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문제 정의
- , 2013; 2014), 출하 단계에서는 넙치 크기가 1 kg 전후로, 개체를 검사에 사용할 경우 실험어의 희생이 동반되어 상품 가치가 없어지므로 경제적으로 손실을 가져올 수 밖에 없다. 그러므로 본 연구에서는, 사육 단계에서 실험어를 죽이지 않고, 보다 간편하게 근육을 채취하여 쿠도아 검사에 사용할 수 있는 방법을 사용하여 근육 채취 방법에 따른 쿠도아 진단의 효율성을 검토하였다.
- , 2013; 2014), 이를 위해서는 실험어의 희생이 동반되어 출하 크기의 넙치를 사용할 경우에는 검사어의 상품 가치 하락으로 인한 경제적인 손실을 초래할 수 밖에 없었다. 그러므로, 본 연구에서는 출하 크기의 양식 넙치에 대한 K. septempunctata의 감염 조사를 위해 넙치를 죽이지 않고 근육을 채취하여 검사하는 방법에 대한 실효성을 검토하였다.
- , 1997). 본 연구에서의 PPM 방법을 사용한 쿠도아 검사법은 사육 과정 또는 출하 단계의 넙치를 죽이지 않고 넙치의 가식부위 근육을 사용하여 쿠도아 검사가 가능하므로 현장에서 매우 유용하게 사용될 수 있는 방법임을 제안한다. 이러한 결과로부터, PPM 방법을 사용하여 넙치를 죽이지 않고 상품 가치를 훼손하지 않으며 근육 샘플 채취가 가능하므로, 양식장에서 넙치를 사육하는 동안 지속적인 쿠도아의 감염 모니터링에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
제안 방법
- K. septempunctata가 감염된 넙치가 식품으로 출하되는 것을 사전에 방지하기 위하여, 쿠도아 자율관리지침에 따라 넙치의 양성·출하 단계에서 기생충의 감염 모니터링 조사를 하도록 권고하고 있으며, 양성 단계의 넙치의 경우 사육 로트별 60마리 이상, 출하 단계의 경우 사육 로트별 30마리 이상 검사를 기본 원칙으로 한다.
- (qPCR)와conventional polymerase chain reaction (PCR) 분석을 위한 DNA 분리에 사용하였고, 10 μL를 현미경 관찰에 의한 기생충의 포자를 확인하는 데 사용하였다.
- 균질화 된 용액 100 μL (근육 20 mg에 해당)를 qPCR와 PCR 분석을 위한 DNA 분리에 사용하였고, 10 μL를현미경 관찰에 의한 기생충의 포자를 확인하는 데 사용하였다.
- PPM 방법에 의한 효과적인 근육 채취 부위를 결정하기 위하여, K. septempunctata에 감염 된 넙치 2마리의 등근육에서의 부위별 쿠도아 감염 분포를 조사하였다. 넙치 등근육을 6개 point로 나누어 각 point마다 PPM 방법으로 근육을 6회 채취하였다(Fig.
- septempunctata에 감염 된 넙치 2마리의 등근육에서의 부위별 쿠도아 감염 분포를 조사하였다. 넙치 등근육을 6개 point로 나누어 각 point마다 PPM 방법으로 근육을 6회 채취하였다(Fig. 2). 각 point당 3회 채취한 근육은 유전자 분석(qPCR, conventional PCR)에 triplicate로 사용하였으며, 나머지 3회 채취한 근육은 현미경 관찰에 의한 포자 계수에 각각 사용하였다.
- 2). 각 point당 3회 채취한 근육은 유전자 분석(qPCR, conventional PCR)에 triplicate로 사용하였으며, 나머지 3회 채취한 근육은 현미경 관찰에 의한 포자 계수에 각각 사용하였다.
- PPM 방법의 현장 적용 가능성을 실험하기 위하여, 넙치 양식장에 사육중인 넙치 100마리(평균 500 g)를 실험에 적용하였다. PPM 방법에 의한 근육 채취를 위해 사육중인 넙치에 스트레스를 가하지 않도록 부드럽게 채포한 후 즉시 MS-222(Sigma, Germany)를 사용하여 마취하였다. 마취한 어류는 폴리스티렌 보드 위에서 plastic syringe-style MK7 implanter (Biomark, USA)를 사용하여 꼬리 부위 근육을 수직으로 관통 시켜 근육을 채취한 후, 다시 사육수조에 넣어 사육하면서 한달간 생존 여부를 관찰하였다.
- 각 실험 항목으로부터 마쇄하여 준비한 근육 시료 100 µL (근육 20mg에 해당)로부터 DNA를 추출하여 쿠도아의 유전자 분석(qPCR, PCR)에 사용하였다.
