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문제 정의
- 본 연구는 쑥 추출물(AA)과 홍국균(Monascus purpureus)으로 발효된 쑥(AAFM)을 이용하여 STZ로 인한 당뇨성 인지장애 개선효과를 확인하고자 수행되었다. C57BL/6L 마우스에 streptozotocin (STZ)을 복강 주사하여 당뇨를 유발시킨 후 4개의 군으로 분리하였고, 6주간 24시간 간격으로 AA 10 mg/kg BW와 AAFM10 mg/kg BW을 경구투여 하였다.
- 4B). 이러한 결과는 쑥 추출물(AA)을 발효하는 과정에서 폴리페놀을 포함한 생리활성 성분의 변화로 인해 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 억제하는 특성이 다소 감소한 것으로 판단되며, 이를 규명하기 위해 향후 주요 생리활성 성분 등의 변화를 분석하고자 한다.
- 따라서, 본 연구에서 홍국균(Monascus purpureus)을 이용한 쑥의 발효는 혈중지질개선효과, 혈당 강하효과 및 산화방지 효과 등에 대한 다양한 상승효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 최종적으로는 쑥(Artemisia argyi H) 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)의 비교를 통하여 당뇨성 인지손상 동물모델에서의 인지기능 개선 효과에 대한 발효 쑥의 새로운 생리활성 소재로의 산업화 가능성을 확인하고자 하였다.
가설 설정
- 1)Statistical significance was compared in each vertical row.
- 2)Statistical significance was compared in each horizontal row.
제안 방법
- AChE 활성은 상층액 5 μL와 50 mM 인산나트륨 완충용액 65μL를 혼합하고 37°C에서 15분간 배양한 뒤, 혼합물에 500 mM 아세틸콜린에스터레이스 기질 용액 70 μL를 첨가 후 37°C에서 5분간 배양하고 405 nm에서 2분 간격으로 10분 동안 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구는 쑥 추출물(AA)과 홍국균(Monascus purpureus)으로 발효된 쑥(AAFM)을 이용하여 STZ로 인한 당뇨성 인지장애 개선효과를 확인하고자 수행되었다. C57BL/6L 마우스에 streptozotocin (STZ)을 복강 주사하여 당뇨를 유발시킨 후 4개의 군으로 분리하였고, 6주간 24시간 간격으로 AA 10 mg/kg BW와 AAFM10 mg/kg BW을 경구투여 하였다. 7일 간격으로 혈당을 측정하였으며, 혈당 측정 결과 AA와 AAFM을 섭취한 군에서 STZ군 대비 유의적인 혈당감소를 나타내었다.
- Passive avoidance test는 단기 기억능력 및 학습능력을 확인하기 위해 진행하였으며 결과는 Fig. 2A와 같다. STZ군은 대조군(300 초) 대비 약 56초로 단기 기억능력 및 학습능력이 현저하게 감소하였으며, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 대조군과 비슷한 결과를 나타내어 단기 기억 및 학습능력이 개선되었음을 확인하였다.
- 8 mL, 200 mM phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF)10 μL]를 혼합하여 30분 동안 5분 단위로 교반해준 후 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 실험에 이용하였다. SOD 함량을 측정하기 위해 SOD kit을 사용하였고, 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 SOD 함량(U/mg protein)으로 표시하였다. 전 실험 과정은 4°C에서 진행하였으며 상층액의 단백질 함량을 측정하기 위하여 Bradford protein 측정법을 이용하였다.
- 5)에 100 mg/kg of body weight (BW) 농도로 녹인 STZ를 복강주사하였다. STZ을 주사한 후 72시간 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당측정기(Accu-Check glucose meter, Roche Diagnostics Australia Pty. Ltd., Castle Hill, Australia)로 공복 혈당(blood glucose)을 측정하였을 때 혈당이 250 mg/dL 이상인 개체를 당뇨 쥐로 간주하여 실험에 사용하였다. 군 분리는 대조군, streptozotocin군(STZ), 쑥 추출물(AA 10) 및 발효 쑥 추출물(AAFM 10)으로 총 4개의 군(n=12)으로 구성하였다.
- 실험에 사용되는 Y-maze는 흰색 플라스틱으로 이루어진 3개의 arm으로 구성되었으며, 각 arm의 길이, 높이, 너비는 33, 15, 10cm이다. arm 각각을 A와 B, C로 정한 후 지정된 arm에 마우스를 놓고 8분 동안 마우스가 들어간 이동 경로를 smart 3.0 video tracking system (Panlab, Barcelona, Spain)으로 기록하여 실험을 진행하였다. 3개의 서로 다른 arm으로 들어갔을 경우 1점(실제 변경, actual alternation)을 부여하고, 변경 행동력(alternation behavior)은 총 통과횟수(total arm entry)와 점수를 통해 다음 식을 이용하여 나타내었다.
- 체중 측정은 6주간 실험식이 급여 전후로 측정하였으며, 식이섭취량은 식이 6주차에 식이량을 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다. 공복혈당 측정은 매주 12시간 절식시킨 후 꼬리정맥으로부터 채혈하여 혈당측정기를 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 경상대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: GNU-160829-M0042)하에 수행되었다.
