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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 층간반응성이 우수한 팽윤성 점토의 층간에 스쿠티카 살충효과가 있는 알파-피넨을 층간삽입시킨 나노복합체를 형성하여 유효 성분이 해수에서도 안정적인 상태로 지속적으로 용출될 수 있는 약욕제제를 개발하고자 하였다. 이를 위해 출발점토인 몬트모릴로나이트(montmorillonite, Mont) 계열 점토와 이를 친유성으로 개질해주는 양이온성 계면활성제인 4급 암모늄, 알파-피넨을 사용하여 항스쿠티카 약욕제제를 개발하였고 이로부터 알파-피넨이 해수로 어느 정도로 용출되는지, 알파-피넨이 용출된 해수가 실제로 스쿠티카 살충효과를 보이는지에 대하여 확인하였다.
- 알파-피넨을 함유한 나노복합체 점토화합물을 제작하고자 하였다. 출발점토로는 층상형 무기담체이면서 팽윤성 점토인 Mont 중에서 Na-montmorillonite (Kunipia-G, Kunimine Industry Co.
제안 방법
- 8% (W/V, wt% suspension)로 농도로 진행하였다. 12시간마다 전체적으로 잘 혼합된 용출해수 일부를 분취하고 전체 해수의 50%를 새로운 멸균해수로 물갈이해주었다. 채수된 용출액은 유기용매를 첨가한 뒤 GC-Mass로 여과 및 분석하여 알파-피넨의 농도를 측정하였다.
- 300 L 수조에 250 L의 해수를 채우고 넙치(체장 12±2 cm; 체중 30±10 g)를 50마리씩 수조마다 분배하여 넣어 1주일간 순치하였다.
- 7 μm의 파라핀 조직절편을 제작하여 hematoxylin & eosin 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- Cu-Kα 방사선(사선=1.54056 Å)을 사용하는 MAC Science M03XHF 회절계로 몬트모릴로나이트, CTAB-몬트모릴로나이트, 알파-피넨-점토 나노복합체 분말에 대한 X선 회절(X-ray diffraction, XRD) 양상을 측정하여 물질 내 층상 간의 거리를 확인하였다.
- 고상반응법(solid state reaction method)으로 팽윤성이 우수한 Mont와 유기층간개질제인 CTAB 간의 층간삽입 반응을 유도하면서 알파-피넨을 혼합하여 점토와의 복합체가 형성되도록 하였다. 먼저 Mont 와 CTAB의 중량비 기준 6.
- 300 L 수조에 250 L의 해수를 채우고 넙치(체장 12±2 cm; 체중 30±10 g)를 50마리씩 수조마다 분배하여 넣어 1주일간 순치하였다. 넙치 수조에는 알파-피넨-점토 나노복합체 과립을 해수량 대비 0.1, 0.3% (W/V)가 되도록 첨가하였다. 해수 용량의 50%를 12시간 마다 물갈이 하였고 펌프를 사용하여 수조 내 물이 순환되도록 하였다.
- 고상반응법(solid state reaction method)으로 팽윤성이 우수한 Mont와 유기층간개질제인 CTAB 간의 층간삽입 반응을 유도하면서 알파-피넨을 혼합하여 점토와의 복합체가 형성되도록 하였다. 먼저 Mont 와 CTAB의 중량비 기준 6.5:2.5로 혼합하였고 이를 마노 막자 사발에서 30분간 완전히 빻은 후 100℃에서 1시간 동안 열처리하였다. 그 다음, CTAB-Mont와 알파-피넨을 중량비 기준 8:2로 혼합하여 상온에서 30분동안 막자로 갈아주었다.
- 물갈이 전마다 3마리 넙치를 채집하여 아가미 색상을 확인한 뒤 적출된 아가미 조직을 Bouin’s fluid 고정액에서 24시간 동안 고정한 후 에틸알코올 탈수 과정을 거처 파라핀으로 포매하였다.
- 스쿠티카 배양액(1.5×104cells/mL) 150 μL와 알파-피넨-점토 나노복합체 용출해수 50 μL를 혼합하여 스쿠티카의 운동성과 형태적 변화를 확인하였고 이때 멸균된 해수를 대조군으로 비교하였다.
