[국내논문]겨울철 양식 능성어의 바이러스성뇌망막증(VER) 감염사례 A Case Study of Mortality Caused by Viral Encephalopathy and Retinopathy (VER) in Cultured Sevenband Grouper, Epinephelus septemfasciatus during Winter원문보기
2015년 겨울, 우리나라 남해안 소재 육상 양식장에서 사육 중이던 능성어의 약 30%가 폐사하였다. 수온 $9{\sim}12^{\circ}C$의 겨울철에 발생한 능성어 폐사는 신경괴사성바이러스 (NNV) 감염에 의한 바이러스성뇌망망증 (VER)으로 밝혀졌다. 시험어는 비정상적인 유영, 배를 위로한 채 수면을 떠 다니는 현상, 체색흑화, 안구백탁 및 부레의 과도한 팽창 소견을 보였다. 원인 바이러스는 일반적으로 고수온기 능성어에 감염되는 RGNNV genotype이 아닌, 냉수성 어류에서 분리되는 BFNNV genotype으로 밝혀졌으며, NNV 가장 근연관계가 높은 Pacific cod betanodavirus (PCNNV)와 99.7~100% 상동성을 보였다. 병리조직학적 관찰 결과, 바이러스성뇌망망증 (VER)의 특징적인 병변인 뇌조직의 공포화 및 괴사를 수반하였다. 이 연구는 수온 $12^{\circ}C$ 이하의 겨울철에 능성어에 감염된 BFNNV genotype에 대한 첫 보고이다.
2015년 겨울, 우리나라 남해안 소재 육상 양식장에서 사육 중이던 능성어의 약 30%가 폐사하였다. 수온 $9{\sim}12^{\circ}C$의 겨울철에 발생한 능성어 폐사는 신경괴사성바이러스 (NNV) 감염에 의한 바이러스성뇌망망증 (VER)으로 밝혀졌다. 시험어는 비정상적인 유영, 배를 위로한 채 수면을 떠 다니는 현상, 체색흑화, 안구백탁 및 부레의 과도한 팽창 소견을 보였다. 원인 바이러스는 일반적으로 고수온기 능성어에 감염되는 RGNNV genotype이 아닌, 냉수성 어류에서 분리되는 BFNNV genotype으로 밝혀졌으며, NNV 가장 근연관계가 높은 Pacific cod betanodavirus (PCNNV)와 99.7~100% 상동성을 보였다. 병리조직학적 관찰 결과, 바이러스성뇌망망증 (VER)의 특징적인 병변인 뇌조직의 공포화 및 괴사를 수반하였다. 이 연구는 수온 $12^{\circ}C$ 이하의 겨울철에 능성어에 감염된 BFNNV genotype에 대한 첫 보고이다.
In 2015, a nervous necrosis virus (NNV) was isolated from sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, maintained in land-based aquaculture system at below $12^{\circ}C$ in winter. Mortality was up to 30% in brood fish, over 4 kg of body weight. Moribund fish showed clinical sings typi...
In 2015, a nervous necrosis virus (NNV) was isolated from sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, maintained in land-based aquaculture system at below $12^{\circ}C$ in winter. Mortality was up to 30% in brood fish, over 4 kg of body weight. Moribund fish showed clinical sings typical of viral encephalopathy and retinopathy (VER), also called viral nervous necrosis (VNN), such as uncoordinated, corkscrew-like swimming behavior, belly-up at rest, darkening of body, cloudy eyeball and hyperinflation of the swim bladder. Aetiology of the disease was confirmed by gross observation of clinical signs, histopathology and molecular diagnosis. Histological studies revealed severe vacuolation and necrosis in the brain. Molecular diagnosis by revere transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) specific to batanodavirus yielded a positive result. The nucleotide sequences of the PCR-amplified fragment were 99.48~100% similar to barfin flounder nervous necrosis virus (BFNNV) genotype and most closely aligned with Pacific cod betanodavirus (PCNNV). This is the first report of natural batanodavirus, NNV infection in sevenband grouper reared in low water temperature during winter (below $12^{\circ}C$) in Korea.