- , Castle Hill, Australia)로 공복 혈당(blood glucose)을 측정하였을 때 혈당이 250 mg/dL 이상인 개체를 당뇨 쥐로 간주하여 실험에 사용하였다. 군 분리는 대조군, streptozotocin군(STZ), 쑥 추출물(AA 10) 및 발효 쑥 추출물(AAFM 10)으로 총 4개의 군(n=12)으로 구성하였다. 쑥 추출물(AA 10)과 발효 쑥 추출물(AAFM 10)군은 각각 10 mg/kg BW 농도로 하루에 한번씩 6주간 식이 하였다.
- 본 실험에 사용된 동물은 9주령의 수컷 C57BL/6L을 Koatech(Pyeongtaek, Korea)에서 구입하였으며, 본 실험의 환경은 항온(22±2°C), 항습(50±5%)이 유지되며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 일정한 환경 내에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하였다. 대조군(control)에는 0.1 M 시트르산 완충용액(citrate buffer, pH 4.5)을, 나머지 군에는 0.1 M 시트르산 완충용액(pH 4.5)에 100 mg/kg of body weight (BW) 농도로 녹인 STZ를 복강주사하였다. STZ을 주사한 후 72시간 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당측정기(Accu-Check glucose meter, Roche Diagnostics Australia Pty.
- 당뇨로 인한 만성적인 고혈당은 체내 당화를 유도하며, 이러한 당화과정에서 발생되는 활성산소들에 의해 지질대사 장애나 생체 내 지질과산화를 유발하게 되며 당뇨로 인한 합병증은 노인성 치매와 동맥경화와 같이 산소유리기 생성의 의한 지질 과산화와 관련이 깊은 것으로 알려져 있으며(35), SOD는 과산화음이온(superoxide anions)과 같은 자유라디칼들을 과산화수소로 전환시키는 산화방지 효소로 체내 조직을 보호할 수 있는 것으로 알려져 있다(36). 따라서 본 연구에서는 동물실험 후 적출된 마우스 뇌와 간 조직 중의 SOD 및 MDA의 함량을 측정하였으며, 이를 Fig. 5에 각각 나타내었다. 마우스의 뇌 조직과 간 조직의 SOD 함량을 측정한 결과(Fig.
- 당뇨로 인한 혈액 내 중성지방의 증가는 혈중 콜레스테롤 전달을 증가시켜 당뇨합병증을 유발한다고 알려져 있으며(27), HDLC은 항 동맥경화의 지표로서 다른 지방질단백질과는 달리 혈관벽에 침착 되어 있는 LDLC를 분리해내어 간 조직으로 운반하여 에너지로 사용하거나 배설을 촉진하는 작용을 하여 혈중 지질 수준을 개선시키는 것으로 알려져 있다(28). 따라서, 본 연구에서는 당뇨로 인한 혈중 지질 개선지표로서 TCHO, TG 및 LDLC 함량을 측정하였다.
- 모든 실험은 각각 12회씩 반복하여 실시하였고 이를 mean±SD로 나타냈다.
- 학습을 마친 24시간 후, 각각의 마우스를 대상으로 단기 기억 시험을 시행하였다. 밝은 방에 마우스를 놓고 어두운 방으로 마우스의 4개의 발이 모두 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다.
- 발효를 위한 균인 Monascus purpureus (KCCM: Korean Culture Center for Microorganisms, Seoul, Korea)를 쌀 배지에 30°C, 150 rpm의 조건으로 5일간 진탕 배양하였다. 본 배양으로 쑥 추출(AA)액 400 mL와 쌀 28 g을 1L 플라스크에 분주하고 멸균한 후 5일간 종 배양한 Monascuspurpureus를 2% 접종하여 30oC, 150 rpm의 조건으로 5일간 진탕 배양하였다. 수득한 발효물을 121°C, 15분의 조건으로 멸균한 후 감압농축하고 동결건조를 실시하여 최종 발효물(Artemisia argyiH.
- 상층액 20 μL에 2 M 하이드록실아민+3.5 N수산화나트륨를 40 μL 첨가하고 1분 동안 상온에서 반응시킨 후, 0.5 N 염산(pH 1.2) 130 μL와 0.37 M 염화철 20 μL를 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 수득한 발효물을 121°C, 15분의 조건으로 멸균한 후 감압농축하고 동결건조를 실시하여 최종 발효물(Artemisia argyiH. fermented with Monascus purpureus, AAFM)을 수득하였다.
- 마우스가 60초 안에 도피대에 도달하는 경우에는 10초간 도피대 위에 머물게 하였으며, 도피대를 찾지 못한 경우에는 손으로 위치를 안내해주어 도피대에 도달하게 하여 20초간 위치를 인지하도록 하였다. 실험 5일째(probe trial)에는 도피대를 제거하고 학습능력을 측정하기 위해 60초간 도피대가 있었던 구역에 머무르는 시간을 기록하였다.
- Passive avoidance 실험에 사용된 장치는 2개의 방(밝은 방 및 어두운 방)으로 나누어져 있으며, 바닥은 철망으로 이루어져 있다. 실험 방법은 학습을 위해 각 마우스를 밝은 방에서 조명을 켜지 않은 채 1분간 적응시킨 뒤 조명을 켜고 2분 동안 방을 인지시켰다. 어두운 방과 연결된 문을 열고 마우스가 어두운 방으로 들어가게 되면 문을 닫고 전기충격(0.
