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문제 정의
- 또한, 물리· 화학적인 방법의 경우 경제성과 안전성의 문제가 제기되어 실제 농가 단위의 현장에서 적용이 활발하지 못한 실정이다. 따라서, 본연구에서는 축산악취 제거방법 개발 중 생물학적 악취저감제 개발을 목표로 악취저감 능력이 우수한 미생물을 선별하고 이를 이용한 실제적 악취저감제 개발 가능성을 검토한 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 축산악취저감을 위한 악취저감 미생물을 돈분과 폭기조 활성슬러지로부터 분리 및 동정을 실시하였으며 분리 미생물의 황화합물 저감 효과를 분석하였다. 그 결과, Brevundimonas diminuta R2-3을 분리하였으며 KCTC에 기탁하여 기탁번호 KCTC11724BP를 부여받았다.
제안 방법
- R2-3 균주의 황화수소 제거율을 200ppmv으로 제조된 표준가스(Rigas, Korea)를 이용하여 확인하였다. 1 L 용량의 혈 청병에 균주배양액을 10%(v/v)이 되게 주입한 후 황화수소 표준가스를 일정 농도로 희석한 후 최종 농도가 10ppmv, 50ppmv, 100ppmv, 200ppmv가 되도록 첨가한 후 실리콘마개와 알루미늄 캡을 이용하여 밀봉하고 120 rpm으로 교반하면서 주기적으로 시료를 채취하여 가스의 농도를 측정하였다.
- 배양된 유박물 상등액 1ml를 분취하여 다시 새로운 악취바이알에 접종하여 이를 4 반복하였다. 4차 농화배양 후 유박물 상등액은 nutrient agar, potato dextrose agar 그리고mRS agar 배지에 도말 평판법으로 배양하였다. 이후 배양된 각각의 콜로니를 순수분리하기 위하여 희석도말법을 이용하여 30℃에서 2일간 배양하여 단일콜로니를 얻었다.
- B. diminuta R2-3의 고농도 악취 저감 능력 및 지속 능력을 알아보기 위하여 악취바이알을 이용하여 실험하였다. 대조 실험을 위하여 본 연구실에서 분변토로부터 분리한 균주로써 황산화세균(Sulfur oxidation bacteria, SOB)으로 보고된[23, 24] Acidithiobacillus caldus를 포함하여 진행하였다(Fig.
- B. diminuta R2-3의 생장특성을 알아보기 위하여 호기적조건과 혐기적 조건에서 배양하며 10일까지 counting chamber를 이용하여 세포수를 확인하였다. 균주 접종 1일만에 108의 세포수가 확인되었으며 호·혐기 조건 모두 배양 3일째에 109으로 가장 높은 세포수를 나타내며 배양 12일째까지는 호· 혐기 조건에서 세포수의 큰 변화를 나타내지 않는다.
- 2A). B. diminuta R2-3의 황화합물 악취저감 능력 및 지속 능력을 알아보았다. 먼저, 고농도의 황화수소를 일정 농도로 희석하여 R2-3 배양액을 주입한 결과, 저농도인 10ppmv과 50ppmv의 황화수소는 12시간내에 고농도인 100ppmv, 200ppmv의 경우는 24시간내에 모두 제거되는 것으로 나타났다(Fig.
- 악취저감율은 위 식 (1)과 식 (2)에 의거하여 계산하였다. B. diminuta의 접종량 별 황화합물 저감 효과를 확인하기 위해서 균주 주입량을 돈분뇨 시료의 5, 10 그리고 20%(v/w)에 해당하는 150, 300 그리고 600ml의 배양액을 분무하였다. 돈분뇨에서 발생되는 악취 황화수소와 메틸메르캅탄을 측정하였으며, 이를 Fig.
- DNA template 1µl와 primer를 각각 20 pmol씩 넣고 0.5mg/ml BSA, 0.2mM dNTP, 2.5 µl의 10× buffer를 넣어 dH2O로총 부피를 25 µl가 되도록 하였다.
