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문제 정의
- , 2014) 고산된 소나무에는 다양한 진균류가 자라므로 재선충들은 이들을 먹이로 이용하기 위해서는 GaLectin의 발현과 분비가 필요할 것이다. 본 연구에서는 GaLectin의 분비되는 형태와 가장 비슷한 단백질을 항원으로 하여 PWN감염 소나무추출물과 PWN 단백질 추출물에 반응하는 10개 이상의 Mab분비 세포 주를 확보하였고, 그들의 특이성을 알아냈다. 그러므로, 본 연구에서 확보한 Mab들은 PWN감염 소나무를 알아내는데 사용될 수 있는 신속진단키트의 제작과 PWN과 다른 비병원성 선충을 분별하는데 사용될 수 있는 신속진단키트의 제작에 활용될 수 있을 것이다.
- , 2011). 본 연구에서는 PWN 감염목의 진단에 활용을 할 수 있는 Mab를 제작하기 위하여 PWN이 소나무에 침입하고 증식할 때 분비할 것으로 예측되는 GaLectin을 Baculovirus 발현 체계를 이용하여 발현, 정제, 농축을 진행 하였다(Fig. 1). pBacPAK8-GaLectin plasmid로 형질 전환되기 전의 Sf9세포와 비교해서 형질 전환된 Sf9 세포의 경우 2일 후부터 33 kDa 크기의 밴드가 명확하게 관찰이 되었다.
제안 방법
- Mab 세포 주를 확립하기 위하여 우리는 위에 선별된 14개의 fusion hybridoma cell lines에 대한 limited dilution을 수행하여 하나의 세포 주를 96 well 중 30~70%의 well만이 하나 이상의 세포를 가지고 있게 분주를 한 후 배양했다. 96 well plate에서 Mab를 포함하고 있는 배양액을 회수 하여 우선 표준 PWN 감염 소나무 PBS추출물과 표준 건전 소나무 PBS 추출물을 이용하여 ELISA를 수행한 후에 보정된 반응성을 계산하여 높은 반응성을 보이는 세포 주들을 확인했다.
- BacPAK™ Baculovirus Expression System (Clontech, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 제조사의 방법을 따라 발현했다.
- Normalized immunoreactivity of limiting-diluted fusion hydridoma cell lines. (A–N) Fourteen fusion hybridoma cell lines were limiting-diluted and screened for identifying the monoclonal hydridoma lines secreting monoclonal antibodies (Mabs) for higher immunoreactivity to the standard PWN-infected pine tree PBS extract than the standard normal pine tree PBS extracts.
- PWN GaLectin의 signal peptide를 제외한 분비되는 단백질의 cDNA를 정방향 primer (5’-GAATCTAGAATGACTGAGGAAAAGAAAACTTACAC-3’)와 역방향 primer (5’- CTTGGTACCATGGATCTGGATGCCAGTGATC-3’)를 이용하여 834 bp PCR산물을 증폭을 한 후, pBacPAK8 발현 vector(Clontech, Palo Alto, CA, USA)에 cloning을 하였다. GaLectin 유전자를 포함하는 pBacPAK8-GaLectin plasmid를 내재하는 E. coli를 선별하여 배양을 한 후, plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 pBacPAK8-GaLectin plasmid를 확보하였다.
- Mab 세포 주를 확립하기 위하여 우리는 위에 선별된 14개의 fusion hybridoma cell lines에 대한 limited dilution을 수행하여 하나의 세포 주를 96 well 중 30~70%의 well만이 하나 이상의 세포를 가지고 있게 분주를 한 후 배양했다. 96 well plate에서 Mab를 포함하고 있는 배양액을 회수 하여 우선 표준 PWN 감염 소나무 PBS추출물과 표준 건전 소나무 PBS 추출물을 이용하여 ELISA를 수행한 후에 보정된 반응성을 계산하여 높은 반응성을 보이는 세포 주들을 확인했다.
- PWN GaLectin의 signal peptide를 제외한 분비되는 단백질의 cDNA를 정방향 primer (5’-GAATCTAGAATGACTGAGGAAAAGAAAACTTACAC-3’)와 역방향 primer (5’- CTTGGTACCATGGATCTGGATGCCAGTGATC-3’)를 이용하여 834 bp PCR산물을 증폭을 한 후, pBacPAK8 발현 vector(Clontech, Palo Alto, CA, USA)에 cloning을 하였다.