- 2007에 제시된 방법에 따라 스쿠티카의 운동성과 형태적 변화를 확인하였다. 알파-피넨(Aldrich, USA, 98%)은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 희석하여 스쿠티카 배양액과의 최종농도가 5, 10, 20, 40, 80, 100 ppm이 되도록 처리하였으며 10, 30, 60, 90, 120분 동안 알파-피넨의 살충효능을 확인하였다. 대조군으로는 DMSO과 포르말린 50 ppm을 처리하였다.
- 알파-피넨-점토 나노복합체를 해수에 처리하였을 때 넙치에게 독성이 있는지 확인하였다. 넙치가 수조에 가라앉은 나노복합체 과립과 떨어져 있었던 초반을 제외하고는 실험기간 동안 넙치의 행동변화나 폐사는 없었다.
- 알파-피넨의 항스쿠티카 활성 유효농도를 먼저 확인해보기 위하여 0-100 ppm 농도로 스쿠티카 배양액에 알파-피넨을 처리하였다. 알파-피넨을 5-10 ppm으로 처리하였을 때 처리 30분부터 스쿠티카의 약 50%가 원형 또는 불규칙적인 모양으로 변화하였으며 세포 중 약 50%가 사멸되고 비정상적인 운동성을 보였고 처리 120분 후에는 원형모양의 생존한 스쿠티카 개체를 제외하고는 대부분 사멸하였다.
- 알파-피넨이 용출된 해수를 직접 스쿠티카에 처리하였을 때 살충효과가 있는지 확인하였다(Fig. 3). 먼저 0.
- 5×104cells/mL) 150 μL와 알파-피넨-점토 나노복합체 용출해수 50 μL를 혼합하여 스쿠티카의 운동성과 형태적 변화를 확인하였고 이때 멸균된 해수를 대조군으로 비교하였다. 용출해수을 처리한 후 10, 30, 60, 90 분 동안의 스쿠티카 살충효능을 확인하였다.
- 알파-피넨-나노복합체 분말은 자동정제기를 사용하여 평균지름이 5 mm의 구형체가 되도록 과립화하였다. 이때 나노복합체의 점토가 결합체 역할을 하기 때문에 추가적인 결합체를 사용하지 않고 과립화를 진행하였다.
- 알파-피넨-점토 나노복합체 과립으로부터 해수로의 용출량을 분석하기 위해 과립을 멸균된 해수 500 mL에 첨가하여 20℃, 160 rotation per minute (rpm) 조건에서 진탕 교반하였다. 이때 용출해수에 대한 항스쿠티카 효능 평가를 같이 진행하기 위하여 과립의 해수 첨가량은 0.4, 1.2, 3.6, 10.8% (W/V, wt% suspension)로 농도로 진행하였다. 12시간마다 전체적으로 잘 혼합된 용출해수 일부를 분취하고 전체 해수의 50%를 새로운 멸균해수로 물갈이해주었다.
- 따라서 본 연구에서는 층간반응성이 우수한 팽윤성 점토의 층간에 스쿠티카 살충효과가 있는 알파-피넨을 층간삽입시킨 나노복합체를 형성하여 유효 성분이 해수에서도 안정적인 상태로 지속적으로 용출될 수 있는 약욕제제를 개발하고자 하였다. 이를 위해 출발점토인 몬트모릴로나이트(montmorillonite, Mont) 계열 점토와 이를 친유성으로 개질해주는 양이온성 계면활성제인 4급 암모늄, 알파-피넨을 사용하여 항스쿠티카 약욕제제를 개발하였고 이로부터 알파-피넨이 해수로 어느 정도로 용출되는지, 알파-피넨이 용출된 해수가 실제로 스쿠티카 살충효과를 보이는지에 대하여 확인하였다.
- 앞서 실험에서 확인하였듯이 유효농도의 알파-피넨이 항스쿠티카 효과를 보이기 위해서는 최소 10-30분이상의 시간이 필요하므로 이를 지속적으로 스쿠티카에 노출시킬 수 있는 방법이 필요하다. 이를 위해 친수성 점토를 이용하여 유효농동의 알파-피넨을 지속적으로 방출시킬 수 있는 방안을 모색하였다.