In 2015, a nervous necrosis virus (NNV) was isolated from sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, maintained in land-based aquaculture system at below $12^{\circ}C$ in winter. Mortality was up to 30% in brood fish, over 4 kg of body weight. Moribund fish showed clinical sings typical of viral encephalopathy and retinopathy (VER), also called viral nervous necrosis (VNN), such as uncoordinated, corkscrew-like swimming behavior, belly-up at rest, darkening of body, cloudy eyeball and hyperinflation of the swim bladder. Aetiology of the disease was confirmed by gross observation of clinical signs, histopathology and molecular diagnosis. Histological studies revealed severe vacuolation and necrosis in the brain. Molecular diagnosis by revere transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) specific to batanodavirus yielded a positive result. The nucleotide sequences of the PCR-amplified fragment were 99.48~100% similar to barfin flounder nervous necrosis virus (BFNNV) genotype and most closely aligned with Pacific cod betanodavirus (PCNNV). This is the first report of natural batanodavirus, NNV infection in sevenband grouper reared in low water temperature during winter (below $12^{\circ}C$) in Korea.
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문제 정의
이번 연구는 능성어 VER이 보고된 적이 없는 수온 12℃ 이하의 겨울철 양식환경에서 NNV가 원인으로 추정되는 능성어 폐사가 발생하여, 이에 대한 연구결과를 처음으로 보고하였다.
이번 연구는 수온 9~12℃의 겨울철, 우리나라 양식 능성어에서 발생한 BFNNV genotype (not RGNNV genotype) 감염사례로, 바이러스성뇌망망증 (VER)의 전형적인 임상증상 (이상유영, 뇌충혈 및 부레 과팽창)과 병리조직학적 소견(뇌조직의 공포화 및 괴사)을 동반한 폐사 발생에 대한 첫 보고이다.
제안 방법
시험 어를 무균적으로 해부하여 적출한 신장, 비장 및 뇌를 시료로 하여, DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany), RNA는 TRIZOL® Reagent (Invitrogen, USA)을 이용하여 분리한 후, SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RSIV의 PCR 분석을 위해 분리된 DNA를 template로 사용하였으며, 그 외 VHSV, MBV 및 NNV의 PCR 분석을 위해 분리된 RNA에서 합성한 cDNA를 사용하였다. PCR 분석은 ExTaq® hotstart version (Takara, Japan)을 사용하였으며, primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다.
능성어 폐사가 발생한 육상 양식장은 매일 오전 10시에 수온을 측정하였으며, 폐사가 발생하기 시작한 2월 중순부터 본 연구를 위한 조사를 실시한 3월 중순까지의 수온을 포함한 2015년 1월부터 3월 중순까지의 수온을 분석하였다(Fig. 1). 조사기간 동안의 수온 범위는 8.
능성어 폐사가 발생한 육상 양식장은 매일 오전 10시에 수온을 측정하였으며, 폐사가 발생하기 시작한 2월 중순부터 본 연구를 위한 조사를 실시한 3월 중순까지의 수온을 포함한 2015년 1월부터 3월 중순까지의 수온을 분석하였다. 수온 측정 위치는 5 kg 전후의 친어 수조와 2년생어 수조에 동일하게 공급되는 사육수가 수조로 유입되기 직전에 측정하였다.
시험어는 크게 두 그룹으로, 500톤 크기의 콘크리트 수조에서 사육 중인 5 kg 전후의 친어(10~15년생)와 50톤 크기의 FRP 수조에 사육 중인 400 g 전후의 2년생 성어였다. 사육수는 해수를 직접 사용(직수)하였으며, 1일 3회전하였다. 시험에는 능성어 친어(n=6, 4,996.
시험어에 대한 내·외부 임상증상을 확인하였으며, 체표, 지느러미, 아가미 및 각 내부 장기를 슬라이드 글라스에 고정한 후 광학현미경으로 기생충 감염 여부를 확인하였다. 세균성 질병 조사를 위해서, 시험어를 무균적으로 해부하여 신장, 비장, 간 등의 내부 장기 및 체표 환부를 NaCl 1.5% 첨가 TSA(Tryptic soy agar, BD) 배지, NaCl 1.5% 첨가 BHIA(Brain hear infusion agar, BD) 배지, TCBS (Thiosulfate citrate bile sucrose) 배지, SS (Salmonella shigella agar) 배지 등에 접종하여 20℃, 24~48시간 배양하여 균의 성상을 확인하였으며 이를 순수분리하여 이후의 실험에 사용하였다.
