[논문]Kocuria gwangalliensis 유래 phytoene desaturase 유전자의 cloning과 특성 연구

서용배; 최성석; 남수완; 김군도

doi:10.4014/mbl.1704.04003

[국내논문] Kocuria gwangalliensis 유래 phytoene desaturase 유전자의 cloning과 특성 연구
Molecular Cloning and Characterization of the Gene Encoding Phytoene Desaturase from Kocuria gwangalliensis 원문보기

Microbiology and biotechnology letters = 한국미생물·생명공학회지, v.45 no.3, 2017년, pp.226 - 235

서용배 (부경대학교 해양생명과학연구소) , 최성석 (부경대학교 미생물학과) , 남수완 (동의대학교 생명공학과) , 김군도 (부경대학교 미생물학과)

초록
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Phytoene, lycopene, ${\beta}-carotene$과 같은 카로티노이드는 식품의 착색제나 영양보조제, 사료첨가제, 화장품의 원료로 사용된다. 이전 연구에서 본 연구진은 분홍색의 색소를 생산하는 새로운 해양 세균인 K. gwangalliensis를 분리 동정하였다. Phytoene desaturase (CrtI) 효소는 crtI 유전자에 암호화되어 있으며, phytoene을 lycopene으로 전환하며, 카로티노이드 합성 초기 단계에 있어서 필수적이다. CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다. 본 논문에서는 K. gwangalliensis로부터 lycopene 생합성을 담당하는 crtI 유전자를 클로닝 하였으며, 이 유전자는 1,584개의 염기서열을 가지며, 527개의 아미노산을 암호화하고 있다. crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다. crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다. lycopene의 생합성은 lycopene 생합성에 필요한 crtE, crtB 유전자를 포함한 pRScrtEB plasmid를 E. coli에 형질전환 했을 때, Escherichia coli에서 합성되는 것을 확인하였다. 이 연구의 결과는 분자 수준에서 K. gwangalliensis CrtI의 1차 구조에 대한 폭 넓은 지식 기반을 제공할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Carotenoids such as phytoene, lycopene, and ${\beta}-carotene$ are used as food colorants, animal feed supplements, and for human nutrition and cosmetic purposes. Previously, we reported the isolation of a novel marine bacterium, Kocuria gwangalliensis, which produces a pink-orange pigment. Phytoene desaturase (CrtI), encoded by the gene crtI, catalyzes lycopene formation from phytoene and is an essential enzyme in the early steps of carotenoid biosynthesis. CrtI is one of the key enzymes regulating carotenoid biosynthesis and has been implicated as a rate-limiting enzyme of the pathway in various carotenoid synthesizing organisms. Here, we report the cloning of the crtI gene responsible for lycopene biosynthesis from K. gwangalliensis. The gene consisted of 1,584 bases encoding 527 amino acid residues. The nucleotide sequence of the crtI gene was compared with that of other species, including Kocuria rhizophila and Myxococcus xanthus, and was found to be well conserved during evolution. An expression plasmid containing the crtI gene was constructed (pCcrt1), and Escherichia coli cells were transformed with this plasmid to produce a recombinant protein of approximately 57 kDa, corresponding to the molecular weight of phytoene desaturase. Lycopene biosynthesis was confirmed when the plasmid pCcrtI was co-transformed into E. coli containing the plasmid pRScrtEB carrying the crtE and crtB genes required for lycopene biosynthesis. The results from this study will provide valuable information on the primary structure of K. gwangalliensis CrtI at the molecular level.

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AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 분홍색 색소를 생산하는 해양 세균인 Kocuria gwangalliensis [21]의 genomic DNA에서 lycopene 생합성에 관여하는 phytoene desaturase를 암호화하고 있는 crtI 유전자를 클로닝하였고, 이 효소가 만든 물질의 생화학적 특성에 관해 연구하였다. 본 연구진이 이전에 분리 동정한 해양 세균인 P.

