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문제 정의
- 본 연구는 식품의약품안전평가원 가이드라인에 따라 마우스를 이용하여 정제봉독의 피부감작성 시험을 조사하였다. 실험 시작 후 8일이 지나 관찰한 결과 마우스 배측에 홍반이 나타나지 않았고, ATP 수치에 의한 평균자극지수 결과에 의하면 자극기준 이하에 해당하여 봉독 0.
제안 방법
- 1% 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate) 용액을 붓을 이용하여 마우스 귀 배측에 도포 하고 1시간 후 시험물질(0.005, 0.01% 봉독), 용매, 양성대조물질(25% 헥실신나믹알데하이드, hexyl cinnamic aldehyde)을 25 μl씩 처치하였다.
- 05% 봉독함유 제품을 제조하여 인체적용 시험을 수행하기 전에 동일 농도로 인체 피부자극 시험을 수행하였다. 48시간 후 첩포를 제거한 후에는 skin marker(Chemotechnique diagnostics AB, Sweden)로 시험 부위를 표시하고 30 분, 24 시간 후에 각 시험 부위를 관찰하였다. 피부 반응은 Frosch & Kligman 법14)을 반영한 기준에 따라 평가하였으며(Table I), 48시간 및 72시간의 평균 반응도는 다음의 식을 이용하여 계산하였고 CTFA 가이드라인(The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association, Safety testing guidelines)15)에 따라 평균반응도를 판정하였다(Table II).
- 시험 8일째 임상증상을 관찰하고 마우스의 이개림프절(auricular lymph node)을 적출하여 약하게 압력을 가해 으깨서 단일 림프절 세포(lymph node cell)로 만들고, 각 동물마다 두 개의 시료를 준비하여 ATP의 양이 감소하지 않도록 30분 이내 ATP 양을 측정하였다. ATP 시험은 luminescence ATP detection assay system을 이용한 ATPLITETM(Perkin ElmerTM Lifesciences, USA) kit를 사용하여 표준매뉴얼대로 측정하였다. 시험군의 결과는 평균 자극지수(mean SI)로 표현하였다.
- 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 사육장의 실내 온도는 21~23°C, 상대습도는 50.0~60.0%, 조도는 200~300 Lux로 12시간 명암주기가 되도록 조절하였다.
- 본 연구에서는 봉독을 이용한 안전성 평가 방법 중 기존 연구와는 다른 대상과 항목을 적용하여 시험하였다. 정제봉독을 화장품 원료 또는 의약품 외용제로 이용하는데 있어 인체 피부에 대한 안전성을 평가하기 위해 마우스를 이용하여 피부 감작성 시험을 수행하고 이를 바탕으로 인체에 직접 적용하여 피부 자극성시험을 수행하였다.
- 첩포부위인 등을 70% 에탄올로 소독한 후 시험물질 16 μl가 적용된 8 mm 핀 챔버(Finn Chamber®: SmartPractice, Denmark)를 첩포하였다. 봉독의 제품화를 고려하고, 제품 내 봉독의 안정성 및 유효성을 감안하여 동물실험의 최고 농도인 0.01%보다 높은 0.05% 봉독함유 제품을 제조하여 인체적용 시험을 수행하기 전에 동일 농도로 인체 피부자극 시험을 수행하였다. 48시간 후 첩포를 제거한 후에는 skin marker(Chemotechnique diagnostics AB, Sweden)로 시험 부위를 표시하고 30 분, 24 시간 후에 각 시험 부위를 관찰하였다.
- 01% 봉독), 용매, 양성대조물질(25% 헥실신나믹알데하이드, hexyl cinnamic aldehyde)을 25 μl씩 처치하였다. 시험 8일째 임상증상을 관찰하고 마우스의 이개림프절(auricular lymph node)을 적출하여 약하게 압력을 가해 으깨서 단일 림프절 세포(lymph node cell)로 만들고, 각 동물마다 두 개의 시료를 준비하여 ATP의 양이 감소하지 않도록 30분 이내 ATP 양을 측정하였다. ATP 시험은 luminescence ATP detection assay system을 이용한 ATPLITETM(Perkin ElmerTM Lifesciences, USA) kit를 사용하여 표준매뉴얼대로 측정하였다.
- 자극지수는 시험군과 양성대조군의 평균 RLU(mean Relative Luminescence Units /mouse)를 용매대조군의 평균 RLU로 나눈 값으로 용매대조군의 평균 SI를 1로 정하고, SI≥1.8이면 양성으로 간주하였다.