- R2-3 균주의 황화수소 제거율을 200ppmv으로 제조된 표준가스(Rigas, Korea)를 이용하여 확인하였다. 1 L 용량의 혈 청병에 균주배양액을 10%(v/v)이 되게 주입한 후 황화수소 표준가스를 일정 농도로 희석한 후 최종 농도가 10ppmv, 50ppmv, 100ppmv, 200ppmv가 되도록 첨가한 후 실리콘마개와 알루미늄 캡을 이용하여 밀봉하고 120 rpm으로 교반하면서 주기적으로 시료를 채취하여 가스의 농도를 측정하였다.
- diminuta R2-3의 성장 및 악취 저감테스트를 다시 수행하였다. R2-3의 성장 및 개체수 변화를 관찰하기 위해서 멸균된 nutrient broth 배지 500ml에 균주 배양액 5ml를 접종하고, 30℃ 온도와 120rpm 조건으로 배양하였으며 일별 세포수 변화는 counting chamber를 이용하여 관찰하였다. 호기적 배양은 sili stopper를 이용하여 밀봉하였으며 혐기적 배양은 headspace를 질소가스로 치환하고 실리콘 마개로 밀봉하였다.
- diminuta의 접종량 별 황화합물 저감 효과를 확인하기 위해서 균주 주입량을 돈분뇨 시료의 5, 10 그리고 20%(v/w)에 해당하는 150, 300 그리고 600ml의 배양액을 분무하였다. 돈분뇨에서 발생되는 악취 황화수소와 메틸메르캅탄을 측정하였으며, 이를 Fig. 4에서 각 접종량 별 시간의 경과에 따른 저감효과를 알아보았다.
- 분리 균주 B. diminuta R2-3의 축산악취 저감 제제로서의 적용가능성을 확인하기 위하여 돈분뇨에 접종 후 악취의 변화를 살펴보았다(Fig. 1). 악취저감율은 위 식 (1)과 식 (2)에 의거하여 계산하였다.
- 분리 균주 중에서 황화합물의 저감효율이 가장 높은 균주를 유전자 동정 방법인 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정을 의뢰하였으며 균주 보관을 위해 KCTC(생명공학 연구소 부설 유전자은행)에 기탁하였다(accession number: kctc 11724 bp). 활성이 확인된 단일 콜로니에서 DNA 추출 kit (MPBio, USA; Fast DNA spin kit for soil)을 이용해 genomic DNA를 추출하였고, 추출된 DNA를 template로 하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다.
- 분리균주의 돈분뇨로부터 발생하는 악취 저감 효과를 알아보기 위해서 약 96 L의 부피를 갖는 아크릴 재질의 반응기를 제작하였다(Fig. 1). 반응기 내부에는 소형팬 2개를 부착하여 악취가 고르게 포화되도록 하였으며, 반응기 상단에는 악취시료 채취관과 액상 배양된 미생물을 분무할 수 있는 노즐을 설치하였다.
- 25 g의 혼합 유박가루와 10ml의 증류수를 넣고, 테프론 코팅된 셉텀이 장착된 마개를 이용하여 밀봉하여 상온에 두었다. 시간이 지남에 따라 분뇨와 유사한 악취가 발생되며 이를 유리 바이얼의 headspace에 발생된 가스 시료를 gas-tight syringe를 이용하여 주기적으로 채취하고 GC/FPD로 시료 내의 황화수소 및 메틸메르캅탄을 분석하였다[18]. 이후 위의 장치를 본 논문에서는 악취 바이알로 명명하였다.
- 악취 바이얼에 분리 균주를 접종한 실험군과 균주를 접종하지 않은 대조군과 비교하여 황화수소 저감 능력을 알아보기 위하여 악취저감 활성테스트를 진행하였다. 황화수소의 저감율은 아래의 식 (1)을 이용하여 계산하였다.
- 악취바이알 및 악취반응기에서 발생된 황화합물 농도는 GC/FPD로 분석하였다. GC의 분석조건은 Table 1에 정리하였다.
- 악취저감 활성 분석 결과, 황화수소의 저감 능력이 90% 이상인 균주는 계대배양 후, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정을 의뢰하였다. 동정된 균주에는 Brevundimonas diminuta, Pseudomonasmosselii, P.
