[논문]이종이식에 활용할 α1,3-galactosyltransferase 비활성화 및 Membrane Cofactor Protein 발현 동형접합 형질전환 돼지 개발

이건섭; 박상현; 이해선; 지수정; 이주영; 변승준; 황성수; 김경운; 옥선아; 오건봉

doi:10.12750/jet.2017.32.3.73

이종이식에 활용할 α1,3-galactosyltransferase 비활성화 및 Membrane Cofactor Protein 발현 동형접합 형질전환 돼지 개발
Development of α1,3-galactosyltransferase Inactivated and Human Membrane Cofactor Protein Expressing Homozygous Transgenic Pigs for Xenotransplantation 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.32 no.3, 2017년, pp.73 - 79

이건섭 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 박상현 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 이해선 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 지수정 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 이주영 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 변승준 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 황성수 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 김경운 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 옥선아 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 오건봉 (국립축산과학원 동물바이오공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Transplantation is considered to be a very useful approach to improve human welfare and to prolong life-span. Heterologous organ transplantation using pig organs which are similar to human beings and easy to make mass-production has known as one of the alternatives. To ensure potential usage of the pig organ for transplantation application, it is essentially required to generate transgenic pig modifying immuno-related genes. Previously, we reported production of heterozygous ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase (GalT) knock-out and human membrane cofactor protein (MCP) expressing pig ($GalT^{-MCP/+}$), which is enforced for suppression of hyperacute and acute immunological rejection. In this study, we reported generation of homozygous pig ($GalT^{-MCP/-MCP}$) by crossbreeding $GalT^{-MCP/+}$ pigs. Two female founders gave birth to six of $GalT^{-MCP/-MCP}$, and seven $GalT^{-MCP/+}$ pigs. We performed quantitative real-time PCR, western blot, and flow cytometry analyses to confirm GalT and MCP expression. We showed that fibroblasts of the $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig do not express GalT and its product Gal antigen, while efficiently express MCP. We also showed no expression of GalT, otherwise expression of MCP at heart, kidney, liver and pancreas of transgenic pig. Taken together, we suggest that the $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig is a useful candidate to apply xenotransplantation study.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구팀에서도 GalT 유전자에 사람 MCP 발현 벡터가 도입된 체세포 및 이를 핵 치환방법으로 이형접합(heterozygote) 형질전환 GalT^-MCP/+ 돼지를 생산하였다 (Hwang 등, 2013; Ko 등, 2013). 본 논문에서는 GalT^-MCP/+ 돼지의 교배를 통해 이종장기 이식 연구에 활용할 수 있는 GalT^-MCP/-MCP돼지를 생산하여, 실제로 Gal 항원의 발현이 억제되는 지와 사람 MCP가 발현되는지 분석하였다. 결론 적으로 GalT^-MCP/-MCP 돼지는 Gal 항원을 발현하지 않으며, 사람 MCP를 효과적으로 발현한다는 것을 확인하였다.

제안 방법

돼지를 생산하였다. 본 연구에서는 GalT^-MCP/+ 돼지의 교배를 통해 13 두의 산자 중 6두의 동형접합 형질전환 GalT^-MCP/-MCP 돼지를 생산하였다. 이 돼지의 귀 조직에서 분리한 섬유아세포에서 양적 실시간 PCR, 웨스턴, flow cytometry 분석을 통해 GalT에 의해 합성되는 Gal 항원을 발현하지 않으며, 동시에 MCP를 효율적으로 발현하는 것을 확인하였다.
재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 GalT^-MCP/+ 돼지의 암수 간 교배를 통해 13두의 자손을 생산한 후 귀 조직을 채취하여 PCR 분석을 수행하였다. Figure 1A에 보이는 것처럼 GalT 유전자의 엑손 9번에 MCP 발현 벡터가 삽입되도록 설계되어 있으므로, 141F 및 138R primer를 사용하여 PCR 분석을 실시하면, 일반돼지(wild type)에서는 약 2.

대상 데이터

본 연구에 공시된 형질전환 돼지의 품종은 Massachusetts General Hospital (MGH) 미니 돼지이다. 육안 검사방법으로 발정이 확인된 GalT^-MCP/+ 암컷 2두 8번과 11번을 수컷 GalT^-MCP/+ 돼지 34-3번과 자연교배를 통해 임신을 유도하였다.
본 연구에 공시된 형질전환 돼지의 품종은 Massachusetts General Hospital (MGH) 미니 돼지이다. 육안 검사방법으로 발정이 확인된 GalT^-MCP/+ 암컷 2두 8번과 11번을 수컷 GalT^-MCP/+ 돼지 34-3번과 자연교배를 통해 임신을 유도하였다. 임신 후 만기 출생한 자손의 귀 조직 일부를 채취하여 소독된 가위로 잘게 분쇄하였고 Maxwell 16 Tissue DNA Purification kit (Promega, Wisconsin, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.

데이터처리

각 샘플의 분리된 조직에서 GalT 및 MCP 유전자 발현량의 통계처리는 GraphPAD Prism (GRAPHPAD software, CA, USA)을 이용하여 One-way ANOVA와 Tukey’s 사후 분석을 통해 분석하였다. 통계적 유의성은 p<0.