제안 방법

본 연구에서는 분홍색 색소를 생산하는 해양 세균인 Kocuria gwangalliensis [21]의 genomic DNA에서 lycopene 생합성에 관여하는 phytoene desaturase를 암호화하고 있는 crtI 유전자를 클로닝하였고, 이 효소가 만든 물질의 생화학적 특성에 관해 연구하였다. 본 연구진이 이전에 분리 동정한 해양 세균인 P. haeundaensis [22]로부터 유래한 crtE 와 crtB 유전자와 K. gwangalliensis에서 분리한 crtI 유전자를 이용하여 Escherichia coli에서 lycopene의 생합성을 유도하였고 이를 HPLC를 사용하여 생합성된 lycopene을 분석하였다. 이 연구의 결과는 K.
K. gwangalliensis의 genomic DNA 라이브러리는 ZAP Express® BamHI/Gigapack® III cloning kit (Stratagene, USA)을 이용하여 지침에 따라 제작하였다.
저온의 에탄올 (−20℃)을 2배 용량 첨가하고 유리 막대를 사용하여 침전된 DNA를 모은 다음 70% (v/v) 에탄올로 헹구었다. 진공 상태로 에탄올을 증발시킨 후, DNA를 TE buffer에 현탁시키고 260 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 측정하였다. 정제한 K.
진공 상태로 에탄올을 증발시킨 후, DNA를 TE buffer에 현탁시키고 260 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 측정하였다. 정제한 K. gwangalliensis의 genomic DNA를 Sau3AI 제한효소를 5 U/g 농도로 처리하여 DNA를 부분적으로 분해하였다. K.
K. gwangalliensis의 phytoene desaturase (crtI) 유전자를 복제하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록된 여러 생물들의 phytoene desaturase의 염기 서열을 확보하였다. 이들 염기 서열을 분석하고 서열이 잘 보존되어 있는 부분을 이용하여 degenerate primer를 제작하였다(Table 1).
gwangalliensis의 phytoene desaturase (crtI) 유전자를 복제하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록된 여러 생물들의 phytoene desaturase의 염기 서열을 확보하였다. 이들 염기 서열을 분석하고 서열이 잘 보존되어 있는 부분을 이용하여 degenerate primer를 제작하였다(Table 1). CrtI 유전자는 K.
이들 염기 서열을 분석하고 서열이 잘 보존되어 있는 부분을 이용하여 degenerate primer를 제작하였다(Table 1). CrtI 유전자는 K. gwangalliensis의 DNA 라이브러리를 이용하여 PCR로 증폭하였다. CrtI 유전자의 open reading frame을 복제하기 위해 DNA Walking SpeedUp Premix Kit (Seegene, Korea)를 사용하였고, 증폭된 DNA를 pGEM-T vector (Promega, USA)에 삽입하였다.
gwangalliensis의 DNA 라이브러리를 이용하여 PCR로 증폭하였다. CrtI 유전자의 open reading frame을 복제하기 위해 DNA Walking SpeedUp Premix Kit (Seegene, Korea)를 사용하였고, 증폭된 DNA를 pGEM-T vector (Promega, USA)에 삽입하였다. 복제한 crtI 유전자는 ABI Prism^TM DNA sequencing kit 및 ABI 377 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 염기 서열을 분석하였다.
CrtI 유전자의 open reading frame을 복제하기 위해 DNA Walking SpeedUp Premix Kit (Seegene, Korea)를 사용하였고, 증폭된 DNA를 pGEM-T vector (Promega, USA)에 삽입하였다. 복제한 crtI 유전자는 ABI Prism^TM DNA sequencing kit 및 ABI 377 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 염기 서열을 분석하였다. CrtI 유전자의 완전한 DNA의 염기 서열을 분석하여 GenBank에 등록하였다(JN582050.
복제한 crtI 유전자는 ABI Prism^TM DNA sequencing kit 및 ABI 377 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 염기 서열을 분석하였다. CrtI 유전자의 완전한 DNA의 염기 서열을 분석하여 GenBank에 등록하였다(JN582050.1).
이를 위해, T- 벡터의 NdeI 및 HindIII primer 부위를 사용하여 crtI 유전자의 5' 및 3' 말단을 각각 연결하고 PCR을 이용하여 증폭시켰다.
상층액을 분리하여 0.22 μm nylon filters로 여과한 다음 20 μl를 HPLC [Bio-rad Automated Biologic HR System (# 750-0047)]으로 분석하였다.