- 실험은 Morris 방법(16)을 변형하여 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 장치는 원형으로 된 수조(지름 150 cm, 높이 60 cm)에 깨끗한 물을 30 cm 높이로 채운 뒤(20±2°C), 수조 사분면의 한 구역에 도피대(흰색)를 설치하고 탈지분유를 녹였다.
- 실험에 사용된 장치는 원형으로 된 수조(지름 150 cm, 높이 60 cm)에 깨끗한 물을 30 cm 높이로 채운 뒤(20±2°C), 수조 사분면의 한 구역에 도피대(흰색)를 설치하고 탈지분유를 녹였다. 실험이 시작된 첫날은 수조에서 도피대를 수면보다 1 cm 높게 하여 마우스가 이를 인지할 수 있게 60초간 훈련을 시킨 후, 4일 동안은 도피대를 수면에서 1 cm 낮게 하여 마우스가 볼 수 없게 설정한 뒤 원형 수조에서 입수하는 위치(N, S, E, W zone)를 다르게 하고 하루 4번씩 반복하여 진행하였으며 smart 3.0 video tracking system을 이용하여 기록하였다(hidden trial). 마우스가 60초 안에 도피대에 도달하는 경우에는 10초간 도피대 위에 머물게 하였으며, 도피대를 찾지 못한 경우에는 손으로 위치를 안내해주어 도피대에 도달하게 하여 20초간 위치를 인지하도록 하였다.
- 군 분리는 대조군, streptozotocin군(STZ), 쑥 추출물(AA 10) 및 발효 쑥 추출물(AAFM 10)으로 총 4개의 군(n=12)으로 구성하였다. 쑥 추출물(AA 10)과 발효 쑥 추출물(AAFM 10)군은 각각 10 mg/kg BW 농도로 하루에 한번씩 6주간 식이 하였다. 체중 측정은 6주간 실험식이 급여 전후로 측정하였으며, 식이섭취량은 식이 6주차에 식이량을 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
- 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)으로 인한 혈액 내 성분 변화를 조사하기 위해 혈청 내 간 독성 수치(GOT, GPT), 혈액요소질소(BUN), 크레아틴(CRE), 중성지방(triglyceride, TG) 등의 혈중 바이오마커의 함량을 측정하였다(Table 2). STZ군의 경우 간 손상 수치인 GOP, GPT함량이 증가하였으며, 신장 손상을 나타내는 BUN과 CRE 중 CRE함량은 크게 증가하지 않았지만 BUN 함량은 유의적으로 증가 하는 것으로 나타났다.
- 쑥을 열풍 건조하기 위해 4단계를 거쳤으며, 1-3단계에서는 100oC로 마지막 4단계에서 130°C로 건조하였으며 각 단계는 10분간 진행되었다.
- 아세틸콜린 함량은 Vincent와 Newsom-Davis의 방법을 변형하여 측정하였다(19). 상층액 20 μL에 2 M 하이드록실아민+3.
- 실험 방법은 학습을 위해 각 마우스를 밝은 방에서 조명을 켜지 않은 채 1분간 적응시킨 뒤 조명을 켜고 2분 동안 방을 인지시켰다. 어두운 방과 연결된 문을 열고 마우스가 어두운 방으로 들어가게 되면 문을 닫고 전기충격(0.5 mA, 2초)을 가하였다. 학습을 마친 24시간 후, 각각의 마우스를 대상으로 단기 기억 시험을 시행하였다.
- 열풍 건조된 쑥(Artemisia argyi H.)에 10배의 정제수를 가하고 121°C, 30분의 조건으로 추출(AA)하였다.
- 동물실험이 끝난 뒤 마우스를 12시간 절식시키고 공복혈당을 측정한 후 포도당을 체중 kg당 1g으로 복강 주사를 해주었다(17). 일정시간(0, 30, 60, 120, 180, 240, 360분)이 경과한 후 꼬리 정맥으로부터 채취한 혈액을 혈당측정기를 사용하여 혈당을 측정한 후 혈당의 변화를 관찰하였다.
- 종 배양을 위해 250 mL 플라스크에 쌀 7g을 담고 3시간 불린 후 물 빼기를 하고, 면전 하여 121°C, 15분의 조건으로 살균하였고 여기에 살균된 물 70 mL을 가하여 종배양 배지(쌀 배지)를 조제하였다.
- 쑥 추출물(AA 10)과 발효 쑥 추출물(AAFM 10)군은 각각 10 mg/kg BW 농도로 하루에 한번씩 6주간 식이 하였다. 체중 측정은 6주간 실험식이 급여 전후로 측정하였으며, 식이섭취량은 식이 6주차에 식이량을 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다. 공복혈당 측정은 매주 12시간 절식시킨 후 꼬리정맥으로부터 채혈하여 혈당측정기를 이용하여 측정하였다.
- )에 10배의 정제수를 가하고 121°C, 30분의 조건으로 추출(AA)하였다. 추출물은 감압농축 후 진공동결건조기(Operon, Gimpo, Korea)를 이용하여 건조하였고, 이들 건조물에 물을 가하여 건조 쑥 무게의 10배로 환원시켰다. 종 배양을 위해 250 mL 플라스크에 쌀 7g을 담고 3시간 불린 후 물 빼기를 하고, 면전 하여 121°C, 15분의 조건으로 살균하였고 여기에 살균된 물 70 mL을 가하여 종배양 배지(쌀 배지)를 조제하였다.