- 사육 넙치에 대한 PPM 방법의 적용(재료 및 방법 3)을 위한 실험을 위해, PPM에 의해 채취한 근육을 slide glass 두 장 사이에 끼워 압착하여 근육을 얇게 편 후, Loffler’s methylene blue solution을 떨어뜨리고 1분 후 현미경으로 관찰하여 포자의 검출 유무를 확인하였다.
- PCR 산물은 ethidium bromide가 첨가 된 1.5% agarose gel에 전기영동 한 후 MultiImage ® II (Alphainnotech, USA)로 PCR 산물의 증폭(target size 356 bp)을 확인하였다.
- 추출한4 µL template와 위의 primer를 AccuPower® PCR premix (Bioneer, Korea)와 혼합하여 20 µL의 반응액에서 PCR을 수행하였다.
- 2.5×107 (최종 108 농도), 2.5×105 (최종 106 농도), 2.5×103 (최종 104 농도), 2.5×101 (최종 102 농도) copies/µL의 농도로 plasmid를 단계 희석한 후 검량선을 작성하였으며, 모든 realtime PCR 반응에 plasmid positive control를 함께 반응하였다.
- PCR 반응액 제조는 넙치 근육 샘플로부터 채취한 DNA 4 µL 또는 plasmid positive control 4 µL, Taqman 2X Universal master mix II (AB, USA) 10 µL, forward와 reverse primer 각 0.4 µM, probe 0.25 M을 넣어 최종 20 µL의 volume이 되도록 제조하였다.
- 마취한 어류는 폴리스티렌 보드 위에서 plastic syringe-style MK7 implanter (Biomark, USA)를 사용하여 꼬리 부위 근육을 수직으로 관통 시켜 근육을 채취한 후, 다시 사육수조에 넣어 사육하면서 한달간 생존 여부를 관찰하였다. 채취한 근육은 냉장 상태로 실험실로 운반한 후, 쿠도아 감염 여부 진단(qPCR, PCR과 현미경 확인)에 사용하였다.
- 각 실험 항목으로부터 준비한 근육 시료로부터 추출한 DNA를 사용하여 K. septempunctata의 18S rDNA (AB553293) 를 검출하는 real-time PCR을 수행하였다. Primers와 probe 는 일본 후생노동성(MHLW, 2011) 방법에 따라 Kudoa-F (5’-CATGGGATTAGCCCGGTTTA-3’), Kudoa-R (5’-ACTCTCCCCAAAGCCGAAA-3’), Kudoa-P (5’-FAM-TCCAGGTTGGGCCCTCAGTGAAAA-TAMRA-3’)를 사용하였다.
- 25 M을 넣어 최종 20 µL의 volume이 되도록 제조하였다. PCR 반응은 95℃ 10분 1 cycle, 95℃ 15초와 60℃ 60초에서 45 cycles 반응하였으며 모든 샘플은 duplicate로 반응을 수행하였다. Plasmid positive control은 Song et al.
- Plasmid positive control은 Song et al.(2014) 에서 제작한 것을 사용하여 Nanodrop ND-1000 spectropho-tometer에서 DNA를 정량하고 plasmid copy수를 계산하였다. 2.
- 먼저, K. septempunctata 감염 모니터링 선행 연구를 통해 얻은 감염 넙치 5마리를 사용하여 기존에 사용 된 근육 채취 방법 인 등근육 전체로부터 근육을 채취하여 검사를 하는 ETM방법과, 넙치를 죽이지 않고도 가능한 부분적 근육채취 방법인 PPM 방법에 대하여 쿠도아 검출 효과를 비교하였다.
- 균질화 된 용액 100 µL ( 근육 20 mg에 해당)를 quantitative polymerase chain reaction 을 위한 DNA 분리에 사용하였고, 10 μL를 현미경 관찰에 의한 기생충의 포자를 확인하는 데 사용하였다.
- 쿠도아 감염 양성으로 판정 된 5마리의 넙치를 사용하여 PPM 과 ETM 방법에 의해 채취한 근육에서의 쿠도아 검출 효능을 비교하였다(Table 1).
- 각 실험 항목으로부터 채취한 근육 샘플을 TE buffer (Promega, USA)에 5배 희석 후 완전히 마쇄하여 Loffler’s methylene blue solution과 1:1로 혼합하여 cell-counting chamber에서 포자를 계수하여 근육 1 g당 포자수로 환산하였다.
- PPM 방법에 의한 근육 채취를 위해 사육중인 넙치에 스트레스를 가하지 않도록 부드럽게 채포한 후 즉시 MS-222(Sigma, Germany)를 사용하여 마취하였다. 마취한 어류는 폴리스티렌 보드 위에서 plastic syringe-style MK7 implanter (Biomark, USA)를 사용하여 꼬리 부위 근육을 수직으로 관통 시켜 근육을 채취한 후, 다시 사육수조에 넣어 사육하면서 한달간 생존 여부를 관찰하였다. 채취한 근육은 냉장 상태로 실험실로 운반한 후, 쿠도아 감염 여부 진단(qPCR, PCR과 현미경 확인)에 사용하였다.