- 이번 연구에서는 알파-피넨의 나노화를 통해 알파-피넨이 양식장 사육수로 녹아들어가는 속도를 조절하고자 전달담체인 천연 점토 내로 양이온 계면활성제를 사용하여 소수성인 알파-피넨을 효과적으로 삽입시킨 약욕제제를 개발하였다. 이는 스쿠티카 구제를 위해 포르말린을 1시간 동안 약욕 시키는 개념이 아닌 양식장 수조 내에 알파-피넨-점토 나노복합체를 놓아두고 효능을 유지할 정도의 낮은 농도를 꾸준히 사육수에 용출되게 하여 1-2주간 사용 후에 수조에서 나노복합체를 건져내어 약욕으로 인한 어류의 독성 피해와 양어장 노동력을 최소화할 수 있도록 고안된 방법이다.
- 12시간마다 전체적으로 잘 혼합된 용출해수 일부를 분취하고 전체 해수의 50%를 새로운 멸균해수로 물갈이해주었다. 채수된 용출액은 유기용매를 첨가한 뒤 GC-Mass로 여과 및 분석하여 알파-피넨의 농도를 측정하였다. 용출 실험은 10일동안 진행하였다.
- 3% (W/V)가 되도록 첨가하였다. 해수 용량의 50%를 12시간 마다 물갈이 하였고 펌프를 사용하여 수조 내 물이 순환되도록 하였다. 수온은 18℃로 유지하여 약 8일간 실험하였다.
- 해수로 인한 스트레스를 줄이고자 스쿠티카 배양액과 용출해수를 3:1로 혼합하여 살충효과를 확인하였다. 스쿠티카 배양액(1.
대상 데이터
- 어류주화세포인 chinook salmon embryo-214 (CHSE-214)를 minimun essential medium (MEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA) 및 penicillin (Gibco, USA) 100 unit과 streptomycin (Gibco, USA) 100 μg/mL농도로 참가한 배양액에서 배양온도를 20℃로 맞추어 배양하였다.
- /100g으로 알파-피넨을 효과적으로 흡착할 수 있을 것이라 판단하였다. 점토의 친수성을 친유성으로 개질해주는 양이온 계면활성제로 4급 알킬암모늄(alkylammonium)의 일종인 세틸트리메틸암모늄 브로마이드[cetylrimethylammonium bromide, CTAB; (CH3)3N(CH2)15CH3Br,80 wt% in methanol, Sunjin Chem. Co.]를 사용하였다. 알파피넨은 추가적인 정제과정 없이 사용하였다.
- 알파-피넨을 함유한 나노복합체 점토화합물을 제작하고자 하였다. 출발점토로는 층상형 무기담체이면서 팽윤성 점토인 Mont 중에서 Na-montmorillonite (Kunipia-G, Kunimine Industry Co. ltd, Japan)를 사용하였다. 이 점토의 구조식은 Na0.
이론/모형
- 스쿠티카 배양액 950 μL와 알파-피넨 희석액 50 μL를 혼합하여 Jin et al. 2007에 제시된 방법에 따라 스쿠티카의 운동성과 형태적 변화를 확인하였다.
성능/효과
- 12-132시간 용출해수와의 반응시 30분 이내에 스쿠티카가 모두 사멸하였고 144-180시간 용출해수를 처리하였을 때 전체가 사멸되기까지 30-60분, 192 시간부터는 사멸되기까지 60분 이상이 소요되었다. 1.2% 용출해수 실험구에서는 시간별 용출해수와의 반응 10분부터 30분 내에 스쿠티카의 운동성이 저하되고 형태가 변화되면서 모두 사멸하였다. 3.
- 2% 용출해수 실험구에서는 시간별 용출해수와의 반응 10분부터 30분 내에 스쿠티카의 운동성이 저하되고 형태가 변화되면서 모두 사멸하였다. 3.6, 10.8% 용출해수 실험구에서는 반응 10분 내에 모든 스쿠티카의 형태가 둥그렇게 변하면서 모두 사멸하였다. 해수에 따른 스트레스를 최소화하기 위하여 스쿠티카 배양액과 용출해수를 3:1로 반응시킨 것을 감안할 때 알파-피넨-점토 나노복합체 과립이 해수에0.