- 3%)을 믹서기로 갈아서 악취발생원으로 사용하였다. 이때 발생되는 악취는 매번 조금씩 차이가 나기 때문에 충분한 양의 바이얼을 준비한 후 이 중 유사한 농도의 황화수소 및 메틸메르캅탄이 발생된 바이얼을 Gas cromatography/Frame photometric detector (FPD)로 분석 후 선별하여 본 실험에 이용하였다. 100ml 용량의 유리 바이알 내에 0.
- 이후 배양된 각각의 콜로니를 순수분리하기 위하여 희석도말법을 이용하여 30℃에서 2일간 배양하여 단일콜로니를 얻었다. 이와 같은 방법으로 얻은 순수 배양된 콜로니의 악취저감 효과를 확인하기 위하여 상기와 같은 악취 바이알에 분리균 액체배양액 1ml를 접종하였으며 대조군에는 증류수 1ml를 주입하여 30℃에서 진탕 배양하였다.
- 4차 농화배양 후 유박물 상등액은 nutrient agar, potato dextrose agar 그리고mRS agar 배지에 도말 평판법으로 배양하였다. 이후 배양된 각각의 콜로니를 순수분리하기 위하여 희석도말법을 이용하여 30℃에서 2일간 배양하여 단일콜로니를 얻었다. 이와 같은 방법으로 얻은 순수 배양된 콜로니의 악취저감 효과를 확인하기 위하여 상기와 같은 악취 바이알에 분리균 액체배양액 1ml를 접종하였으며 대조군에는 증류수 1ml를 주입하여 30℃에서 진탕 배양하였다.
- 이후 최종 선정된 균주 B. diminuta R2-3의 성장 및 악취 저감테스트를 다시 수행하였다. R2-3의 성장 및 개체수 변화를 관찰하기 위해서 멸균된 nutrient broth 배지 500ml에 균주 배양액 5ml를 접종하고, 30℃ 온도와 120rpm 조건으로 배양하였으며 일별 세포수 변화는 counting chamber를 이용하여 관찰하였다.
- 그리고 72℃에서 2분 동안 최종 extension한 후 4℃에서 holding 하였다. 증폭된 PCR 산물의 DNA의 염기 서열을 결정하여 the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website의 basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algorithm을 통해 GenBank database와 비교하여 균주를 동정하였다[20].
- R2-3의 성장 및 개체수 변화를 관찰하기 위해서 멸균된 nutrient broth 배지 500ml에 균주 배양액 5ml를 접종하고, 30℃ 온도와 120rpm 조건으로 배양하였으며 일별 세포수 변화는 counting chamber를 이용하여 관찰하였다. 호기적 배양은 sili stopper를 이용하여 밀봉하였으며 혐기적 배양은 headspace를 질소가스로 치환하고 실리콘 마개로 밀봉하였다.
- 분리 균주 중에서 황화합물의 저감효율이 가장 높은 균주를 유전자 동정 방법인 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정을 의뢰하였으며 균주 보관을 위해 KCTC(생명공학 연구소 부설 유전자은행)에 기탁하였다(accession number: kctc 11724 bp). 활성이 확인된 단일 콜로니에서 DNA 추출 kit (MPBio, USA; Fast DNA spin kit for soil)을 이용해 genomic DNA를 추출하였고, 추출된 DNA를 template로 하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. DNA template 1µl와 primer를 각각 20 pmol씩 넣고 0.
- caldus 접종구에 비해 황화수소 저감 능력은 더 우수하며 1회 균주 접종으로 약 5일의 지속 시간을 나타내었다. 황화수소의 초기 농도 453ppmv을 접종 2일 후 100% 제거하였으며, 5일간 효과를 지속하였다. 또한 메틸머캅탄의 경우 초기농도 98ppmv에서 균주 접종 4일차까진 A.
대상 데이터
- diminuta R2-3의 고농도 악취 저감 능력 및 지속 능력을 알아보기 위하여 악취바이알을 이용하여 실험하였다. 대조 실험을 위하여 본 연구실에서 분변토로부터 분리한 균주로써 황산화세균(Sulfur oxidation bacteria, SOB)으로 보고된[23, 24] Acidithiobacillus caldus를 포함하여 진행하였다(Fig. 3).