능성어 폐사가 발생한 육상 양식장은 매일 오전 10시에 수온을 측정하였으며, 폐사가 발생하기 시작한 2월 중순부터 본 연구를 위한 조사를 실시한 3월 중순까지의 수온을 포함한 2015년 1월부터 3월 중순까지의 수온을 분석하였다. 수온 측정 위치는 5 kg 전후의 친어 수조와 2년생어 수조에 동일하게 공급되는 사육수가 수조로 유입되기 직전에 측정하였다.
시험 어를 무균적으로 해부하여 적출한 신장, 비장 및 뇌를 시료로 하여, DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany), RNA는 TRIZOL® Reagent (Invitrogen, USA)을 이용하여 분리한 후, SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
시험어에 대한 내·외부 임상증상을 확인하였으며, 체표, 지느러미, 아가미 및 각 내부 장기를 슬라이드 글라스에 고정한 후 광학현미경으로 기생충 감염 여부를 확인하였다.
시험어의 각 조직 (간, 신장, 비장, 심장, 뇌, 장, 위, 근육)을 적출하여 10% 중성포르말린(10% neutral buffer formalin, BNF)에 고정하고, 24시간 후 각 장기를 세절한 다음 동고정액에 재고정하였다. 재고정한 기관은 일반적인 조직처리 과정을 따라 70, 80, 90, 95 및 100% 알콜에 탈수·탈지 과정을 거친 후 xylene에 탈알콜시켜 파라핀으로 포매하였다.
시험에는 능성어 친어(n=6, 4,996.7±1,703.7 g, 64.7±6.9 cm)와 2년생어 (n =6, 447.5±69.7 g, 30.2±1.3 cm) 그룹에서 각각 6마리씩을 사용하여 기생충, 세균, 바이러스 검사 및 병리조직학적 분석을 실시하였다.
재고정한 기관은 일반적인 조직처리 과정을 따라 70, 80, 90, 95 및 100% 알콜에 탈수·탈지 과정을 거친 후 xylene에 탈알콜시켜 파라핀으로 포매하였다.
증폭된 PCR 산물은 전기영동으로 band를 확인한 후, Gel SV kit (GeneAll, Korea)로 정제하고 Topo TA cloning® (Invitrogen, USA)을 이용하여 cloning하여 염기서열을 확인하였다.
해산어류에 감염을 일으킬 수 있는 참돔이리도바이러스(redseabream iridovirus, RSIV), 바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV), 해산 버나바이러스(marine birnavirus, MBV) 및 신경괴사증바이러스(nervous necrosis virus, NNV)에 대한 감염 여부를 조사하였다. 시험 어를 무균적으로 해부하여 적출한 신장, 비장 및 뇌를 시료로 하여, DNA는 시판되는 High pure PCR template preparation kit (Roche, Germany), RNA는 TRIZOL® Reagent (Invitrogen, USA)을 이용하여 분리한 후, SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
대상 데이터
2015년 3월 경상남도 통영시 산양읍 소재 육상 양식 수조에서 사육하던 능성어 성어가 배를 위로하고 수면 위를 떠다니다가 1~2주 이후 폐사하였다. 시험어는 크게 두 그룹으로, 500톤 크기의 콘크리트 수조에서 사육 중인 5 kg 전후의 친어(10~15년생)와 50톤 크기의 FRP 수조에 사육 중인 400 g 전후의 2년생 성어였다.