- 본 연구에서는 봉독을 이용한 안전성 평가 방법 중 기존 연구와는 다른 대상과 항목을 적용하여 시험하였다. 정제봉독을 화장품 원료 또는 의약품 외용제로 이용하는데 있어 인체 피부에 대한 안전성을 평가하기 위해 마우스를 이용하여 피부 감작성 시험을 수행하고 이를 바탕으로 인체에 직접 적용하여 피부 자극성시험을 수행하였다.
- 첩포부위인 등을 70% 에탄올로 소독한 후 시험물질 16 μl가 적용된 8 mm 핀 챔버(Finn Chamber®: SmartPractice, Denmark)를 첩포하였다.
- 피부 감작성 시험: local lymph node assay (LLNA: DA) − 피부 감작성 시험은 국소림프절시험을 이용하여 수행하였다.
대상 데이터
- 봉독시료 − 본 연구에 사용된 봉독은 정제봉독(청진바이오텍(주), 한국)을 사용하였고, 부형제로는 프로판디올((주)엑티브온, 한국), 글리세린(IOI oleochemical, 말레이시아) 등을 사용하였고, 이들 성분을 적량 혼합하여 봉독 시료를 제조하여 사용하였다.
- 시험 대상자 − 피부질환이 없는 건강한 18 - 60세의 남녀 30명(평균연령 41.83 ± 3.63세)을 대상으로 시험을 실시하였다.
- 실험동물 − 실험동물은 8-12주령 CBA/J 암컷 마우스를(주)코아텍(평택, 한국)에서 구입하여 1주일 이상 사육장 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- ATP 시험은 luminescence ATP detection assay system을 이용한 ATPLITETM(Perkin ElmerTM Lifesciences, USA) kit를 사용하여 표준매뉴얼대로 측정하였다. 시험군의 결과는 평균 자극지수(mean SI)로 표현하였다. 자극지수는 시험군과 양성대조군의 평균 RLU(mean Relative Luminescence Units /mouse)를 용매대조군의 평균 RLU로 나눈 값으로 용매대조군의 평균 SI를 1로 정하고, SI≥1.
이론/모형
- 피부 감작성 시험: local lymph node assay (LLNA: DA) − 피부 감작성 시험은 국소림프절시험을 이용하여 수행하였다. 각 군마다 5마리씩을 사용하였으며, 식품의약품 안전평가원 화장품 독성시험 동물대체시험법 가이드라인11)에 따라 평가하였다. 1% 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate) 용액을 붓을 이용하여 마우스 귀 배측에 도포 하고 1시간 후 시험물질(0.
- 인체 피부 자극시험(48 h single patch test) − 인체 피부 첩보시험은 헬싱키 선언에 근거한 윤리규정12) 및 식품의약품안전처 인체적용시험가이드라인의 관련 규정13)에 따라 시행되었다.
- 피부 반응은 Frosch & Kligman 법14)을 반영한 기준에 따라 평가하였으며(Table I), 48시간 및 72시간의 평균 반응도는 다음의 식을 이용하여 계산하였고 CTFA 가이드라인(The Cosmetic Toiletry and Fragrance Association, Safety testing guidelines)15)에 따라 평균반응도를 판정하였다(Table II).
성능/효과
- 18) 또한, 기니아 피그를 이용하여 봉독의 피부광독성과 민감성을 시험한 결과 홍반과 부종을 보이지 않아 독성이 없음을 확인하고, 의약품의 재료로 쓸 수 있다고 하였다.19) 봉독을 인체 피부에 적용시킨 연구에서 봉독을 함유한 연고를 아토피 환자에 적용시켰을 때 안전하고 효과적이라고 평가하였다.20) 봉독의 피부자극 연구는 주로 동물을 대상으로 실험이 이뤄지고 있으며 본 연구의 봉독 농도보다 더 높은 농도에도 비자극성으로 보고되고 있으나 본 연구에서 인체를 대상으로 시험한 결과에서는 몇몇 자극을 확인하였다.
