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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 천안 지역의 대표적인 온천인 테딘 워터파크의 천연 탄산 온천수의 입욕 치료를 통하여, 그것의 말초 혈관에서의 혈행개선 효과에 대해 실험적으로 입증하고자 하였다.
- 특히 테딘 천연 탄산온천수의 경우 아토피 피부염에 있어 비만세포의 침윤과 피부 발진을 억제하고 면역 반응을 억제시키는 연구 결과13)가 있어 그 우수성에 주목받고 있으며, 순환기·통증 질환 등에도 치료효과가 기대된다. 이에 본 연구에서는, 온천의 상기 한의학적 효과에 입각하여 천연 탄산 성분이 포함된 테딘 워터파크 내 온천수와 인공 탄산 성분이 포함된 온천수를 이용하여 온천욕과 지혈작용의 관계를 파악하고 체내 혈행 개선 치료 효과에 어떤 영향을 미치는지에 대해 실험적으로 증명해 보고자 하였다.
제안 방법
- 1차 도포 후 7일째부터는, 1주일에 3회씩 3주간 0.4% DNCB 용액 150 ㎕를 재차 도포 (10주령 ∼ 13주령)하여 아토피 피부염을 유발시켰다.
- 7주령의 NC/Nga 생쥐를 그룹당 5마리씩 7그룹을 1주일 동안 적응시킨 후 정상군(SPF-NC/Nga)을 제외한 나머지 NC/Nga 생쥐의 등에 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24시간 방치 후 1%의 dinitrochlorobenzene(DNCB)가 들어있는 아세톤 : 올리브오일(3 : 1) 200 ㎕를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일째부터는, 1주일에 3회씩 3주간 0.
- 아토피 유발을 하지 않은 SPF-NC/Nga 정상군을 제외한 나머지 6개 군에 DNCB로 유도하여 아토피피부염을 유발한 후, 한 군은 아무 처치도 하지 않은 대조군(DNCB-NC/Nga), 한 군은 25℃의 동일한 수돗물에서 수영시켜 동일한 스트레스를 유발한 수돗물 군(DNCB-Tap_W), 천연 탄산온천수 실험군은 DNCB로 유도한 생쥐를 각각 25℃, 28℃의 천연 탄산온천수에서 수영을 시켰으며(DNCB-Tedin 25℃,DNCB-Tedin 28℃), 인공탄산수 실험군은 DNCB로 유도한 생쥐를 인공탄산수에서 동일하게 수영을 시켰다. 양성대조군은 DNCB로 유도한 생쥐를 입욕 없이 Aspirin을 매일 50 mg/kg 씩 경구투여 하였다.
- 아토피 유발을 하지 않은 SPF-NC/Nga 정상군을 제외한 나머지 6개 군에 DNCB로 유도하여 아토피피부염을 유발한 후, 한 군은 아무 처치도 하지 않은 대조군(DNCB-NC/Nga), 한 군은 25℃의 동일한 수돗물에서 수영시켜 동일한 스트레스를 유발한 수돗물 군(DNCB-Tap_W), 천연 탄산온천수 실험군은 DNCB로 유도한 생쥐를 각각 25℃, 28℃의 천연 탄산온천수에서 수영을 시켰으며(DNCB-Tedin 25℃,DNCB-Tedin 28℃), 인공탄산수 실험군은 DNCB로 유도한 생쥐를 인공탄산수에서 동일하게 수영을 시켰다. 양성대조군은 DNCB로 유도한 생쥐를 입욕 없이 Aspirin을 매일 50 mg/kg 씩 경구투여 하였다. 습도 및 온도 조건은 동일하게 유지하였으며 수영 시간의 경우 3주간 매일 20분간 유지하였다.
- 실험 종료 후 15주령 NC/Nga 생쥐를 에틸에테르 (ethyl ether)로 마취하고, 미리 항응고제로서 0.15M의 구연산나트륨 (sodium citrate) 0.2ml을 주사기에 넣고 심장천좌법으로부터 1.1ml을 채혈한다. 0.
- USA)를 이용한 탁도 측정법으로 측정한다. 세척 혈소판(Washed platelet, PRP)을 37℃에서 3분간 인큐베이션(incubation) 시킨 후, Platelet-poor plasma (PPP) 400 ㎕과 Platelet Rich Plasma (PRP) 400 ㎕을 각각 quartz에 분주하고 stirr bar를 넣은 후 프로그램을 실행시킨다. 시료sample (200, 100, 50 ㎍/ml)을 넣고 2분간 배양한 후 ADP (5 uM) 또는 collagen (5 ㎍/ml)을 첨가하여 혈소판 응집반응을 5분간 측정한 후 억제정도 (inhibition, %)를 계산한다.