K. gwangalliensis의 phytoene desaturase (crtI) 유전자의 분자적 진화를 조사하기 위해 SwissPort databank/GenBank에서 Gloeobacter violaceus PCC 7421 (NC005125), Thermus thermophilus HB8 (AE017222), Xanthobacter autotrophicus (AF408848), Rhodopseudomonas palustris CGA009 (NC011004), Pantoea ananatis (D90087), Rhodobacter capsulatus (Z11165), Rhodobacter sphaeroides (S71770), Myxococcus xanthus (M94727), P.haeundaensis (AY957386), Erthrobacter longus (BAA20276) and Kocuria rhizophila (BAG30430)의 crtI 유전자 데이터를 확인하였다. 알려진 세균의 상동성을 phytoene desaturase의 아미노산 서열을 분석하여 조사하였다.
haeundaensis (AY957386), Erthrobacter longus (BAA20276) and Kocuria rhizophila (BAG30430)의 crtI 유전자 데이터를 확인하였다. 알려진 세균의 상동성을 phytoene desaturase의 아미노산 서열을 분석하여 조사하였다. 아미노산 서열의 분석은 ClustalW 프로그램을 이용하여 분석되었다.
K. gwangalliensis의 genomic DNA 라이브러리에서 얻은 crtI 유전자의 과발현을 위해, pColdI vector (Takara, Japan)의 NdeI 및 HindIII 부위를 사용하여 클로닝 하였다. 이를 위해, T- 벡터의 NdeI 및 HindIII primer 부위를 사용하여 crtI 유전자의 5' 및 3' 말단을 각각 연결하고 PCR을 이용하여 증폭시켰다.
이를 위해, T- 벡터의 NdeI 및 HindIII primer 부위를 사용하여 crtI 유전자의 5' 및 3' 말단을 각각 연결하고 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 산물 및 pColdI 벡터를 NdeI 및 HindIII 제한 효소로 절단하고 이를 재조합하여 crtI 유전자를 삽입한 발현 벡터인 pCcrtI 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드 DNA를 대장균 BL21 (DE3)에 형질 전환시켰다.
1 mM IPTG를 첨가하고, 16℃에서 추가로 배양하여 DNA 과발현을 유도하였다. 발현 수준을 분석하기 위해 12% SDS-PAGE를 수행하였다. 단백질을 SDS-PAGE 겔로부터 니트로 셀룰로오스 막으로 전이시켜 goat antiserum against 6-His tag으로 과발현된 단백질을 탐침하고, alkaline phosphatase와 결합된 against goat IgG를 이용하여 6-His tag antibody와 반응시켰다.
발현 수준을 분석하기 위해 12% SDS-PAGE를 수행하였다. 단백질을 SDS-PAGE 겔로부터 니트로 셀룰로오스 막으로 전이시켜 goat antiserum against 6-His tag으로 과발현된 단백질을 탐침하고, alkaline phosphatase와 결합된 against goat IgG를 이용하여 6-His tag antibody와 반응시켰다. 반응이 끝난 니트로 셀룰로오스 막에 BCIP/NBT (Sigma-Aldrich)를 처리하여 재조합 단백질의 발현을 확인하였다[24].
반응이 끝난 니트로 셀룰로오스 막에 BCIP/NBT (Sigma-Aldrich)를 처리하여 재조합 단백질의 발현을 확인하였다[24]. 또한, P. haeundaensis의 crtE 및 crtB 유전자를 pRSFDuet-1 벡터(Novagen, USA)에 삽입하여 pRScrtEB 플라스미드를 구축하고 이것을 대장균 BL21 (DE3)에 형질 전환시킨 후 형질 전환된 대장균을 선별하였다. 대장균에서 lycopene을 합성하기 위해 2개의 플라스미드(pCcrtI와 pRScrtEB)가 들어간 BL21 (DE3) 대장균을 37℃, OD₆₀₀에서 0.
haeundaensis의 crtE 및 crtB 유전자를 pRSFDuet-1 벡터(Novagen, USA)에 삽입하여 pRScrtEB 플라스미드를 구축하고 이것을 대장균 BL21 (DE3)에 형질 전환시킨 후 형질 전환된 대장균을 선별하였다. 대장균에서 lycopene을 합성하기 위해 2개의 플라스미드(pCcrtI와 pRScrtEB)가 들어간 BL21 (DE3) 대장균을 37℃, OD₆₀₀에서 0.5가 될 때까지 배양한 후, 최종농도 0.1 mM이 되도록 IPTG를 처리하고 16℃에서 5시간 동안 과 발현을 유도하였다.
0), 84% acetonitrile, 2% methanol을, 15−20분까지는 68% methanol, and 32% ethyl acetate을 사용하였다. HPLC 분석 후, 10분간 초기 이동상 용매로 HPLC 이동을 수행하였다. HPLC를 수행하는 동안 이동상 용매의 유속은 1 ml/min이었다.