- 이러한 다양한 효과를 갖는 봉독은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)와 아파민(apamin), 멜리틴(melittin) 등 40여가지 단백질, 효소, 아민으로 구성5)되어 있으며, 그 중 멜리틴을 주성분으로 한다. 멜리틴은 선행 연구를 통하여 여러 종류의 세포에 작용하여 항산화, 항염증 효과를 가지며,7) 여드름 균(Propionibacterium aces)에 대한 항균 및 피부염증반응을 억제시킴으로써 피부질환의 치료 약제로 이용할 수 있음을 확인하였다.8) 또한, 이를 유효성분으로 하는 정제봉독으로 피부주름 억제 및 미백효과를 측정하였고,9) 동물실험을 통해 피부자극 및 안점막자극 시험에서 독성이 없음을 입증하여 화장품 원료로 쓰기에 적합하다고 인정받고 있다.
- 16) 피부 감작성 시험인 국소림프절시험(local lymph node assay, LLNA:DA)은 ATP 정량을 통해 림프세포 증식을 측정하는 정량적 방법이다. 본 실험에서 동물을 이용하여 피부 감작성 시험을 시행한 결과 대조군의 평균 자극지수(mean SI) 값을 기준으로 봉독의 SI값이 모두 식약처가이드라인11) 이하였으며, 마우스의 귀 배측에서 홍반도 보이지 않아 봉독 0.005%, 0.01%에서는 동물피부에 자극이 없음을 보였다.
- 본 연구는 식품의약품안전평가원 가이드라인에 따라 마우스를 이용하여 정제봉독의 피부감작성 시험을 조사하였다. 실험 시작 후 8일이 지나 관찰한 결과 마우스 배측에 홍반이 나타나지 않았고, ATP 수치에 의한 평균자극지수 결과에 의하면 자극기준 이하에 해당하여 봉독 0.005%, 0.01%에서는 피부에 자극이 없음을 확인하였다.
- 31)에서는 양성반응이 확인되었다(Table III). 실험 시작 후 8일째 되는 날, 마우스의 귀 배측을 관찰한 결과, 양성대조군에서 홍반이 관찰되었으나, 봉독을 바른 시험군에서는 홍반이 관찰되지 않았다(Fig. 1). 홍반 관찰과 ATP 수치 확인을 통해 봉독은 상기 농도에서 피부에 자극을 주지 않은 것으로 확인되었다.
- 실험이 정상적으로 시행되었는지 확인하기 위한 양성대조군인 25% 헥실신나믹알데하이드를 처리했던 군(2.21±0.31)에서는 양성반응이 확인되었다(Table III).
- 화장품 부작용 경험, 아토피나 여드름같은 피부질환은 없었으며, 흡연자도 없었다. 알러지 유무의 경우 음식과 빛 알러지는 없었고, 금속 알러지가 있는 경우는 존재하였으나 시험결과에 영향을 미치지 않을 것으로 판단하였다.
- 이를 바탕으로 건강한 피부를 가진 30명을 대상으로 봉독 0.05%의 용량을 인체에 적용하여 피부 첩보 시험을 시행한 결과 2명의 피험자가 1+ 또는 3+ grade의 피부반응을 보여 인체피부의 자극 측면에서 중자극 범주의 물질로 판단되었다.
- 피부 감작성 시험 −용매대조군의 평균 자극지수(mean SI) 값을 1로 산정한 후 비교한 결과, 봉독 0.005%(1.33±0.32), 0.01%(0.66±0.23) 두 농도에서 자극기준인 SI값이 모두 1.8 이하였으므로 상기 농도에서는 피부에 자극이 없음을 알 수 있었다.
- 1). 홍반 관찰과 ATP 수치 확인을 통해 봉독은 상기 농도에서 피부에 자극을 주지 않은 것으로 확인되었다.
후속연구
- 하지만 봉독은 알러지를 일으킬 수 있는 물질(allergens)을 함유한 복합체로 과민반응(anaphylaxis)에 대한 염려로 광범위하게 사용할 수 없었으나, 현재는 알러지를 유발하는 물질을 규명하여 이를 제거하고 유효물질만 분리하여 사용하고 있다.5) 약리적 효과가 크지만 안전성이 확보되지 않아 화장품이나 의약품으로의 적용이 어려웠던 봉독을 이용하기 위해서는 인체 피부 안전성에 대한 연구가 필요하다.
- 20) 봉독의 피부자극 연구는 주로 동물을 대상으로 실험이 이뤄지고 있으며 본 연구의 봉독 농도보다 더 높은 농도에도 비자극성으로 보고되고 있으나 본 연구에서 인체를 대상으로 시험한 결과에서는 몇몇 자극을 확인하였다. 이는 향후 화장품 원료 또는 의약품 외용제로 이용하기 위해서는 더 많은 안전성 시험을 수행할 필요가 있다고 보여진다.
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