- 세척 혈소판(Washed platelet, PRP)을 37℃에서 3분간 인큐베이션(incubation) 시킨 후, Platelet-poor plasma (PPP) 400 ㎕과 Platelet Rich Plasma (PRP) 400 ㎕을 각각 quartz에 분주하고 stirr bar를 넣은 후 프로그램을 실행시킨다. 시료sample (200, 100, 50 ㎍/ml)을 넣고 2분간 배양한 후 ADP (5 uM) 또는 collagen (5 ㎍/ml)을 첨가하여 혈소판 응집반응을 5분간 측정한 후 억제정도 (inhibition, %)를 계산한다. 억제정도(inhibition, %)는 시료를 처리하지 않은 것을 control로 하여, 다음 공식과 같은 방법으로 구한다(fig 1).
- 수컷 NC/Nga 마우스에게 테딘 온천수 목욕과 함께 아스피린(50mg/kg)을 3주간 투여하였다. 이후 혈액을 채취하여 혈소판 응집 반응을 측정 후 control군 대비 응집 억제능을 계산하였다.
- 수컷 NC/Nga 마우스에게 테딘 온천수 목욕과 함께 아스피린(50mg/kg)을 3주간 투여하였다. 이후 혈액을 채취하여 혈소판 응집 반응을 측정 후 control군 대비 응집 억제능을 계산하였다. 연구 결과 3주간 테딘 온천수에 목욕한 실험군과 아스피린 경구투여 실험군은 콜라겐과 ADP로 유도된 혈소판 응집이 강력하게 억제되었다(Fig.
- 본 연구에서는 아토피 유발 모델에 대해 25℃, 28℃로 각기 온도가 다른 테딘 천연온천수와 인공적으로 제작한 탄산수, 수돗물에서 동일한 조건에서 자유로이 수영하도록 하였으며, 양성대조군으로 aspirin을 경구 투여하였다(일 50 mg/kg).
- 3주간 수영 및 경구투여 후 각 군의 혈액을 채취하여 아무 처치도 하지 않은 일반 Normal군의 혈소판 응집력을 100%으로 가정하고, ADP와 collagen을 첨가하여 각군의 혈소판 응집 억제능을 비교하였다. 그 결과 25℃, 28℃의 테딘 천연온천수 수영군에서 ADP 및 collagen 첨가 시 혈소판 응집이 유의하게 감소하였다(FIg.
- DNCB로 아토피를 유발한 NC/Nga mouse를 각기 다른 온도의 천연 탄산온천수와 인공 탄산수에서 입욕을 시켜 혈행개선 및 혈소판 응집 억제능에 미치는 영향을 살펴본 결과 대조군과 비교하여 다음과 같은 유의한 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 동물은 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12 시간 light-dark cycle의 환경을 유지하며 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 아토피 피부염 병변을 관찰하기 위하여 수컷이며 7 주령의 20～22g NC/Nga 생쥐(SLC, Inc, Japan)를 중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.
- 본 실험에 사용한 혈행개선 관련 양성대조군으로 Aspirin을 사용하였다. Aspirin은 혈소판 내의 cyclooxygenase를 비가역적으로 차단, 혈소판 응집에 필요한 thromboxane A2의 생성을 막아 혈전 형성을 억제한다10).
- 실험에 사용한 천연 탄산수의 경우 충남 천안시 동남구 성남면 용원리 224-11번지에 위치한 테딘 워터파크에서 공급 받았다. 온도는 25℃, 28℃의 2 종으로 나누어 공급 받았다.
- 인공 탄산수의 경우 40℃로 데운 지하수를 대전대학교부속 천안 한방 병원에서 제조하였으며, 탄산가스 주입장치를 통하여 지하수에 탄산가스를 함유하도록 주입한 후 미네랄 팩을 통과시켜 제조하였다. 함유된 탄산은 탄산, 중탄산의 형태로 존재하고, 그 함유량은 탄산(H2CO3) 2913㎎/L, 중탄산(HCO3) 305㎎/L이며, 그 구성비는 9.
데이터처리
- 각 실험군 결과 값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, P<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 실험 종료 후 15주령 NC/Nga 생쥐의 혈소판 응집 억제능은 측정계 (Aggregometer, Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA. USA)를 이용한 탁도 측정법으로 측정한다. 세척 혈소판(Washed platelet, PRP)을 37℃에서 3분간 인큐베이션(incubation) 시킨 후, Platelet-poor plasma (PPP) 400 ㎕과 Platelet Rich Plasma (PRP) 400 ㎕을 각각 quartz에 분주하고 stirr bar를 넣은 후 프로그램을 실행시킨다.