HPLC를 수행하는 동안 이동상 용매의 유속은 1 ml/min이었다. HPLC로 분리된 카로티노이드는 photodiode array detector를 이용하여 280 nm 및 470 nm의 파장으로 측정하고, 표준 시료의 측정값과 비교하였다. Lycopene과 phytoene 표준 시료는 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다.
K. gwangalliensis의 Phytoene desaturase (crtI) 유전자를 cloning 하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록된 카로티노이드 생합성 세균의 phytoene desaturase의 염기서열을 이용하여 degenerate primer인 CI-F, CI-R를 제작하였다(Table 1). Genomic DNA library가 함유된 형질전환체를 주형으로 하여 CI-F, CI-R primer를 이용하여 약 500 bp의 DNA 단편을 증폭하였으며, 이를 DNA sequencing 한 결과 crtI 유전자의 단편임을 확인할 수 있었다.
crtI ORF (open read frame)를 cloning 하기 위해, 밝혀진 crtI 유전자 단편 염기서열을 이용하여 target-specific primers 를 제작하였다(Table 1). Target-specific primers와 genomic DNA library가 함유된 형질전환주를 주형으로 PCR을 수행한 후 TA-cloning 통해 full length의 crtI 유전자를 클로닝할 수 있었으며, DNA sequencing 통해 확보된 클론의 염기서열을 분석한 결과, 1.
1 mM이 되도록 IPTG를 처리한 후 16℃에서 5시간 동안 과발현시켰다. 이 과발현된 균주에서 생산된 lycopene을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 표준물질과 형질전환체에서 생산된 카로티노이드의 흡광도는 280 nm와 470 nm에서 측정하였다[30−32].
CrtI는 카로티노이드 생합성 경로를 조절하는 주요 효소 중 하나이다. 이 효소의 구조적 특성을 확인하기 위해 CrtI_Kg 단백질의 아미노산을 분석하였고, 효소 활성을 시험하기 위해 대장균 BL21 (DE3)에 이 유전자를 형질 전환하여 phytoene과 lycopene을 생성시킨 다음 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이러한 결과는 카로티노이드를 생합성하는 새로운 효소를 동정하고, 카로티노이드를 생산하지 않는 숙주에서 다양한 카로티노이드 를 생산하기 위한 기초 자료로 활용할 수 있다.
형질전환된 대장균을 선별하여 37℃에서 50 μg/ml의 ampicillin을 함유한 LB 배지에서 배양하고(OD600 = 0.5), IPTG를 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가한 후, 16℃에서 과발현을 유도하였고, 이를 12% SDS-PAGE로 확인하였다.
염기 서열이 잘 보존된 구역과 계통 발생 관계를 확인하기 위해 GenBank에 등록되어 있는 세균에서 발견된 phytoene desaturase 유전자들의 염기 서열을 이용하여 multiple alignment를 수행하였다(Fig. 3). 분석 결과 두 개의 잘 보존된 구역을 확인할 수 있었으며, dinucleotid binding motif (βαβ fold)는 N 말단 영역에서 관찰되었지만 다른 종에서 발견되는 C 말단 영역의 모티프는 발견되지 않았다.
3). 또한, CrtI_Kg 단백질의 계통 발생 관계를 결정하기 위해 다른 세균들의 phytoene desaturase 를 이용하여 multiple alignment을 수행했다. 가장 높은 상 동성은 K.
5A). 또한, 대장균에서 lycopene을 합성하기 위해 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 pRSFDuet-1의 MCS1과 MCS2 부위에 P. haeundaensis의 crtE와 crtB 유전자를 클로닝하여, 재조합 DNA pRScrtEB 제작하였다(Fig. 5B)
대장균에서 crtI_Kg 유전자를 발현시키기 위해, 대장균 BL21 (DE3)를 pCcrtI plasmid로 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 선별하여 37℃에서 50 μg/ml의 ampicillin을 함유한 LB 배지에서 배양하고(OD₆₀₀ = 0.
대장균 BL21 (DE3)에서 발현된 CrtI_Kg의 활성을 확인하기 위해 대장균에서 lycopene의 생합성을 유도하였다. 일반적으로 대장균은 non-mevalonic acid 경로를 통해 FPP와 IPP를 합성하지만 crtE, crtB, crtI 유전자를 가지고 있지 않기 때문에 lycopene을 합성할 수 없다.
일반적으로 대장균은 non-mevalonic acid 경로를 통해 FPP와 IPP를 합성하지만 crtE, crtB, crtI 유전자를 가지고 있지 않기 때문에 lycopene을 합성할 수 없다. 이 특성을 이용하여, 위에서 기술한 두 개의 재조합 plasmid를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환 된 균주에서 최종 농도가 0.