- 이후 위의 장치를 본 논문에서는 악취 바이알로 명명하였다. 미생물 접종원으로는 S시에 위치한 하수처리장의 폭기조활성 슬러지와 완주군에 위치한 국립축산과학원 내 돼지농장의 돈분이 사용되었다. 농화배양을 시작하기 위하여 악취바이알에 각각의 미생물 접종원을 배양액의 10%가 되도록 1ml와 1g (wt)씩 주입하여 30℃에서 2일간 진탕 배양하였다.
- 유박은 친환경 유기농자재로 분류되는 고농도의 유기질 비료로서 물과 혼합되어 혐기적으로 방치될 때 돈분뇨와 유사한 악취를 발생시켜준다. 악취제거 미생물을 탐색하기 위하여 혼합유박((주)KG케미칼; 피마자박 57%, 채종박 25%, 미강박 18%; C: 40.2%, H: 5.8%, N: 5.3%)을 믹서기로 갈아서 악취발생원으로 사용하였다. 이때 발생되는 악취는 매번 조금씩 차이가 나기 때문에 충분한 양의 바이얼을 준비한 후 이 중 유사한 농도의 황화수소 및 메틸메르캅탄이 발생된 바이얼을 Gas cromatography/Frame photometric detector (FPD)로 분석 후 선별하여 본 실험에 이용하였다.
데이터처리
- 실험군의 분석결과는 SPSS (PASW Statistics 18)을이용하여 대조군과 비교하여 등분산 가정에 의한 two sample t-test를 수행하였다(p < 0.05).
성능/효과
- 본 연구에서는 축산악취저감을 위한 악취저감 미생물을 돈분과 폭기조 활성슬러지로부터 분리 및 동정을 실시하였으며 분리 미생물의 황화합물 저감 효과를 분석하였다. 그 결과, Brevundimonas diminuta R2-3을 분리하였으며 KCTC에 기탁하여 기탁번호 KCTC11724BP를 부여받았다. 악취 바이알에서 B.
- diminuta 균주는 약 453ppmv의 황화수소 농도에서는 5일 동안 100% 저감 능력과 지속시간을 나타났으며 98ppmv의 메틸머캅탄의 농도에서 실험 6일째 100% 저감 효과를 나타냈다. 그리고 돈분뇨 시료를 악취 발생원으로 하는 반응기 실험에서는 돈분뇨의 약 20%(v/w)의 균주 배양액을 분무하였을 때 황화수소와 메틸머캅탄의 저감 능력과 지속시간이 각각 95%와 4일 이상으로 매우 높은 저감 효과를 나타내었다.
- 대조군에서 발생되는 황화합물 농도보다 적게 발생되는 실험군 바이알에 주입된 균주가 황화합물 저감 능력이 있는 것으로 간주하였다. 예를 들어 균주 R2-2, R2-3, R2-4, R2-6, R2-7, R2-8, R2-9는 발생되는 H2 S 악취를 96.
- 돈분 및 활성슬러지를 미생물 분리원으로 이용하여 악취 바이얼에 접종한 후 시간을 두고 모니터링한 결과 악취분해 활성이 우수한 배양액을 취하여 고체배지에 도말하여 모양과 색이 각기 다른 균주 30종을 순수 분리하였다.
- 돈분뇨에 B. diminuta R2-3의 배양액을 접종하고 총 4일간의 악취모니터링 결과, 20%(v/v) 접종량으로 분무해주었을 때 H2S를 최대 87%의 제거효과를 가진다. 메틸메르캅탄 의 경우, 20%(v/v)의 균주 접종량에서 유의한 차이로 최대 85%의 제거효율을 갖는 것으로 나타났다(Fig.
- 악취저감 활성 분석 결과, 황화수소의 저감 능력이 90% 이상인 균주는 계대배양 후, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정을 의뢰하였다. 동정된 균주에는 Brevundimonas diminuta, Pseudomonasmosselii, P. aeruginosa, Bacillus subtilis, Stenotrophomansmaltophilia, P. lurida, Serrtiamarcescens이었다.
