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문제 정의
- cinerea의 기주범위에 대한 보고 역시 매우 중요한 정보라 할 수 있다. 본 연구를 통해 산딸기에 발생하는 잿빛곰팡이병의 병원균으로 Botrytis cinerea를 국내 최초로 보고하고자 한다.
- 분석 결과 산딸기에서 발생한 잿빛곰팡이병의 병원균은 Botrytis cinerea로 확인되었으며, 건전한 산딸기 식물체를 대상으로 접종실험 한 결과 산딸기에 대한 병원성을 확인하였다. 지금까지 국내에서 B. cinerea에 의한 산딸기 잿빛곰팡이병이 보고되지 않았으므로 본 연구결과를 바탕으로 이 병을 국내 최초로 보고한다.
제안 방법
- 3일 배양 후 자라난 균사의 끝부분을 떼어내어 새로운 PDA에 옮겨 순수분리하고 25°C에서 14일간 배양하여 균학적 특징을 관찰하였다.
- G3PDH 유전자는 HSP60, RPB2 유전자와 동일한 조건에서 annealing 온도만 64°C로 조정하여 진행하였다[4].
- HSP60과 RPB2 유전자의 경우 94°C에서 5분간 pre-denaturation을 진행하고 94°C에서 1분간 denaturation, 50°C에서 1분간 annealing, 72°C에서 2분간 extension을 1 cycle로 하여 총 35회 진행하였다.
- PCR반응의 조건은 ITS 영역의 경우 먼저 94°C에서 2분간 pre-denaturation을 진행한 후 94°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 45초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여 총 35회 진행하였다.
- cinerea의 해당 유전자의 염기서열과 99% 이상의 유사도를 지니고 있었다. 계통학적 분석을 수행하기 위해 NCBI에 등록된 여러 근연종의 염기서열을 수집하고 HSP60, RPB2, G3PDH 유전자의 3개 유전자 부위의 염기서열을 연결하여 결합염기서열을 작성하였다. MEGA 6.
- 대조구로는 멸균수를 분무하였으며, 시험구와 대조구 모두 접종 후 48시간 동안 비닐로 밀봉하여 습도를 유지하고 비닐을 제거한 뒤 발병 및 진행을 관찰하였다. 균총디스크 접종은 7일간 배양한 균총으로부터 지름 3 mm 크기의 균총디스크를 제작하고 건전한 산딸기 잎의 표면을 70% 에탄올로 소독한 뒤 균총디스크를 얹어 접종하였다. 대조구에는 균을 배양하지 않은 PDA 디스크를 접종하였으며, 접종 후 비닐로 48시간 동안 밀봉하여 습도를 유지한 뒤 비닐과 디스크를 제거하고 병의 진행을 관찰하였다.
- 형성된 균핵을 떼어내어 멸균수에 희석하고 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 수지상으로 분지된 분생포자경 위에 많은 양의 분생포자가 달려있는 모양을 관찰하였다(Fig. 2C). 분생포자는 무색의 타원형 또는 계란형으로서 크기는 10.
- 분무접종 실험을 위해 병원균을 10일간 배양한 배지를 사용하여 포자 현탁액을 제작하고, 건전한 산딸기의 잎을 70% 에탄올로 세척하여 살균 및 건조한 뒤 포자 현탁액을 분무하였다. 대조구로는 멸균수를 분무하였으며, 시험구와 대조구 모두 접종 후 48시간 동안 비닐로 밀봉하여 습도를 유지하고 비닐을 제거한 뒤 발병 및 진행을 관찰하였다. 균총디스크 접종은 7일간 배양한 균총으로부터 지름 3 mm 크기의 균총디스크를 제작하고 건전한 산딸기 잎의 표면을 70% 에탄올로 소독한 뒤 균총디스크를 얹어 접종하였다.
- 균총디스크 접종은 7일간 배양한 균총으로부터 지름 3 mm 크기의 균총디스크를 제작하고 건전한 산딸기 잎의 표면을 70% 에탄올로 소독한 뒤 균총디스크를 얹어 접종하였다. 대조구에는 균을 배양하지 않은 PDA 디스크를 접종하였으며, 접종 후 비닐로 48시간 동안 밀봉하여 습도를 유지한 뒤 비닐과 디스크를 제거하고 병의 진행을 관찰하였다. 접종실험 결과, 분무접종 실험에서는 잎의 선단부위부터 병반이 관찰되었고, 이후 잎의 안쪽을 향해 병반이 진행되는 양상이 관찰되었다(Fig.
- 병든 잎을 채집하여 이병부와 건전부의 경계부위를 5 × 5 mm 크기로 절단하고 1% 차아염소산나트륨 용액으로 1분간 표면 살균하였다.