대상 데이터

분홍색 색소를 생산하는 해양 세균인 K. gwangalliensis를 부산 광안리 해변에서 분리하였고, 이 균주를 PPES-II (Polypeptone 0.2 g, Bacto soytone 1.0 g, Proteose peptone 1.0 g, Bacto yeast extract 1.0 g, NaCl 3%, Ferric citrate 0.1%, Distilled Water 1 L) 배지에 25℃에서 배양하였다.
대장균 XL1-blue [endA1 gyrA96 (nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F' [::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ) M15] hsdR17 (rK− mK+)]와 대장균 BL21 (DE3) [F− ompT gal dcm lon hsdSB (rB− mB− ) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])] 균주는 Luria-Bertani (LB; Tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) 배지에 37℃에서 배양하였다.
HPLC로 분리된 카로티노이드는 photodiode array detector를 이용하여 280 nm 및 470 nm의 파장으로 측정하고, 표준 시료의 측정값과 비교하였다. Lycopene과 phytoene 표준 시료는 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다.
본 연구진은 K. gwangalliensis로부터 phytoene desaturase 를 coding하는 crtI 유전자를 분리하였다. CrtI는 카로티노이드 생합성 경로를 조절하는 주요 효소 중 하나이다.
CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다. 본 논문에서는 K. gwangalliensis로부터 lycopene 생합성을 담당하는 crtI 유전자를 클로닝하였으며, 이 유전자는 1,584개의 염기서열을 가지며, 527개의 아미노산을 암호화하고 있다. crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다.

데이터처리

알려진 세균의 상동성을 phytoene desaturase의 아미노산 서열을 분석하여 조사하였다. 아미노산 서열의 분석은 ClustalW 프로그램을 이용하여 분석되었다. 계통 발생 수를 분석하기 위해서 계통 발생 수를 분석하기 위해서 neighborjoining 방법을 사용하는 NEIGHBOR (Mega, version 4.

