[논문]제주흑우 정자 생존성 평가를 위해 flow cytometry를 사용한 두가지 형광 염색법의 비교

신상민; 박설화; 손준규; 조인철; 성필남; 김남영; 우제훈; 신문철; 박남건

doi:10.12750/jet.2017.32.3.221

[국내논문] 제주흑우 정자 생존성 평가를 위해 flow cytometry를 사용한 두가지 형광 염색법의 비교
Comparison of Two Fluorescent Stain Methods for Jeju Black Cattle Spermatozoa Viability Assessment by Using Flow Cytometry 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.32 no.3, 2017년, pp.221 - 226

Abstract ▼ AI-Helper

Spermatozoa viability can be assessed by microscopy, flow cytometry, and other methods using fluorescent stain. Flow cytometry can be used to examine the morphological and functional characteristics of spermatozoa in a short time. The purpose of this study was to compare the viability of cryopreserved spermatozoa in Jeju black cattle by two dual fluorescent stain methods. Semen of Jeju black cattle raised in Subtropical Livestock Research Institute, National Institute of Animal Science, RDA were collected with artificial vaginal technique. Sperm was diluted with $Triladyl^{(R)}$-egg yolk diluent and then was performed cryopreservation. There was no significant difference in viability of spermatozoa according to the two dual fluorescent stain methods. However, when the distribution of spermatozoa according to the staining method was compared, the spermatozoa group stained with 6-CFDA/PI was more clearly distinguished than the spermatozoa group stained with calcein AM/PI.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 flow cytometry 방법으로 6-CFDA/PI와 calcein AM/PI의 이중형광염색법을 이용하여 동결 융해 후 정자의 생존율을 비교, 분석한 연구가 수행되지 않아 두 형광염색법의 flow cytometry를 이용한 생존율 결과를 비교하고자 하였다.

제안 방법

1. Flow cytometry를 이용한 동결 융해 정자의 생존율 검사결과 동결보존된 제주흑우 2마리의 정액은 융해, 희석, 분획하여 6-CFDA(CFDA)/PI와 Cacein AM(CAM)/PI로 각각 이중염색 하였으며, flow cytometry 방법으로 정자의 생존율을 평가하였다. 결과는 Table 1과 같다.

대상 데이터

원정액의 운동성을 현미경으로 평가하여 90% 이상의 정액을 본 실험에 이용하였다. 정액 동결을 위한 동결 희석제는 Triladyl^® (Minitub^© , Germany)을 사용하였으며 200ml의 Triladyl에 항생제가 포함된 600ml 초순수 물을 첨가한 후 200ml의 난황을 첨가, 교반하여 Triladyl-egg yolk 희석제를 제조하였다.
정액 채취에 이용된 흑우는 국립축산과학원 난지축산연구소의 8~9세의 수컷 2두로서 별도의 공간에서 자유급식하여 사육하였으며, 정액 채취는 인공질을 이용하여 암컷을 보정시키고 수컷을 승가시켜 채정하였다. 인공질의 온도는 38℃를 유지하였으며, 수컷 penis의 삽입을 원활하게 하기 위해 인공 질의 삽입부에 윤활제를 도포한 후 반대편에 vinyl 콘을 설치하 정액을 수집, 회수하여 신속히 실험실로 이동하였다.

데이터처리

실험 결과의 통계처리는 SPSS 프로그램(ver 18.0)을 사용하였으며 paired T test를 실시하여 분석하였다.