- 동정된 다른 균주들에 비해 Brevundimonas diminuta R2-3 균주가 접종 3시간 만에 메틸머캅탄을 100% 제거하는 결과를 보였으며 5일 동안 효과가 지속되었다(Table 2).
- 4). 따라서, 황화물 중 황화수소와 메틸메르캅탄을 모두 효과적으로 제거하기 위해서는 접종량을 20%로 하는 것이 효과적인 것으로 나타났다. 돈분뇨를 넣은 반응기에는 실제 분뇨 악취가 발생 되고 이중에는 암모니아도 포함된다.
- 황화수소의 초기 농도 453ppmv을 접종 2일 후 100% 제거하였으며, 5일간 효과를 지속하였다. 또한 메틸머캅탄의 경우 초기농도 98ppmv에서 균주 접종 4일차까진 A. caldus 접종구보다 더 빠른 저감 효율을 보였으며 6일 후 모두 제거하였다. 일반적으로 SOB는 H2S를 황산염으로 산화시켜주는 독립영양성 세균으로 환경기초시설에서 발생되는 황계열의 악취를 제거하는 바이오필터 등에 많이 적용된다.
- diminuta R2-3의 황화합물 악취저감 능력 및 지속 능력을 알아보았다. 먼저, 고농도의 황화수소를 일정 농도로 희석하여 R2-3 배양액을 주입한 결과, 저농도인 10ppmv과 50ppmv의 황화수소는 12시간내에 고농도인 100ppmv, 200ppmv의 경우는 24시간내에 모두 제거되는 것으로 나타났다(Fig. 2B).
- diminuta는 암모니아성 질소산화율이 우수한 것으로 알려져 있으며, 이용 가능한 탄소원으로 glucose, arabinose,mannitol, n-acetyl-glucosamine,maltose, gluconate와 cytochrome oxidase 등이 알려져 있다[22]. 본연구의 결과로 B. diminuta의 암모니아 제거능력 뿐 아니라 황화합물에 대한 효과적인 제거를 확인되었다.
- 그 결과, Brevundimonas diminuta R2-3을 분리하였으며 KCTC에 기탁하여 기탁번호 KCTC11724BP를 부여받았다. 악취 바이알에서 B. diminuta 균주는 약 453ppmv의 황화수소 농도에서는 5일 동안 100% 저감 능력과 지속시간을 나타났으며 98ppmv의 메틸머캅탄의 농도에서 실험 6일째 100% 저감 효과를 나타냈다. 그리고 돈분뇨 시료를 악취 발생원으로 하는 반응기 실험에서는 돈분뇨의 약 20%(v/w)의 균주 배양액을 분무하였을 때 황화수소와 메틸머캅탄의 저감 능력과 지속시간이 각각 95%와 4일 이상으로 매우 높은 저감 효과를 나타내었다.
- 악취바이알을 이용한 B. diminuta R2-3의 황화합물 저감 지속 효과를 실험한 결과 A. caldus 접종구에 비해 황화수소 저감 능력은 더 우수하며 1회 균주 접종으로 약 5일의 지속 시간을 나타내었다. 황화수소의 초기 농도 453ppmv을 접종 2일 후 100% 제거하였으며, 5일간 효과를 지속하였다.
- 이들 분리균주의 메틸머캅탄의 저감은 대조군과 비교하여 음의 저감값을 보이는 것도 있었으나, 10% 이하의 낮은 제거 능력을 보이는 균주부터 50% 이상의 제거능력을 보이는 균주도 있었다. 이중, R2-3 균주는 96.
- 이러한 결과를 종합해 보면 돼지 분뇨에서 발견되는 미생물은 그람양성구균 (Streptococcus, Peptostreptococcus, Staphylococcus)과megasphaera (39%), Eubacterium (27%), Lactobacillus (20%), 그람음성 간균인 Escherichia (8%) 그리고 Propionibacterium acnes과 Bacteroides (<2%)로 나타난다.
- 6%를 제거할 수 있었다(data not shown). 황화수소로 농화배양되어 분리된 R2-3은 황화합물을 가장 효과적으로 제거하지만 암모니아도 효과적으로 제거함을 알 수 있었다.
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