성능/효과
- 또한 콜라겐 유도 혈소판 응집의 경우만 응집 억제에 유효한 효과(p<0.01) 가 있는 아스피린 경구투여 실험군과는 달리 25℃, 28℃의 천연 테딘 온천수에서는 콜라겐과 ADP 유도 혈소판 응집이 모두 유효하게 억제되었다(p<0.05).
- 이후 혈액을 채취하여 혈소판 응집 반응을 측정 후 control군 대비 응집 억제능을 계산하였다. 연구 결과 3주간 테딘 온천수에 목욕한 실험군과 아스피린 경구투여 실험군은 콜라겐과 ADP로 유도된 혈소판 응집이 강력하게 억제되었다(Fig.2). 이로서 테딘 온천수 목욕이 혈소판 응집 억제에 유효한 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 2). 이로서 테딘 온천수 목욕이 혈소판 응집 억제에 유효한 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 콜라겐 유도 혈소판 응집의 경우만 응집 억제에 유효한 효과(p<0.
- 1) 천연 탄산온천수 실험군은 대조군과 비교하여 온도에 상관없이 두 군 모두에서 혈소판 응집 억제능이 유의하게 증가하였다(p<0.05)
- 3주간 수영 및 경구투여 후 각 군의 혈액을 채취하여 아무 처치도 하지 않은 일반 Normal군의 혈소판 응집력을 100%으로 가정하고, ADP와 collagen을 첨가하여 각군의 혈소판 응집 억제능을 비교하였다. 그 결과 25℃, 28℃의 테딘 천연온천수 수영군에서 ADP 및 collagen 첨가 시 혈소판 응집이 유의하게 감소하였다(FIg.2.).
- 상기 연구에서 테딘 온천수는 온도에 관계없이 ADP 유발 응집반응과 collagen 유발 응집 반응에 모두 유의한 억제능을 보였다. 이는 aspirin과는 달리 테딘 온천수는 fibrinogen 등 ADP가 관여하는 응집반응 억제에 관여하기 때문으로 사료된다.
- fibrinogen은 혈소판 응집 작용 중 혈관수축을 주로 담당하는 serotonin이나 TXA²와는 다르게 직접적인 혈소판-혈소판 간 응집반응에 필수적인 adhesive protein으로 알려져 있다. 또한 천연온천수 간에는 온도간 유의한 차이는 없었으며, 40℃의 인공 탄산수 군에서는 응집반응 억제능이 나타나지 않았다. 이에 온열작용 혹은 단순 주입된 탄산 성분과는 다른 테딘 천연탄산수 만의 유의한 혈소판 응집 억제 반응을 보이는 것으로 사료된다.
- 결론적으로, 테딘 천연온천수는 온도에 관계없이 입욕 후 유의한 혈소판 응집 억제능을 나타내었으며, 이는 aspirin의 collagen 유발 응집 뿐만 아니라 ADP가 관여하는 응집반응에도 억제능이 작용한다고 할 수 있다. 이에 고령화 사회와 식습관의 변화로 심뇌혈관질환의 이환율이 증가하는 시점에서 보조적 치료로서의 테딘 온천 입욕의 가능성을 보여줬다고 할 수 있다.
- 2) 인공 탄산온천수 실험군은 대조군과 비교하여 혈소판 응집 억제능에 유의한 차이가 없었다.
- 3) 천연 탄산온천수 실험군은 양성대조군과 비교하여 동일하게 collagen 응집 과정에 관여하여 유의하게 응집을 억제하였고, 양성대조군과는 달리 ADP 응집 과정에도 유의하게 관여하였다.
후속연구
- 이에 고령화 사회와 식습관의 변화로 심뇌혈관질환의 이환율이 증가하는 시점에서 보조적 치료로서의 테딘 온천 입욕의 가능성을 보여줬다고 할 수 있다. 또한 혈행 개선에 유의성이 있는 다른 한의학적 본초 및 자연소재와의 배합을 통한 입욕제 개발 등의 가능성도 제시할 수 있다. 추후 임상 연구 등 동물 모델로서의 한계를 극복할 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 혈행 개선에 유의성이 있는 다른 한의학적 본초 및 자연소재와의 배합을 통한 입욕제 개발 등의 가능성도 제시할 수 있다. 추후 임상 연구 등 동물 모델로서의 한계를 극복할 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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