이론/모형

아미노산 서열의 분석은 ClustalW 프로그램을 이용하여 분석되었다. 계통 발생 수를 분석하기 위해서 계통 발생 수를 분석하기 위해서 neighborjoining 방법을 사용하는 NEIGHBOR (Mega, version 4.0) 프로그램을 사용하였다[23].
대장균에서 생합성된 lycopene은 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) [25]를 이용하여 분석하였다. 형질 전환된 대장균으로부터 색소를 추출하기 위해 세포를 90% 아세톤을 사용하여 3분간 균질화시킨 후 12,000 ×g에서 2분간 원심 분리하였다.
CrtIKg 유전자에 의해 암호화 된 phytoene desaturase의 아미노산 서열과 관련하여, 단백질의 2차 구조를 예측하기 위해 SABLE website (http://sable.cchmc.org)를 이용하였다.
또한, phytoene desaturase의 세포 내에서 존재하는 형태는 현재까지 밝혀진 바로는 막결합 단백질과 수용성 형태의 단백질의 두 가지 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다 [26, 27]. 이러한 특징을 파악하기 위해서, transmembrane domains을 예측하기 위한 Transmembrane Regions and Orientation (TMpred) algorithm (http://www.ch.embnet.org) 를 이용하였다. CrtI_Kg 단백질의 2차 구조는 17 β-sheet, 20 α-helices 및 random 코일을 가질 것으로 예측되며, CrtI_Kg 단백질은 막결합 구조가 존재하지 않기 때문에 수용성 형태로만 발현된다고 추측된다[28, 29].

성능/효과

gwangalliensis의 Phytoene desaturase (crtI) 유전자를 cloning 하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록된 카로티노이드 생합성 세균의 phytoene desaturase의 염기서열을 이용하여 degenerate primer인 CI-F, CI-R를 제작하였다(Table 1). Genomic DNA library가 함유된 형질전환체를 주형으로 하여 CI-F, CI-R primer를 이용하여 약 500 bp의 DNA 단편을 증폭하였으며, 이를 DNA sequencing 한 결과 crtI 유전자의 단편임을 확인할 수 있었다.
crtI ORF (open read frame)를 cloning 하기 위해, 밝혀진 crtI 유전자 단편 염기서열을 이용하여 target-specific primers 를 제작하였다(Table 1). Target-specific primers와 genomic DNA library가 함유된 형질전환주를 주형으로 PCR을 수행한 후 TA-cloning 통해 full length의 crtI 유전자를 클로닝할 수 있었으며, DNA sequencing 통해 확보된 클론의 염기서열을 분석한 결과, 1.6 kb의 K. gwangalliensis 유래 phytoene desaturase (crtIKg) 유전자의 전체 염기서열을 확보할 수 있었다(Fig. 2). 클로닝된 crtI_Kg의 ORF는 1,581 bp이고, 527개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 종결 코돈(TGA)은 1,582− 1,584 bp였다.
Multiple alignment of deduced amino acids sequences of CrtI_Kg and other bacteria. The amino acids sequences are obtained from GenBank: Gloeobacter violaceus PCC 7421 (NC005125), Thermus thermophilus HB8 (AE017222), Xanthobacter autotrophicus (AF408848), Rhodopseudomonas palustris CGA009 (NC011004), Pantoea ananatis (D90087), Rhodobacter capsulatus (Z11165), Rhodobacter sphaeroides (S71770), Myxococcus xanthus (M94727), Paracoccus haeundaensis (AY957386), Erthrobacter longus (BAA20276), Kocuria rhizophila (BAG30430), Kocuria gwangalliensis (JN582050).
7D는 pCcrtI 및 pRScrtEB 재조합 DNA의 동시 발현에 의해 생성된 카로티노이드를 HPLC로 분석한 결과이다. 표준물질의 결과와 비교하여 형질전환체에서 카로티노이드가 생산 됨을 확인할 수 있었다. 280 nm (peak 1, 검출 시간 27 min) 및 470 nm (peak 2, 검출 시간 22 min)에서 분리된 물질은 각각 phytoene 및 lycopene에 해당한다.
gwangalliensis로부터 lycopene 생합성을 담당하는 crtI 유전자를 클로닝하였으며, 이 유전자는 1,584개의 염기서열을 가지며, 527개의 아미노산을 암호화하고 있다. crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다. crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다.
crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다. crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다. lycopene의 생합성은 lycopene 생합성에 필요한 crtE, crtB 유전자를 포함한 pRScrtEB plasmid를 E.
crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다. lycopene의 생합성은 lycopene 생합성에 필요한 crtE, crtB 유전자를 포함한 pRScrtEB plasmid를 E. coli에 형질전환 했을 때, Escherichia coli에서 합성되는 것을 확인하였다. 이 연구의 결과는 분자 수준에서 K.
분석 결과 두 개의 잘 보존된 구역을 확인할 수 있었으며, dinucleotid binding motif (βαβ fold)는 N 말단 영역에서 관찰되었지만 다른 종에서 발견되는 C 말단 영역의 모티프는 발견되지 않았다.
또한, CrtI_Kg 단백질의 계통 발생 관계를 결정하기 위해 다른 세균들의 phytoene desaturase 를 이용하여 multiple alignment을 수행했다. 가장 높은 상 동성은 K. rhizophila (74%, accession No. BAG30430)의 phytoene desaturase에서 나타났으며, Myxococcus xanthus (19.7%, accession No. ABF90965)에 가장 낮은 상동성이 나 타났다(Fig. 4).
1 mM이 되도록 첨가한 후, 16℃에서 과발현을 유도하였고, 이를 12% SDS-PAGE로 확인하였다. 최적 발현 시간은 IPTG 첨가 후 17시간이었으며, 분자량은 57 kDa로 예상 중량과 일치하였다(Fig. 6A). 또한, 대장균에서 발현된 CrtI_Kg의 진위 여부는 western blot으로 확인하였다(Fig.