- 5 mA, 2초)을 가하였다. 학습을 마친 24시간 후, 각각의 마우스를 대상으로 단기 기억 시험을 시행하였다. 밝은 방에 마우스를 놓고 어두운 방으로 마우스의 4개의 발이 모두 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다.
- 혈청의 간 독성 수치인 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미네이스(glutamic oxaloacetic transaminase, GOT), 글루탐산 피루브산 트랜스아미네이스(glutamic pyruvic transaminase, GPT)와 혈액 요소질소(blood urea nitrogen, BUN), 크레아틴(creatine, CRE), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TCHO), 중성지방(triglyceride, TG), 고밀도지방질단백질-콜레스테롤(high density lipoprotein cholesterol, HDLC)는 자동 혈액 분석기(FUGIFILM DRI-CHEM 4000i, Minatoku, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 저밀도지방질단백질-콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol, LDLC)(mg/dL)은 Friedewald formula법에 의거하여 TCHO-(HDLC+TG/5)로 계산하였으며 HTR(%)은 (HDLC/TCHO)×100으로 계산하였다(18).
대상 데이터
- 발효를 위한 균인 Monascus purpureus (KCCM: Korean Culture Center for Microorganisms, Seoul, Korea)를 쌀 배지에 30°C, 150 rpm의 조건으로 5일간 진탕 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 동물은 9주령의 수컷 C57BL/6L을 Koatech(Pyeongtaek, Korea)에서 구입하였으며, 본 실험의 환경은 항온(22±2°C), 항습(50±5%)이 유지되며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 일정한 환경 내에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하였다.
- 스트렙토조토신은 Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA) 제품을 사용하였고 초과산화물제거효소(superoxide dismutase, SOD) kit는 Dojindo Molecular Technologes, Inc. (Rockvile, MD, USA) 제품을 사용하였다. 아이오딘화 아세틸싸이오콜린(acetylthiocholine iodide), 싸이오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA), 메타인산(metaphosphoric acid), 염화철(III) 육수화물(iron (III) chloride hexahydrate), 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO) 및 그 외 시약들은 Sigma-Aldrich Co.
- 실험에 사용되는 Y-maze는 흰색 플라스틱으로 이루어진 3개의 arm으로 구성되었으며, 각 arm의 길이, 높이, 너비는 33, 15, 10cm이다. arm 각각을 A와 B, C로 정한 후 지정된 arm에 마우스를 놓고 8분 동안 마우스가 들어간 이동 경로를 smart 3.
- 실험에 사용된 장치는 원형으로 된 수조(지름 150 cm, 높이 60 cm)에 깨끗한 물을 30 cm 높이로 채운 뒤(20±2°C), 수조 사분면의 한 구역에 도피대(흰색)를 설치하고 탈지분유를 녹였다.
- (Rockvile, MD, USA) 제품을 사용하였다. 아이오딘화 아세틸싸이오콜린(acetylthiocholine iodide), 싸이오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA), 메타인산(metaphosphoric acid), 염화철(III) 육수화물(iron (III) chloride hexahydrate), 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO) 및 그 외 시약들은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 평균에 대한 검증 방법은 SAS version 9.1 software (SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 하였고, Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 시료 간의 유의적인 차이를 5% 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 저밀도지방질단백질-콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol, LDLC)(mg/dL)은 Friedewald formula법에 의거하여 TCHO-(HDLC+TG/5)로 계산하였으며 HTR(%)은 (HDLC/TCHO)×100으로 계산하였다(18).
- 전 실험 과정은 4°C에서 진행하였으며 상층액의 단백질 함량을 측정하기 위하여 Bradford protein 측정법을 이용하였다.
성능/효과
- 4일간의 훈련을 마친 뒤, 도피대를 제거하고 도피대가 존재하였던 분면에서의 수영하는 모습을 관찰하는 probe test를 통해 쥐의 장기기억능력을 확인한 결과에서도 STZ군의 경우 도피대가 존재하던 영역에 머무르는 시간이 23.86±3.68초로 대조군(52.19±6.88초)에 비해 적은 것으로 나타났으며, 발효 쑥(AAFM)을 섭취하였을 경우 도피대가 존재하였던 영역에 머무르는 시간 38.53±8.97초로 증가하는 경향을 보였고, 발효 쑥(AAFM)과 유사하게 쑥 추출물(AA)를 섭취한 군에서도 34.45±5.42초로 증가하는 경향을 보였다(Fig. 3B).
- C57BL/6L 마우스에 streptozotocin (STZ)을 복강 주사하여 당뇨를 유발시킨 후 4개의 군으로 분리하였고, 6주간 24시간 간격으로 AA 10 mg/kg BW와 AAFM10 mg/kg BW을 경구투여 하였다. 7일 간격으로 혈당을 측정하였으며, 혈당 측정 결과 AA와 AAFM을 섭취한 군에서 STZ군 대비 유의적인 혈당감소를 나타내었다. Passive avoidance, Morris water maze 및 Y-maze test를 통해 STZ로 유도한 당뇨 동물모델에서 기억력 장애를 확인하였으며, 발효 쑥(AAFM)군에서 학습에 의한 기억력과 운동능력이 더 회복된 것을 확인하였다.
