복용해야 하는 문제점이 있는 것으로 알려져 있으며 [1], 최근 자생식물을 이용하여 새로운 약리 활성 물질을 찾고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다. 본 연구에 이용된 두릅나무는 세포보호 효과[25], 혈당저하 및 당뇨병에 대한 효과 [16, 26], 알코올 흡수저해효과 [31, 32] 등의 여러 약리효과 및 항산화 효과 [2]가 있음이 보고되고 있어, 고혈압에도 긍정적인 영향이 있을 것으로 기대된다.
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