2015년 3월 우리나라 경상남도 소재 육상 양식장에서 사육 중이던 능성어가 최대 30%까지 폐사하였다. 시험어는 배를 위로하여 수면 위를 떠다니다가 1~2주 이후 폐사하였으며 복부팽만, 안구백탁, 부레의 과도한 팽대 및 뇌충혈 증상이 관찰되었다. 이상의 임상 증상을 근거로, 능성어 폐사 원인은 신경괴사증바이러스 (NNV)로 추정되었으나, 폐사가 발생한 시기가 일반적으로 능성어에서 NNV 감염이 일어나는 25~30℃와는 거리가 먼 겨울철(수온 12℃ 이하)이었으므로, 질병진단을 위한 전반적인 분석이 진행되었다.
2015년 3월 경상남도 통영시 산양읍 소재 육상 양식 수조에서 사육하던 능성어 성어가 배를 위로하고 수면 위를 떠다니다가 1~2주 이후 폐사하였다. 시험어는 크게 두 그룹으로, 500톤 크기의 콘크리트 수조에서 사육 중인 5 kg 전후의 친어(10~15년생)와 50톤 크기의 FRP 수조에 사육 중인 400 g 전후의 2년생 성어였다. 사육수는 해수를 직접 사용(직수)하였으며, 1일 3회전하였다.
이론/모형
PCR 분석은 ExTaq® hotstart version (Takara, Japan)을 사용하였으며, primer set 및 PCR 조건은 Table 1에 나타내었다.
증폭된 PCR 산물은 전기영동으로 band를 확인한 후, Gel SV kit (GeneAll, Korea)로 정제하고 Topo TA cloning® (Invitrogen, USA)을 이용하여 cloning하여 염기서열을 확인하였다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열 분석에는 Genetyx Ver. 8.0 (SDC Software Development, Japan)을 사용하였으며, NCBI (national center for biotechnology information)에서 제공되는 BLAST program 정보를 이용하여 상동성을 비교한 후, neighbor-joining algorithm을 이용하여 계통수를 작성하였다.
성능/효과
해산어류에서 주로 검출되는 4종의 바이러스, 즉 RSIV, VHSV, MBV및 NNV에 대한 PCR 분석을 실시한 결과, NNV 이외의 다른 바이러스는 검출되지 않았다 (data not shown). NNV는 12마리의 시험어 뇌에서 모두 검출되었으며, 특히 2년생 능성어에서 NNV가 검출되었다(Fig. 3). 겨울철에 분리한 능성어 NNV 분리주들의 유전자형을 조사하기 위해 NNV의 coat protein gene을 분석한 결과, 겨울철 능성어 분리주는 NNV의 4가지 대표 유전자형 중 냉수성 어류에서 분리된 BFNNV (D38635) genotype과 가장 높은 상동성을 보였으며(99.
3). 겨울철에 분리한 능성어 NNV 분리주들의 유전자형을 조사하기 위해 NNV의 coat protein gene을 분석한 결과, 겨울철 능성어 분리주는 NNV의 4가지 대표 유전자형 중 냉수성 어류에서 분리된 BFNNV (D38635) genotype과 가장 높은 상동성을 보였으며(99.48%), 나머지 3가지 대표 유전자형인 RGNN (D38636),TPNNV(D386637) 및 SJNNV(D30814) genotype과는 96.84~58.45%의 상동성을 보였다 (data not shown). 이상의 결과로 겨울철 능성어 대량 폐사에서 분리된 NNV, 즉 겨울철 능성어 친어에서 분리한 winter NNV G_bs 및 2년생 성어에서 분리한 winter NNV G-ad는 BFNNV genotype에 속하며 (Fig.
시험어의 뇌와 부레에서 특징적인 병변을 확인할 수 있었다. 뇌 조직의 공포화로 인한 괴사병변이 가장 특징적으로, 특히 중뇌(mescencephalon)와 연수(medullar oblongata)에서 폭넓은 공포화가 진행되었으며(Fig. 5A, B and C), 유리질체(hyaline body)도 다수 관찰되었다 (Fig. 5B and C). 부레에서는 충혈(hyperemia)과 미세혈관 주위로 염증세포 침윤(vascular cuffing)이 특징적으로 관찰되었다(Fig.
병든 능성어의 아가미, 체표, 지느러미 및 내부 장기에 대해 현미경 관찰한 결과, 기생충은 관찰되지 않았으며, 폐사에 영향을 미칠만한 세균은 배양되지 않았다(data not shown).