- 7일 간격으로 혈당을 측정하였으며, 혈당 측정 결과 AA와 AAFM을 섭취한 군에서 STZ군 대비 유의적인 혈당감소를 나타내었다. Passive avoidance, Morris water maze 및 Y-maze test를 통해 STZ로 유도한 당뇨 동물모델에서 기억력 장애를 확인하였으며, 발효 쑥(AAFM)군에서 학습에 의한 기억력과 운동능력이 더 회복된 것을 확인하였다. 혈청분석 결과 STZ군에서는 GOT, GPT, BUN와 혈중 지질 함량이 높게 나타난 반면 발효 쑥(AAFM)군에서는 GOT, GPT 및 BUN이 STZ그룹에 비해 유의적으로 감소하였으며, HTR이 높게 나타났고 TG와 LDLC가 낮게 나타나 혈중 지질 성분이 개선됨을 확인할 수 있었다.
- 3B). Probe test는 누적된 장기 학습 능력을 측정하는 것으로, 위의 결과를 통해 STZ로 유도된 당뇨 모델 동물의 학습 및 기억력 장애에 대한 발효 쑥(AAFM)의 개선 효과를 확인하였다.
- 2A와 같다. STZ군은 대조군(300 초) 대비 약 56초로 단기 기억능력 및 학습능력이 현저하게 감소하였으며, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 대조군과 비슷한 결과를 나타내어 단기 기억 및 학습능력이 개선되었음을 확인하였다. 또한 공간인지능력을 확인하기 위해 실시한 Y-maze test의 결과(Fig.
- 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)으로 인한 혈액 내 성분 변화를 조사하기 위해 혈청 내 간 독성 수치(GOT, GPT), 혈액요소질소(BUN), 크레아틴(CRE), 중성지방(triglyceride, TG) 등의 혈중 바이오마커의 함량을 측정하였다(Table 2). STZ군의 경우 간 손상 수치인 GOP, GPT함량이 증가하였으며, 신장 손상을 나타내는 BUN과 CRE 중 CRE함량은 크게 증가하지 않았지만 BUN 함량은 유의적으로 증가 하는 것으로 나타났다. 그에 반해, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군의 경우 두 군 모두 간독성 수치와 신장 독성 수치가 감소하는 것으로 나타났다.
- 5A 및 B), 뇌 조직에서는 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)에서 모두 대조군과 유사하게 SOD 함량이 증가되어 뇌에서 발생하는 산화적 스트레스에 대한 방어 메커니즘이 실험 급여를 한 군들에서 STZ군에 비해 활성화된 것을 확인하였다. 간 조직에서는 모든 군에서 유의적인 차이가 없었지만 STZ군에서 감소하고 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취할 경우 증가하는 경향을 나타내었다.
- 5C 및 D와 같다. 고혈당으로 발생되는 산화적 스트레스로 인해 STZ군에서의 MDA 함량은 뇌 조직과 간 조직 모두에서 증가하였으며, 쑥 추출물(AA)을 섭취한 그룹의 경우 간 조직에서는 MDA 함량이 유의적인 차이를 보이지는 않았으나 뇌 조직에서는 감소하였고, 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 그룹에서는 간 조직과 뇌 조직 모두에서 MDA 함량이 감소되는 것으로 나타났다. 또한 뇌조직의 경우 신경세포 구성을 위한 불포화지방산이 풍부하고 산화방지 효소의 활성이 상대적으로 낮아 산화적 스트레스에 취약한 구조를 가지고 있기 때문에 고혈당으로 인한 산화적 스트레스에 크게 영향을 받았을 것으로 추측되며(38), 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)은 이를 개선시킨 것으로 판단된다.
- 32 mg/dL로 지속적인 고혈당 상태를 나타내었다. 그러나 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 STZ군에 비해 최종적으로 혈당이 감소하는 것으로 나타났으며 두 군간의 유의적 차이는 나타나지 않았다.
- 87%로 증가하는 것으로 나타났다. 그에 반해, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 STZ군 보다 아세틸콜린에스터레이스의 활성이 감소하는 것을 확인하였으며, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 비교하였을 때 쑥 추출물(AA)이 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 좀 더 감소시키는 것으로 나타났다. 실제 다양한 식물소재에 존재하는 자연물질이 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 쑥과 같은 국화과인 민들레에서도 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다(34).
- STZ군의 경우 간 손상 수치인 GOP, GPT함량이 증가하였으며, 신장 손상을 나타내는 BUN과 CRE 중 CRE함량은 크게 증가하지 않았지만 BUN 함량은 유의적으로 증가 하는 것으로 나타났다. 그에 반해, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군의 경우 두 군 모두 간독성 수치와 신장 독성 수치가 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)으로 인해 고혈당이 개선됨으로써 고혈당으로 인한 산화적인 스트레스가 감소되고 쑥 자체의 산화방지 활성이 조직의 손상을 억제한 것으로 보인다(26).