- 제작된 알파-피넨-점토 나노복합체로부터 알파-피넨이 해수로 얼마나 용출되는지 측정하였을 때 해수에 첨가된 과립의 양에 따라 용출되는 알파-피넨의 양은 차이가 있지만 꾸준히 해수에 용출되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 또한 용출기간 동안 과립의 형태가 파괴가 부스러짐 없이 안정한 과립체가 유지되었다.
- 4 Å로 확장되었다. 즉, 알파-피넨 분자가 van der Waals 상호작용의 의해 CTAB 분자들 사이로 흡착되면서 평행하게 배열되어 있던 CTAB 분자가 수직의 가까운 형태의 배열로 전환됨을 의미한다. 알파-피넨-점토 나노복합체에서 관찰된 30.
- 80-100 ppm에서는 처리 10분 이내에 모든 개체가 사멸된 것을 확인하였다. 포르말린 50 ppm처리 10분 이내에 스쿠티카 형태가 원형으로 모두 고정되었고 60분 후부터 세포가 터지면서 사멸되는 것을 확인하였다. DMSO의 경우 처리 30분 후부터 스쿠티카 운동성이 다소 저하되고 형태가 조금 변형되었으나 사멸은 확인되지 않았다.
- 8% 용출해수 실험구에서는 반응 10분 내에 모든 스쿠티카의 형태가 둥그렇게 변하면서 모두 사멸하였다. 해수에 따른 스트레스를 최소화하기 위하여 스쿠티카 배양액과 용출해수를 3:1로 반응시킨 것을 감안할 때 알파-피넨-점토 나노복합체 과립이 해수에0.1-0.3% 정도만 첨가되어도 10일 동안은 스쿠티카를 충분히 사멸시킬 수 있을 것이라 생각된다.
- 넙치가 수조에 가라앉은 나노복합체 과립과 떨어져 있었던 초반을 제외하고는 실험기간 동안 넙치의 행동변화나 폐사는 없었다. 환수 전마다 과립의 형태 및 넙치의 상태를 확인하였을 때 과립은 붕해되지 않았고 피부와 아가미의 색상에도 변화는 없었으며 전체적으로 양호하였다. 아가미의 병리조직학적 변화를 관찰하였을 때 대조군에서는 발견되지 않은 이상소견이 0.
후속연구
- 또한 용출기간 동안 과립의 형태가 파괴가 부스러짐 없이 안정한 과립체가 유지되었다. CTAB-Mont 복합체가 알파-피넨을 효과적으로 흡착하고 있고 지속적으로 활성성분을 용출시킨다는 점에서 양식산업에서도 스쿠티카 살충제로써 충분히 활용할 수 있을 것이라 기대된다. 또한 과립의 투입량에 따라 용출되는 알파-피넨의 농도를 조절 할 수 있을 것이라 판단된다.
- 이는 스쿠티카 구제를 위해 포르말린을 1시간 동안 약욕 시키는 개념이 아닌 양식장 수조 내에 알파-피넨-점토 나노복합체를 놓아두고 효능을 유지할 정도의 낮은 농도를 꾸준히 사육수에 용출되게 하여 1-2주간 사용 후에 수조에서 나노복합체를 건져내어 약욕으로 인한 어류의 독성 피해와 양어장 노동력을 최소화할 수 있도록 고안된 방법이다. 개발된 알파-피넨-점토 나노복합체를 스쿠티카가 발생된 양식 현장에 사용된다면 지속적인 스쿠티카 살충 효과를 보일 것으로 기대된다.
- 이는 알파-피넨-점토 나노복합체으로부터 유발된 것으로 보이지 않으며 개체의 건강도에 따른 차이로 생각된다. 넙치에 있어 0.1, 0.3% 농도는 큰 독성이 없는 것으로 보이나 장기적으로 어떠한 변화가 있을지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다.
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