, 2002). 본 연구에서 또한 뇌조직의 공포화가 뚜렷하였으며, 더불어 호산성으로 염색된 유리질체(hyaline body)가 관찰되었다. 이전 연구에서 NNV 감염 어류의 신장과 아가미에서 유리질체가 관찰되었으나 (Johansen et al.
본 연구의 겨울철 능성어 폐사는 2년생 성어와 10년 이상 자란 친어에서 발생하였다. 일반적으로 NNV는 자어와 치어 단계에서 높은 폐사율을 보이는 것으로 알려져 있으나(Munday et al.
이상의 임상 증상을 근거로, 능성어 폐사 원인은 신경괴사증바이러스 (NNV)로 추정되었으나, 폐사가 발생한 시기가 일반적으로 능성어에서 NNV 감염이 일어나는 25~30℃와는 거리가 먼 겨울철(수온 12℃ 이하)이었으므로, 질병진단을 위한 전반적인 분석이 진행되었다. 세균성, 기생충성 및 바이러스성 질병을 다각도로 분석한 결과, 모든 시험어는 NNV 단독감염으로 판단되었다.
45%의 상동성을 보였다 (data not shown). 이상의 결과로 겨울철 능성어 대량 폐사에서 분리된 NNV, 즉 겨울철 능성어 친어에서 분리한 winter NNV G_bs 및 2년생 성어에서 분리한 winter NNV G-ad는 BFNNV genotype에 속하며 (Fig. 4), 특히 태평양 대구에서 분리된 pacific cod betanodavirus PCNNV(KM576685)와는 99.7% (winter NNV G_bs)와 100% (winter NNV G_ad)의 높은 상동성을 보였다.
시험어는 배를 위로하여 수면 위를 떠다니다가 1~2주 이후 폐사하였으며 복부팽만, 안구백탁, 부레의 과도한 팽대 및 뇌충혈 증상이 관찰되었다. 이상의 임상 증상을 근거로, 능성어 폐사 원인은 신경괴사증바이러스 (NNV)로 추정되었으나, 폐사가 발생한 시기가 일반적으로 능성어에서 NNV 감염이 일어나는 25~30℃와는 거리가 먼 겨울철(수온 12℃ 이하)이었으므로, 질병진단을 위한 전반적인 분석이 진행되었다. 세균성, 기생충성 및 바이러스성 질병을 다각도로 분석한 결과, 모든 시험어는 NNV 단독감염으로 판단되었다.
해산어류에서 주로 검출되는 4종의 바이러스, 즉 RSIV, VHSV, MBV및 NNV에 대한 PCR 분석을 실시한 결과, NNV 이외의 다른 바이러스는 검출되지 않았다 (data not shown). NNV는 12마리의 시험어 뇌에서 모두 검출되었으며, 특히 2년생 능성어에서 NNV가 검출되었다(Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
능성어란 무엇인가?
능성어 Epinephelus septemfasciatus는 농어목 바리과 능성어속에 속하며 식용으로 기호가 높고, 단가가 비싸 경제성이 높은 어종으로 알려져 있다. 능성어는 전 세계적으로 20여 종이 양식되고 있으며, 우리나라에서는 1990년대 전후 자연산 능성어 치어를 포획하여 가두리에 입식하는 방법으로 시작한 이래, 최근에는 대부분 자연산 친어로부터 생산한 인공종묘로 양식하는 방법으로 대체되었다.
VER는 어떻게 분류되었는가?
VER은 Nodaviridae에 속하나 insect nodavirus인 Alphnodavirus와는 명확히 구분되는 ‘neuropathogenic viruses, fish nodaviruses’로 분류되었다가 이후 Betanodavirus속으로 재분류되었다(Ball et al., 2000).
VER의 문제점은 무엇인가?
, 2000). 전 세계적으로 30여 종 이상의 해수어에 감염하는 것으로 알려져 있으며(Munday et al., 2002), 치어기뿐 아니라 성어기에도 대량 폐사를 일으킨다(Fukuda et al., 1996; Tanaka et al.
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