- PWN RIPA추출물에 높은 반응성을 보이는 Mab분비 단클론 항체 세포 주를 확립하기 위하여 각각의 limited dilution된 Mab분비세포들에 대한 보정된 반응성을 아래 계산식을 이용하여 산출했다.
- (2017)에서 보고한 소나무들과 추출방법을 사용했다. 간단히 설명을 하면, 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS, pH 7.2, 0.01 M Na2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)를 이용하여 77개의 PWN 감염 소나무와 22개의 건전소나무의 목편에서 단백질들을 포함한 다양한 수용성물질을 추출했다. 77개의 PWN 감염 소나무 PBS추출액을 합쳐 표준 PWN감염 소나무 PBS추출물로 사용을 하였고 22개의 정상 소나무 PBS 추출액을 합쳐서 표준 정상 소나무 PBS추출물로 사용을 하였다.
- 0 × 104 cells/ml 단위의 Sf9 cell을 접종하여 30분간 안착시켰다. 그리고, pBacPAK8-GaLectin plasmid DNA와 pBacPAK6 viral DNA와 Bacfectin (Clonetech)을 혼합한 후 25℃에서 15분간 유지한 후, Sf9 cell의 형질전환을 위하여 안정화된 Sf9 cell들에 2개의 DNA들과 Bacfectin혼합물을 접종한 후 25℃에서 5시간동안 1차 배양했다. 그 후 10%FBS가 첨가된 TC-100 media 1 ml을 추가 접종 한 후 5~7일 동안 27℃세포배양기에서 배양했다.
- 배양된 세포는 부유상태로 만들어 회수를 한 후 3,300 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전된 cells을 Lysis buffer에 녹여 Branson Sonifier (Branson Sonifier, Danbury, CT, USA)로 세포를 파괴하고 12,000 × g에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수했다. 발현된 GaLectin의 정제는 AKTAprime plus (GEHealthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 HisTrap HP column (GEHealthcare)을 이용하여 정제했다. 단백질 용출 시 피크가 나타나는 분획을 모은 후에 Amicon Ultra Centrifugal filter tube(Merck Millipore, Temecular, CA, USA)를 이용하여 농축했다.
- , 1994). 본 연구에서는 PWN의 GaLectin에 대한 단클론 항체 라이브러리를 제작한 후, 표준 PWN 감염 소나무 phosphate buffered saline (PBS) 추출물과PWN단백질 추출물에 높은 반응을 보이는 Mab분비 세포 주를 발굴하고 확립했다.
- 표준 PWN 감염 소나무 PBS추출물에 높은 반응성을 가지는 Mab분비 단클론 세포 주를 확립하기 위하여 각각의 limited dilution된 Mab분비세포들에 대한 보정된 반응성(normalized reactivity)을 아래 계산식을 이용하여 산출했다.
- 표준 PWN 감염목 PBS추출물과 PWN RIPA추출물을 각각 coating 용액에 썩어서 농도를 보정한 후, 위에 언급된 방법으로 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정했다. 흡광도가 높은 12개의 fusion hybridoma 세포 주들과 흡광도가 0이거나 매 낮은 2개의 fusion hybridoma세포 주들을 선별했다.
대상 데이터
- 7 mM KCl)를 이용하여 77개의 PWN 감염 소나무와 22개의 건전소나무의 목편에서 단백질들을 포함한 다양한 수용성물질을 추출했다. 77개의 PWN 감염 소나무 PBS추출액을 합쳐 표준 PWN감염 소나무 PBS추출물로 사용을 하였고 22개의 정상 소나무 PBS 추출액을 합쳐서 표준 정상 소나무 PBS추출물로 사용을 하였다.
- 우리는 총 1,464개의 fusion hybridoma cell line들이 분비하는 Mab들의 항원인 GaLectin에 대한 반응성을 검색하여 상위 62개의 세포 주를 선별했다(미보고 자료). 선별된 62개의 세포주의 Mab들을 표준 PWN 감염목 PBS추출물 또는 PWN PBS 추출물을 이용하여 이들에 대해서 높은 특이적인 반응성을 보이는 fusion hybridoma 세포 주 12개와 전혀 반응성이 없거나 낮은 세포 주 2개를 대조군으로 선별하여 사용 하였다(Fig. 2). 선별된 14개의 fusion hybridoma cell line중 3G11, 2D1, 4A4, 4B12, 15D6, 16F6, 12G4, 8H5 등 총 9개의 세포 주는 표준 PWN 감염목 PBS추출물에 높은 반응성을, 9A9세포주는 PWN PBS 추출물에 높은 반응성을, 그리고 14G4와 16D7의 경우는 두 가지 항원에 비슷한 정도의 반응성을 보였다(Fig.