성능/효과

본 논문에서는 GalT^-MCP/+ 돼지의 교배를 통해 이종장기 이식 연구에 활용할 수 있는 GalT^-MCP/-MCP돼지를 생산하여, 실제로 Gal 항원의 발현이 억제되는 지와 사람 MCP가 발현되는지 분석하였다. 결론 적으로 GalT^-MCP/-MCP 돼지는 Gal 항원을 발현하지 않으며, 사람 MCP를 효과적으로 발현한다는 것을 확인하였다. 이 돼지는 원숭이에 장기와 조직 또는 세포의 이종이식 전 임상연구와 거부반응 억제 유도 유전자를 추가하여 거부반응 억제 기능이 향상된 형질전환 돼지 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
이 돼지의 귀 조직에서 분리한 섬유아세포에서 양적 실시간 PCR, 웨스턴, flow cytometry 분석을 통해 GalT에 의해 합성되는 Gal 항원을 발현하지 않으며, 동시에 MCP를 효율적으로 발현하는 것을 확인하였다. 또한 실제로 이종이식에 활발히 활용되고 있는 심장, 신장, 췌장, 간에서도 양적 실시간 PCR 방법으로 분석한 결과 GalT^-MCP/-MCP 돼지에 GalT는 발현하지 않으며, MCP를 발현하는 것을 확인하였다. 추가적으로, 심장에서는 웨스턴 분석 방법으로 확인하였다.

후속연구

결론 적으로 GalT^-MCP/-MCP 돼지는 Gal 항원을 발현하지 않으며, 사람 MCP를 효과적으로 발현한다는 것을 확인하였다. 이 돼지는 원숭이에 장기와 조직 또는 세포의 이종이식 전 임상연구와 거부반응 억제 유도 유전자를 추가하여 거부반응 억제 기능이 향상된 형질전환 돼지 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. ;
본 연구에서 개발한 GalT^-MCP/-MCP 돼지의 심장을 cynomolgus 원숭이에 이식하여 60일까지 생존하였고, 사망 후 병리분석 결과 면역반응에 의한 거부반응 징후가 발견되지 않았다(미발표 결과), 이러한 결과는 본 연구에서 개발된 GalT^-MCP/-MCP 돼지는 GalT 유전자가 정확하게 비활성화되었고, 사람 MCP가 효과적으로 발현하며, 이러한 특성에 의해 원숭이에 이식 시 초급성과 급성 거부반응을 효과적으로 억제하는 기능을 수행하는 것으로 판단된다. 향후 GalT^-MCP/-MCP 돼지는 TBM 유전자나 세포성 거부반응을 억제 시킬 수 있는 유전자(Yung 등, 2017)가 추가로 도입된 돼지 개발에 활용될 계획이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	이종장기의 공여체로 가장 부각되는 동물은 무엇인가?	장기 부족 문제를 극복하기 위한 대안 중의 하나로 이종장기가 중요한 해결책으로 제시되었다(Shimizu와 Yamada, 2006). 이에 따라, 이종장기의 공여체로 가장 부각되고 있는 동물은 해부학적 및 생리학적으로 사람과 매우 유사하고 공통적으로 감영가능성이 적은 돼지를 이용하여 많은 연구들이 수행되고 있다(Cooper, 2012). 하지만, 돼지를 이종장기의 공여체로 활용하기에는 면역거부 반응이라는 문제점을 가지고 있어(Cooper 등, 2016; Klymiuk 등, 2010), 돼지의 장기가 수용체에서 이종의 장기로 인식하지 못하게 하기 위해 관련 유전자를 변형시킨 돼지를 개발한 연구가 보고되고 있다.
	장기 이종이식 시 발생하는 급성 거부반응을 억제하기 위한 보체 활성을 억제하는 보체 조절 단백질에는 어떤 것이 있는가?	돼지를 활용한 이종이식의 가장 큰 걸림돌인 초급성 거부반응을 억제 하기 위하여 galactose alpha-1,3-galactose epitope (Gal)을 합성하는 유전자인 alpha-1,3-galactosytransferase (GalT)의 기능을 불활성화(knock-out, KO) 시키기 위한 연구를 수행하였으며(Dai 등, 2002; Kolber-Simonds 등, 2004; Nottle 등, 2007), 급성 거부 반응도 억제시키기 위하여 각종 면역 반응 및 감염방어 기전에 관여하는 보체 활성을 억제 시킬 수 있는 membrane cofactor protein (MCP), decay accelerating factor (DAF), CD59와 같은 보체 조절 단백질을 발현 하는 돼지를 개발하여 이종이식 연구에 이용하고 있다(Adams 등, 2001; Miyagawa 등, 2010; Niemann 등, 2001; White 등, 1995; Zhou 등, 2002).
	이종장기 이식 시, 초급성 거부반응을 억제하기 위해 Gal을 합성하는 유전자는 무엇인가?	돼지를 활용한 이종이식의 가장 큰 걸림돌인 초급성 거부반응을 억제 하기 위하여 galactose alpha-1,3-galactose epitope (Gal)을 합성하는 유전자인 alpha-1,3-galactosytransferase (GalT)의 기능을 불활성화(knock-out, KO) 시키기 위한 연구를 수행하였으며(Dai 등, 2002; Kolber-Simonds 등, 2004; Nottle 등, 2007), 급성 거부 반응도 억제시키기 위하여 각종 면역 반응 및 감염방어 기전에 관여하는 보체 활성을 억제 시킬 수 있는 membrane cofactor protein (MCP), decay accelerating factor (DAF), CD59와 같은 보체 조절 단백질을 발현 하는 돼지를 개발하여 이종이식 연구에 이용하고 있다(Adams 등, 2001; Miyagawa 등, 2010; Niemann 등, 2001; White 등, 1995; Zhou 등, 2002).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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