- 내당능을 확인하기 위한 IPGTT 결과에서도 STZ군의 경우 360분이 경과하여도 혈당이 크게 감소하지 않았지만, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군의 경우 혈당이 서서히 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 1B). 혈당 곡선 하 면적(area of under curve, AUC)을 측정한 결과는 Fig.
- 특히, 쑥 추출물(AA)보다 마우스의 운동능력을 개선시켰으며, 혈중 지질 개선효과를 나타냈다. 더불어 산화방지 효과를 나타내 고혈당으로 발생될 수 있는 산화적 스트레스로부터 뇌 조직 등을 보호할 수 있음을 확인하였다. 결국 고혈당으로 인한 인지장애의 예방과 치료에도 효과를 나타낼 것으로 사료되어 고부가가치 식품으로 활용될 수 있는 산업적 가능성이 있다고 판단된다.
- STZ군은 대조군(300 초) 대비 약 56초로 단기 기억능력 및 학습능력이 현저하게 감소하였으며, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 대조군과 비슷한 결과를 나타내어 단기 기억 및 학습능력이 개선되었음을 확인하였다. 또한 공간인지능력을 확인하기 위해 실시한 Y-maze test의 결과(Fig. 2B)에서도 STZ군은 공간에 대한 인지능력이 대조군과 비교하였을 때 크게 감소하였으며, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 대조군과 유사한 공간인지능력을 나타내었다. 이미 다양한 연구결과에서 1형 당뇨 모델이 인지장애가 발생하는 것이 확인되었으며(22,23), 본 연구 결과 또한 STZ로 인한 1형 당뇨 모델이 인지장애가 유발된 것으로 판단되어 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)은 1형 당뇨로 인한 인지장애를 개선하는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 혈청분석 결과 STZ군에서는 GOT, GPT, BUN와 혈중 지질 함량이 높게 나타난 반면 발효 쑥(AAFM)군에서는 GOT, GPT 및 BUN이 STZ그룹에 비해 유의적으로 감소하였으며, HTR이 높게 나타났고 TG와 LDLC가 낮게 나타나 혈중 지질 성분이 개선됨을 확인할 수 있었다. 마우스 뇌 조직에서 발효 쑥(AAFM)은 아세틸콜린에스터레이스 활성을 저해시키고 아세틸콜린 함량을 증가시킴으로써 STZ로 인한 당뇨병에서의 신경전달시스템을 개선효과를 나타내었다. 발효 쑥(AAFM)의 경우, 마우스의 뇌 조직에서 SOD 함량을 증가시키고, 뇌와 간에서의 MDA 함량을 감소 시킴으로써 STZ와 같은 산화적 스트레스 인자에 대한 산화방지 효과를 나타내었다.
- AChE 활성은 상층액 5 μL와 50 mM 인산나트륨 완충용액 65μL를 혼합하고 37°C에서 15분간 배양한 뒤, 혼합물에 500 mM 아세틸콜린에스터레이스 기질 용액 70 μL를 첨가 후 37°C에서 5분간 배양하고 405 nm에서 2분 간격으로 10분 동안 흡광도를 측정하였다. 마우스 뇌 조직의 아세틸콜린에스터레이스 활성은 정상군을 100%로 하여 비교한 % 활성으로 나타내었다.
- 5에 각각 나타내었다. 마우스의 뇌 조직과 간 조직의 SOD 함량을 측정한 결과(Fig. 5A 및 B), 뇌 조직에서는 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)에서 모두 대조군과 유사하게 SOD 함량이 증가되어 뇌에서 발생하는 산화적 스트레스에 대한 방어 메커니즘이 실험 급여를 한 군들에서 STZ군에 비해 활성화된 것을 확인하였다. 간 조직에서는 모든 군에서 유의적인 차이가 없었지만 STZ군에서 감소하고 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취할 경우 증가하는 경향을 나타내었다.
- 27%)을 나타내 당뇨로 인한 인슐린 저항성이 확인되었다. 반면, 쑥 추출물(AA)군은 441.23%으로 약 6.84% 감소된 결과를 나타냈으며, 발효 쑥(AAFM)군은 412.33%로 약 14.73% 감소된 유의적인 차이를 나타냈다. 이러한 결과로부터 쑥 추출물(AA)보다 발효 쑥(AAFM)의 섭취가 당뇨에서 나타나는 인슐린 저항성을 더욱 개선시킴으로써 보다 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 판단하였다.
- 이러한 이유는 당뇨로 인한 체내 인슐린 저하가 정상적인 당의 대사를 억제하고 그로 인해 지질 생성과정이 활발해지면서 간에서 지질성분이 축적되어 혈중에 TG의 유출이 증가된 결과로 판단되며(29,30), 이는 STZ투여에 의해 유도된 당뇨모델을 이용한 다른 연구 결과와 유사한 경향을 보였다(31). 반면, 쑥 추출물(AA)에서는 STZ군과 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 발효 쑥(AAFM)군에서는 TCHO, TG, LDLC 및 HTR과 같은 혈중 지질함량은 대조 군과 유사한 수준으로 상당히 개선되는 현저한 차이를 나타내었다. 발효 쑥(AAFM)이 쑥 추출물(AA)에 비해 상대적으로 우수한 효과를 나타내는 것을 고려할 때, 홍국균(Monascus purpureus)을 이용한 발효과정 중 생성되는 콜레스테롤 생합성 저해물질로서의 모나콜린 K 및 폴리페놀 성분 등에 의해 콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA 환원효소를 저해하여 혈중 콜레스테롤 및 지질 함량이 일부 개선시킨 것으로 판단된다(13,14).