성능/효과

6-CFDA/PI와 Calcein AM/PI의 이중염색 후 flow cytometry 법을 이용하여 형광 발현에 따른 density plot에서 정자의 분포를 비교하였을 때, Fig. 4와 같이 6-CFDA/PI 염색법과 calcein AM/PI 염색법은 정자세포의 집단의 염색상에 따른 구분에는 어려움이 없었으나 6-CFDA/PI 염색법이 calcein AM/PI 염색보다 정자세포 집단의 구분이 뚜렷함을 알 수 있었으며, Fig. 5와 같이 6-CFDA와 Calcein AM의 형광강도에 따른 정자세포 수와 집단에 따른 분포를 표현한 히스토그램 비교에서도 6-CFDA의 정자세포의 형광 발현에 따른 구분이 calcein AM보다 명확함을 알 수 있었다.
형광염색 양상에서 CFDA+/PI-와 CAM+/PI-는 정자는 살아 있으며 세포막 손상이 없는 상태, CFDA+/PI+와 CAM+/PI+는 정자는 살아있으나 세포막 손상이 있는 상태, CFDA-/PI+와 CAM-/PI+는 세포막 손상으로 인해 정자가 죽은 상태로 해석하 였다. flow cytometry 분석 결과 CFDA+/PI-와 CAM+/PI- 분포는 각각 27.50±0.76%, 29.26±1.28%이었으며, 두 형광염색군간 유의적인 차이는 없었다(p>0.05). CFDA+/PI+와 CAM+/PI+ 분포는 각각 23.
본 연구 결과에서는 flow cytometry를 이용하여 정자의 생존율을 측정할 경우 6-CFDA/PI 염색법과 Calcein AM/PI 염색법은 정자세포의 생존율 검사 결과에서 서로 유의적인 차이가 없어 둘 다 이용 가능하지만 6-CFDA/PI 염색법이 calcein AM/PI 염색법보다 염색상에 따른 정자세포의 집단을 구별할 때 더욱 명확하므로 정자세포 분석에는 6-CFDA/PI 염색법이 사용이 유용할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	인공수정에 사용되는 정자의 기능을 평가할 때 정자의 생존율이 중요한 지표로 이용되는데, 이를 평가하기 위한 방법에는 어떤 것들이 있는가?	1984; Rastegarnia A 등, 2013). 정자의 생존율은 정자 기능 평가에서 중요한 지표이며 평가를 위한 방법으로는 eosin-nigrosin 염색법, hypo osmotic swelling test(HOST)의 현미경하 검사법과 6-carboxyfluorescein diacetate(6-CFDA), SYBR-14, Hoechst-33342, calcein acetomethyl ester(Calcein AM), propidium iodide(PI), ethidium homodimer-1(EthD-1), cyanine Yo-Pro 등의 형광물질을 사용하여 형광현미경 및 flow cytometry 검사법이 사용되고 있다(Bratosin D 등, 2005; Chan LL 등, 2012; Gordon KM 등, 2003; Jarnagin JL 등, 1980; Jones KH와 Senft JA, 1985).
	인공수정에 주로 사용하는 정액의 형태는?	인공수정은 유전자의 보급과 가축 유전자의 품질을 향상시키기 위한 가장 주요한 방법으로 주로 신선 정액과 동결정액의 두 가지 형태의 정액을 이용하며, 특히 동결정액의 경우 액체질소의 –196℃에서 보관시 시간과 거리의 제약이 없이 인공수정을 실시할 수 있다(Bolten M 등, 2005; Vishwanth R와 Shanonn P, 2000; 최 등, 2011). 동결정액은 냉각 속도, 동결 속도, 동결 방법 등에 따라 품질에 영향을 끼치며 정자 생체막의 손상으로 인한 생존율 감소가 발생된다(Mahadevan M와 Trouson AO.
	동결정액의 품질에 영향을 미치는 요인은?	인공수정은 유전자의 보급과 가축 유전자의 품질을 향상시키기 위한 가장 주요한 방법으로 주로 신선 정액과 동결정액의 두 가지 형태의 정액을 이용하며, 특히 동결정액의 경우 액체질소의 –196℃에서 보관시 시간과 거리의 제약이 없이 인공수정을 실시할 수 있다(Bolten M 등, 2005; Vishwanth R와 Shanonn P, 2000; 최 등, 2011). 동결정액은 냉각 속도, 동결 속도, 동결 방법 등에 따라 품질에 영향을 끼치며 정자 생체막의 손상으로 인한 생존율 감소가 발생된다(Mahadevan M와 Trouson AO. 1984; Rastegarnia A 등, 2013).

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