후속연구

gwangalliensis에서 분리한 crtI 유전자를 이용하여 Escherichia coli에서 lycopene의 생합성을 유도하였고 이를 HPLC를 사용하여 생합성된 lycopene을 분석하였다. 이 연구의 결과는 K. gwangalliensis가 가지고 있는 카로티노이드 생합성 효소에 대한 이해와 카로티노이드 생산 숙주에서 카로티노이드 생산을 증가시키고 생산하는 데 필요한 자료를 제공할 것이다.
이 효소의 구조적 특성을 확인하기 위해 CrtI_Kg 단백질의 아미노산을 분석하였고, 효소 활성을 시험하기 위해 대장균 BL21 (DE3)에 이 유전자를 형질 전환하여 phytoene과 lycopene을 생성시킨 다음 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이러한 결과는 카로티노이드를 생합성하는 새로운 효소를 동정하고, 카로티노이드를 생산하지 않는 숙주에서 다양한 카로티노이드 를 생산하기 위한 기초 자료로 활용할 수 있다.
coli에 형질전환 했을 때, Escherichia coli에서 합성되는 것을 확인하였다. 이 연구의 결과는 분자 수준에서 K. gwangalliensis CrtI의 1차 구조에 대한 폭 넓은 지식 기반을 제공할 것이다.

질의응답

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	표준물질과 형질전환체에서 생산된 카로티노이드의 흡광도를 280 nm와 470 nm 에서 측정한 까닭은 무엇인가?	표준물질과 형질전환체에서 생산된 카로티노이드의 흡광도는 280 nm와 470 nm에서 측정하였다[30−32]. 이는 형질전환체에서 생산된 두 종류의 카로티노이드(phytoene과 lycopene)의 detection 파장대가 달라 두 번의 분석을 통해 각각의 카로티노이드 생산 유무를 분석하였으며, 이에 대한 결과는 Fig. 7에 나타내었다.
	Phytoene desaturase (CrtI) 효소의 특징은 무엇인가?	gwangalliensis를 분리 동정하였다. Phytoene desaturase (CrtI) 효소는 crtI 유전자에 암호화되어 있으며, phytoene을 lycopene으로 전환하며, 카로티노이드 합성 초기 단계에 있어서 필수적이다. CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다.
	CrtI은 어떤 기작과 관련이 있는가?	Phytoene desaturase (CrtI) 효소는 crtI 유전자에 암호화되어 있으며, phytoene을 lycopene으로 전환하며, 카로티노이드 합성 초기 단계에 있어서 필수적이다. CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다. 본 논문에서는 K.

참고문헌 (32)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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