- 본 실험결과 또한 Fig. 4A에서 보는 바와 같이 뇌 조직에서 아세틸콜린에스터레이스의 활성이 STZ군에서 대조군 대비 128.62±6.87%로 증가하는 것으로 나타났다.
- Bellush 등(24)의 연구결과 당뇨 마우스는 세포 내로 포도당을 흡수하지 못해 체내 에너지 대사가 원활하게 이루어지지 못하여 움직임 능력이 저하되고, 새로운 환경에 처했을 때에도 정상 마우스에 비해 운동능력이 저하된다고 보고하였다. 본 실험의 결과에서도 Y-maze와 같은 낯선 환경에서 대조군(5.66 cm/sec) 대비 STZ군(3.95 cm/sec)은 움직임 속도가 약 30.21% 감소된 경향을 나타냈다. 쑥 추출물의 경우 4.
- 실험동물의 체중변화에서 STZ군이 −5.48±2.17 g으로 체중이 감소되었고, 쑥 추출물(AA)와 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 체중 감소가−2.49±2.56 g과 −2.86±2.81 g으로 나타났지만 STZ군보다는 체중 변화가 유의적으로 개선됨을 확인하였다.
- 3A는 쥐에게 도피대의 위치를 인식시키기 위한 훈련을 진행한 것으로 STZ로 유도된 고혈당에 의한 기억력 장애로 정상적인 학습이 진행되지 않았다는 Kuhad 등(25)의 결과와 유사하게 STZ군의 경우 학습기간이 경과하였음에도 정상적인 기억력 학습이 진행되지 않았음을 확인할 수 있었다. 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 훈련기간이 증가할수록 도피대의 위치를 인식하고 찾아가는 시간이 STZ군과 비교하였을 시 현저하게 감소하였다. 4일간의 훈련을 마친 뒤, 도피대를 제거하고 도피대가 존재하였던 분면에서의 수영하는 모습을 관찰하는 probe test를 통해 쥐의 장기기억능력을 확인한 결과에서도 STZ군의 경우 도피대가 존재하던 영역에 머무르는 시간이 23.
- 또한 뇌조직의 경우 신경세포 구성을 위한 불포화지방산이 풍부하고 산화방지 효소의 활성이 상대적으로 낮아 산화적 스트레스에 취약한 구조를 가지고 있기 때문에 고혈당으로 인한 산화적 스트레스에 크게 영향을 받았을 것으로 추측되며(38), 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)은 이를 개선시킨 것으로 판단된다. 쑥 추출물(AA)와 발효 쑥(AAFM)이 유사하게 SOD 증가가 나타났지만 간에서의 MDA는 발효 쑥(AAFM)이 STZ군에 비해 유의적으로 더 낮게 나타났다. 지질 생합성이 일어나는 간에서의 산화적 스트레스를 발효 쑥(AAFM)이 쑥 추출물(AA)보다 낮춰주는 것으로 판단된다.
- 실제 다양한 식물소재에 존재하는 자연물질이 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 쑥과 같은 국화과인 민들레에서도 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다(34). 아세틸콜린에스터레이스의 활성감소는 아세틸콜린 함량을 증가시키는 영향을 주기 때문에 아세틸콜린의 함량을 측정한 결과에서 쑥 추출물(AA)을 처리한 군에서 발효 쑥(AAFM)보다 높은 아세틸콜린 함량을 나타내었다(Fig. 4B). 이러한 결과는 쑥 추출물(AA)을 발효하는 과정에서 폴리페놀을 포함한 생리활성 성분의 변화로 인해 아세틸콜린에스터레이스의 활성을 억제하는 특성이 다소 감소한 것으로 판단되며, 이를 규명하기 위해 향후 주요 생리활성 성분 등의 변화를 분석하고자 한다.
- Chang 등(21)은 홍국 제제의 섭취가 당 신생합성을 감소시켜 혈당을 감소시킬 수 있다는 연구 결과를 보고하였으며, Park 등(10)은 쑥에 존재하는 자세오시딘을 비롯한 다양한 폴리페놀 성분의 효과에 의해 혈당이 낮아질 수 있다고 보고하였다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, 홍국균의 발효에 의한 다양한 대사산물과 쑥에 포함된 다양한 생리활성 물질들에 의한 혈당강하효과에 있어 상승효과가 나타나는 것으로 사료된다.
- 발효 쑥(AAFM)의 경우, 마우스의 뇌 조직에서 SOD 함량을 증가시키고, 뇌와 간에서의 MDA 함량을 감소 시킴으로써 STZ와 같은 산화적 스트레스 인자에 대한 산화방지 효과를 나타내었다. 이러한 결과들을 종합해볼 때, 홍국균을 활용한 발효 쑥(AAFM)은 STZ로 유도된 당뇨 모델에서 당뇨성 인지장애에 대한 기억력 개선효과를 나타내었다. 특히, 쑥 추출물(AA)보다 마우스의 운동능력을 개선시켰으며, 혈중 지질 개선효과를 나타냈다.