- cinerea일 것으로 추측되었다[4]. 분리한 병원균의 계통학적 분석을 위해 배양한 균으로부터 DNA를 추출한 뒤 polymerase chain reaction (PCR)을 진행하였다. 계통학적 유연관계 분석에는 곰팡이의 분류에 일반적으로 사용되는 internal transcribed spacer (ITS) 영역과 함께 최근 Botrytis속 진균류의 분자 지표로 사용되는 3가지 유전자, 즉 RNA polymerase subunit II (RPB2) 유전자, heat-shock protein 60 (HSP60) 유전자 및 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) 유전자가 사용되었다[5].
- 산딸기에 대한 병원성을 확인하기 위해 건전한 산딸기 식물체를 대상으로 분무접종과 균총디스크 접종실험을 실시하였다. 분무접종 실험을 위해 병원균을 10일간 배양한 배지를 사용하여 포자 현탁액을 제작하고, 건전한 산딸기의 잎을 70% 에탄올로 세척하여 살균 및 건조한 뒤 포자 현탁액을 분무하였다. 대조구로는 멸균수를 분무하였으며, 시험구와 대조구 모두 접종 후 48시간 동안 비닐로 밀봉하여 습도를 유지하고 비닐을 제거한 뒤 발병 및 진행을 관찰하였다.
- cinerea인 것으로 최종 확인되었다. 산딸기에 대한 병원성을 확인하기 위해 건전한 산딸기 식물체를 대상으로 분무접종과 균총디스크 접종실험을 실시하였다. 분무접종 실험을 위해 병원균을 10일간 배양한 배지를 사용하여 포자 현탁액을 제작하고, 건전한 산딸기의 잎을 70% 에탄올로 세척하여 살균 및 건조한 뒤 포자 현탁액을 분무하였다.
- 초기에는 잎의 가장자리나 과경 부위에 갈색 반점이 나타나며 병이 진전되면 병반 부위가 확대되고 수침상으로 물러지면서 표면이 회색 곰팡이로 덮이는 것이 관찰되었다. 이러한 증상이 발생한 잎으로부터 병원균을 분리하고 균학적 특성을 조사하고 계통학적 분석을 수행하였다. 분석 결과 산딸기에서 발생한 잿빛곰팡이병의 병원균은 Botrytis cinerea로 확인되었으며, 건전한 산딸기 식물체를 대상으로 접종실험 한 결과 산딸기에 대한 병원성을 확인하였다.
- 이상증상을 일으키는 병원균을 동정하기 위하여 병반으로부터 병원균을 분리 배양하였다. 병든 잎을 채집하여 이병부와 건전부의 경계부위를 5 × 5 mm 크기로 절단하고 1% 차아염소산나트륨 용액으로 1분간 표면 살균하였다.
- G3PDH 유전자는 HSP60, RPB2 유전자와 동일한 조건에서 annealing 온도만 64°C로 조정하여 진행하였다[4]. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide로 염색하고 UV illuminator 상에서 목적하는 DNA 단편의 증폭여부를 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 EXOSAP-IT (GE Healthcare, Amersham, UK)을 이용하여 정제 후 염기서열 분석(SolGent, Daejeon, Korea)을 의뢰하였다.
- 5% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide로 염색하고 UV illuminator 상에서 목적하는 DNA 단편의 증폭여부를 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 EXOSAP-IT (GE Healthcare, Amersham, UK)을 이용하여 정제 후 염기서열 분석(SolGent, Daejeon, Korea)을 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST search를 통해 GenBank에 등록되어 있는 종들과의 유사도를 확인하였다.
- 배양 10일 후부터 회색 균사체가 뭉쳐지면서 작은 소립의 균핵을 형성하기 시작하였으며, 21일경에는 약 2~4 mm 정도의 균핵이 배지 표면에 10~15개 가량 형성되었다. 형성된 균핵을 떼어내어 멸균수에 희석하고 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 수지상으로 분지된 분생포자경 위에 많은 양의 분생포자가 달려있는 모양을 관찰하였다(Fig.
대상 데이터
- 0 프로그램을 사용하여 산딸기에서 분리한 균주와 근연종들 간의 유연관계 분석을 수행하고, neighbor-joining 알고리즘을 사용한 계통수를 작성하였다[7]. 계통수 작성을 위해 사용한 근연종 균주의 유전자 정보는 Table 2에 기재하였으며, 계통분석을 위한 outgroup으로는 Sclerotinia sclerotiorum을 사용하였다. 분석 결과, 산딸기 분리균은 국내 및 국외에서 보고되어 있는 B.
데이터처리
- 계통학적 분석을 수행하기 위해 NCBI에 등록된 여러 근연종의 염기서열을 수집하고 HSP60, RPB2, G3PDH 유전자의 3개 유전자 부위의 염기서열을 연결하여 결합염기서열을 작성하였다. MEGA 6.0 프로그램을 사용하여 산딸기에서 분리한 균주와 근연종들 간의 유연관계 분석을 수행하고, neighbor-joining 알고리즘을 사용한 계통수를 작성하였다[7]. 계통수 작성을 위해 사용한 근연종 균주의 유전자 정보는 Table 2에 기재하였으며, 계통분석을 위한 outgroup으로는 Sclerotinia sclerotiorum을 사용하였다.