- 우리는 총 1,464개의 fusion hybridoma cell line들이 분비하는 Mab들의 항원인 GaLectin에 대한 반응성을 검색하여 상위 62개의 세포 주를 선별했다(미보고 자료). 선별된 62개의 세포주의 Mab들을 표준 PWN 감염목 PBS추출물 또는 PWN PBS 추출물을 이용하여 이들에 대해서 높은 특이적인 반응성을 보이는 fusion hybridoma 세포 주 12개와 전혀 반응성이 없거나 낮은 세포 주 2개를 대조군으로 선별하여 사용 하였다(Fig.
- , 2011). 총 4마리의 Balb/C 생쥐에 항원을 주사한 후에 총 1,464개의 fusion hybridoma cell lines을 제작한 후, 항원을 이용하여 enzyme Linked Immunosorbent assay (ELISA)를 수행하여 항원에 대한 반응성이 높은 62개의 세포 주를 선별했다(미보고 자료).
- 표준 PWN 감염목 PBS추출물과 PWN RIPA추출물을 각각 coating 용액에 썩어서 농도를 보정한 후, 위에 언급된 방법으로 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정했다. 흡광도가 높은 12개의 fusion hybridoma 세포 주들과 흡광도가 0이거나 매 낮은 2개의 fusion hybridoma세포 주들을 선별했다.
이론/모형
- Kim et al. (2017)에서 보고한 소나무들과 추출방법을 사용했다. 간단히 설명을 하면, 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS, pH 7.
- Louis, MO, USA)를 이용하여 균질화 시킨 후, 상층액을 침전물에서 분리하기 위하여 냉장된 원심분리기를 이용 13,000 rpm에서 15분간 회전시켰다. 상층액의 단백질 농도를 BCA방법(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 정량을 한 후 10 ng/ml의 농도로 ELSIA의 항원으로 사용 했다.
성능/효과
- 2). 선별된 14개의 fusion hybridoma cell line중 3G11, 2D1, 4A4, 4B12, 15D6, 16F6, 12G4, 8H5 등 총 9개의 세포 주는 표준 PWN 감염목 PBS추출물에 높은 반응성을, 9A9세포주는 PWN PBS 추출물에 높은 반응성을, 그리고 14G4와 16D7의 경우는 두 가지 항원에 비슷한 정도의 반응성을 보였다(Fig. 2). 그리고 2B7과 12D2의 경우는 반응성이 없거나 낮은 대조군 세포 주로 이용을 하였다.
- 그리고 동일한 fusion hybridoma 세포 주에서 limited diluted된 Mab세포 주 간에도 2가지 물질들에 대한 반응성의 차이가 크게 존재를 하고 있었다. 이 결과는 fusion hybridoma 세포 주들은 다른 epitope를 인식하는 Mab 분비세포들이 2개 이상 썩여 있는 다 클론 상태임을 말해 주고 있다.
후속연구
- 본 연구에서는 GaLectin의 분비되는 형태와 가장 비슷한 단백질을 항원으로 하여 PWN감염 소나무추출물과 PWN 단백질 추출물에 반응하는 10개 이상의 Mab분비 세포 주를 확보하였고, 그들의 특이성을 알아냈다. 그러므로, 본 연구에서 확보한 Mab들은 PWN감염 소나무를 알아내는데 사용될 수 있는 신속진단키트의 제작과 PWN과 다른 비병원성 선충을 분별하는데 사용될 수 있는 신속진단키트의 제작에 활용될 수 있을 것이다. 그리고, 향 후 이들을 활용할 실용화 연구는 현재까지 없었던신속진단키트의 제작을 가능케 할 것으로 사료된다.
- 그러므로, 본 연구에서 확보한 Mab들은 PWN감염 소나무를 알아내는데 사용될 수 있는 신속진단키트의 제작과 PWN과 다른 비병원성 선충을 분별하는데 사용될 수 있는 신속진단키트의 제작에 활용될 수 있을 것이다. 그리고, 향 후 이들을 활용할 실용화 연구는 현재까지 없었던신속진단키트의 제작을 가능케 할 것으로 사료된다.
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