- 2B)에서도 STZ군은 공간에 대한 인지능력이 대조군과 비교하였을 때 크게 감소하였으며, 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)을 섭취한 군에서는 대조군과 유사한 공간인지능력을 나타내었다. 이미 다양한 연구결과에서 1형 당뇨 모델이 인지장애가 발생하는 것이 확인되었으며(22,23), 본 연구 결과 또한 STZ로 인한 1형 당뇨 모델이 인지장애가 유발된 것으로 판단되어 쑥 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)은 1형 당뇨로 인한 인지장애를 개선하는 효과가 있는 것으로 판단된다. Bellush 등(24)의 연구결과 당뇨 마우스는 세포 내로 포도당을 흡수하지 못해 체내 에너지 대사가 원활하게 이루어지지 못하여 움직임 능력이 저하되고, 새로운 환경에 처했을 때에도 정상 마우스에 비해 운동능력이 저하된다고 보고하였다.
- Mohan-Kumari 등(39)은 실험동물에 고콜레스테롤 식이와 홍국쌀을 혼합하여 공급한 후 혈청과 간에서 산화방지 효소 활성을 측정하였고, 홍국쌀을 섭취한 군에서 대조군에 비해 SOD, 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase; GPx) 및 카탈라아제(catalase; CAT) 모두 활성이 증가하였고 지질과산화물의 농도는 감소하였다고 보고하였다. 이와 유사하게 홍국균(Monascus purpureus)로 발효한 쑥(AAFM)에서 당뇨로 인한 고혈당으로 생성된 활성산소종의 제거를 촉진하여 뇌와 간 조직의 손상을 줄여 MDA 함량이 낮아진 것으로 판단된다.
- 이러한 결과들을 종합해볼 때, 홍국균을 활용한 발효 쑥(AAFM)은 STZ로 유도된 당뇨 모델에서 당뇨성 인지장애에 대한 기억력 개선효과를 나타내었다. 특히, 쑥 추출물(AA)보다 마우스의 운동능력을 개선시켰으며, 혈중 지질 개선효과를 나타냈다. 더불어 산화방지 효과를 나타내 고혈당으로 발생될 수 있는 산화적 스트레스로부터 뇌 조직 등을 보호할 수 있음을 확인하였다.
- 1C와 같다. 혈당 곡선 하 면적이 의미하는 바는 수치가 낮을수록 빠른 시간 내에 혈당수치가 복원되는 것을 의미하는데, 대조군(100%) 대비 STZ군은 약 4.7배 상승된 값(466.27%)을 나타내 당뇨로 인한 인슐린 저항성이 확인되었다. 반면, 쑥 추출물(AA)군은 441.
- 혈청 지질함량을 측정한 결과는 STZ군에서 TCHO (108.00±13.86 mg/dL) TG (181.67±6.66 mg/dL) 및 LDLC (30.13±5.44 mg/dL)가 가장 높게 분석되었으며, 반면 HTR은 63.33±2.31%로 가장 낮게 나타났다.
- Passive avoidance, Morris water maze 및 Y-maze test를 통해 STZ로 유도한 당뇨 동물모델에서 기억력 장애를 확인하였으며, 발효 쑥(AAFM)군에서 학습에 의한 기억력과 운동능력이 더 회복된 것을 확인하였다. 혈청분석 결과 STZ군에서는 GOT, GPT, BUN와 혈중 지질 함량이 높게 나타난 반면 발효 쑥(AAFM)군에서는 GOT, GPT 및 BUN이 STZ그룹에 비해 유의적으로 감소하였으며, HTR이 높게 나타났고 TG와 LDLC가 낮게 나타나 혈중 지질 성분이 개선됨을 확인할 수 있었다. 마우스 뇌 조직에서 발효 쑥(AAFM)은 아세틸콜린에스터레이스 활성을 저해시키고 아세틸콜린 함량을 증가시킴으로써 STZ로 인한 당뇨병에서의 신경전달시스템을 개선효과를 나타내었다.
후속연구
- 더불어 산화방지 효과를 나타내 고혈당으로 발생될 수 있는 산화적 스트레스로부터 뇌 조직 등을 보호할 수 있음을 확인하였다. 결국 고혈당으로 인한 인지장애의 예방과 치료에도 효과를 나타낼 것으로 사료되어 고부가가치 식품으로 활용될 수 있는 산업적 가능성이 있다고 판단된다.
- 따라서, 본 연구에서 홍국균(Monascus purpureus)을 이용한 쑥의 발효는 혈중지질개선효과, 혈당 강하효과 및 산화방지 효과 등에 대한 다양한 상승효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 최종적으로는 쑥(Artemisia argyi H) 추출물(AA)과 발효 쑥(AAFM)의 비교를 통하여 당뇨성 인지손상 동물모델에서의 인지기능 개선 효과에 대한 발효 쑥의 새로운 생리활성 소재로의 산업화 가능성을 확인하고자 하였다.
- 73% 감소된 유의적인 차이를 나타냈다. 이러한 결과로부터 쑥 추출물(AA)보다 발효 쑥(AAFM)의 섭취가 당뇨에서 나타나는 인슐린 저항성을 더욱 개선시킴으로써 보다 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 판단하였다.
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