- 증폭이 확인된 PCR 산물은 EXOSAP-IT (GE Healthcare, Amersham, UK)을 이용하여 정제 후 염기서열 분석(SolGent, Daejeon, Korea)을 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST search를 통해 GenBank에 등록되어 있는 종들과의 유사도를 확인하였다. 분석 결과, 산딸기에서 분리한 균주의 ITS 영역, HSP60, RPB2, G3PDH 유전자의 염기서열은 모두 B.
이론/모형
- Phylogenetic tree of members of the genus Botrytis based on the combined sequence of internal transcribed spacer region, RNA polymerase subunit II, heat-shock protein 60, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase sequence data. The tree was constructed using the neighbor-joining method with 1,000 replicates. Sclerotinia sclerotiorum was used as outgroup.
성능/효과
- 이러한 형태적 특징은 이전에 보고된 B. cinerea의 특징과 거의 일치하여(Table 1) 산딸기에서 분리한 병원균은 B. cinerea일 것으로 추측되었다[4]. 분리한 병원균의 계통학적 분석을 위해 배양한 균으로부터 DNA를 추출한 뒤 polymerase chain reaction (PCR)을 진행하였다.
- 1C). 균총디스크 접종 실험에서는 균총디스크를 중심으로 병반이 발생하여 진행되는 모습을 관찰할 수 있었으며, 분무접종에 비해 병의 진행속도가 더 빠른 양상을 보였다(Fig. 1D). 분무접종 실험과 균총디스크 접종 실험 모두 대조구에서는 병이 발생하지 않았으며, 시험구에서 발생한 병반으로부터 B.
- 3). 따라서, 형태학적 특징 및 계통학적 유연관계 분석 결과를 종합하여 판단한 결과, 산딸기 분리균은 B. cinerea인 것으로 최종 확인되었다. 산딸기에 대한 병원성을 확인하기 위해 건전한 산딸기 식물체를 대상으로 분무접종과 균총디스크 접종실험을 실시하였다.
- 1D). 분무접종 실험과 균총디스크 접종 실험 모두 대조구에서는 병이 발생하지 않았으며, 시험구에서 발생한 병반으로부터 B. cinerea가 재분리 되는 것을 확인하였다.
- 이러한 증상이 발생한 잎으로부터 병원균을 분리하고 균학적 특성을 조사하고 계통학적 분석을 수행하였다. 분석 결과 산딸기에서 발생한 잿빛곰팡이병의 병원균은 Botrytis cinerea로 확인되었으며, 건전한 산딸기 식물체를 대상으로 접종실험 한 결과 산딸기에 대한 병원성을 확인하였다. 지금까지 국내에서 B.
- 계통수 작성을 위해 사용한 근연종 균주의 유전자 정보는 Table 2에 기재하였으며, 계통분석을 위한 outgroup으로는 Sclerotinia sclerotiorum을 사용하였다. 분석 결과, 산딸기 분리균은 국내 및 국외에서 보고되어 있는 B. cinerea와 같은 그룹을 형성하였으며, 다른 근연종과 확실하게 구분되었다(Fig. 3). 따라서, 형태학적 특징 및 계통학적 유연관계 분석 결과를 종합하여 판단한 결과, 산딸기 분리균은 B.
- 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST search를 통해 GenBank에 등록되어 있는 종들과의 유사도를 확인하였다. 분석 결과, 산딸기에서 분리한 균주의 ITS 영역, HSP60, RPB2, G3PDH 유전자의 염기서열은 모두 B. cinerea의 해당 유전자의 염기서열과 99% 이상의 유사도를 지니고 있었다. 계통학적 분석을 수행하기 위해 NCBI에 등록된 여러 근연종의 염기서열을 수집하고 HSP60, RPB2, G3PDH 유전자의 3개 유전자 부위의 염기서열을 연결하여 결합염기서열을 작성하였다.
- 이와 같이 산딸기에서 발생한 이상증상으로부터 분리한 병원균의 균학적 특성 및 DNA 염기서열을 분석한 결과 Botrytis cinerea로 동정되었으며, 분리한 병원균을 산딸기의 잎과 열매에 접종하여 병원성을 확인하였다. B.
- 대조구에는 균을 배양하지 않은 PDA 디스크를 접종하였으며, 접종 후 비닐로 48시간 동안 밀봉하여 습도를 유지한 뒤 비닐과 디스크를 제거하고 병의 진행을 관찰하였다. 접종실험 결과, 분무접종 실험에서는 잎의 선단부위부터 병반이 관찰되었고, 이후 잎의 안쪽을 향해 병반이 진행되는 양상이 관찰되었다(Fig. 1C). 균총디스크 접종 실험에서는 균총디스크를 중심으로 병반이 발생하여 진행되는 모습을 관찰할 수 있었으며, 분무접종에 비해 병의 진행속도가 더 빠른 양상을 보였다(Fig.
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