대상 데이터
- 2013년도 우리 연구팀에서 수행한 쿠도아 감염 모니터링 조사를 위한 PCR 검사법에서 쿠도아 감염 양성으로 검출 된 넙치 성어 5마리(Table 1)를 획득하여 근육 채취 방법에 따른 K.septempunctata 검출 효과 비교 실험에 사용하였다.
- 넙치 성어로부터 PPM을 채취하기 위하여 바닥에 폴리스티렌 보드를 깔고 그 위에 넙치를 올려놓은 후 plastic syringe-style MK7 implanter (Biomark, USA)를 사용하여 등근육을 수직으로 관통시켜 needle내부에 근육을 채취하였다(Fig. 1). 한 번의 샘플 채취 시 20-25 mg의 근육이 채취되므로 2회 반복 채취하여 약 50 mg의 근육을 분석에 사용하였다.
- PPM 방법의 현장 적용 가능성을 실험하기 위하여, 넙치 양식장에 사육중인 넙치 100마리(평균 500 g)를 실험에 적용하였다. PPM 방법에 의한 근육 채취를 위해 사육중인 넙치에 스트레스를 가하지 않도록 부드럽게 채포한 후 즉시 MS-222(Sigma, Germany)를 사용하여 마취하였다.
이론/모형
- ETM 샘플의 채취는 선행 연구(Song et al., 2013)에 의한 방법에 따라 넙치 등근육 전체 부위를 해부용 칼로 긁어 근육 샘플 (1-5 g)을 채취하여 폴리스티렌 지퍼백에 넣어 골고루 마쇄하였다. 마쇄한 근육 200 mg를 멸균된 2mL tube containing 2 mm ziruconia and 5 mm stainless beads (WATSON)에 넣고, 1XTE buffer (Promega, USA)를 사용하여 5배 희석한 후, FastPrep®-24 (MP, USA)를 이용하여 20초간 분쇄하여 완전히 균질화하였다.
- DNA 추출 방법은 선행 연구인 Song et al. (2014)에 의한 방법에 따라 시판되는 QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Japan)를 사용하여 매뉴얼에 따라 추출하였으며, 최종적으로 200 µL의 volume으로 elusion하였다.
- Primers와 probe 는 일본 후생노동성(MHLW, 2011) 방법에 따라 Kudoa-F (5’-CATGGGATTAGCCCGGTTTA-3’), Kudoa-R (5’-ACTCTCCCCAAAGCCGAAA-3’), Kudoa-P (5’-FAM-TCCAGGTTGGGCCCTCAGTGAAAA-TAMRA-3’)를 사용하였다.
성능/효과
- 쿠도아 감염 양성으로 판정 된 5마리의 넙치를 사용하여 PPM 과 ETM 방법에 의해 채취한 근육에서의 쿠도아 검출 효능을 비교하였다(Table 1). qPCR 결과, 5마리의 넙치 중 4마리(넙치 1, 2, 3, 5번)에서 PPM과 ETM 샘플 모두 쿠도아 감염 양성 기준치(7.00 log rDNA copy no./g) 이상으로 검출되었다(PPM 샘플은 7.32-9.72 log rDNA copy no./g 검출, ETM 샘플은 7.77-9.56 log rDNA copy no./g 검출). 반면, 4번 넙치는 PPM과 ETM 모두 기준치 이하로 검출되어 두 실험의 결과가 일치 하였다.
- 반면, 4번 넙치는 PPM과 ETM 모두 기준치 이하로 검출되어 두 실험의 결과가 일치 하였다. PCR 결과, qPCR에서 감염 양성 기준치 이상으로 검출된 4마리(넙치 1, 2, 3, 5번)에서는 PPM과 ETM 샘플 모두 쿠도아 양성으로 검출되었으나, 4번 넙치는 PPM 샘플의 경우 음성, ETM 샘플의 경우 양성으로 검출되어 두 실험 결과가 불일치하였다. 현미경에 의한 쿠도아 포자 확인 결과, qPCR과 PCR실험 에서 양성으로 검출 된 4마리 넙치에서는 PPM과 ETM 샘플 모두 쿠도아 포자가 검출되었으나(4.
- PCR 결과, qPCR에서 감염 양성 기준치 이상으로 검출된 4마리(넙치 1, 2, 3, 5번)에서는 PPM과 ETM 샘플 모두 쿠도아 양성으로 검출되었으나, 4번 넙치는 PPM 샘플의 경우 음성, ETM 샘플의 경우 양성으로 검출되어 두 실험 결과가 불일치하였다. 현미경에 의한 쿠도아 포자 확인 결과, qPCR과 PCR실험 에서 양성으로 검출 된 4마리 넙치에서는 PPM과 ETM 샘플 모두 쿠도아 포자가 검출되었으나(4.98-6.48 log spore no./g), 4 번 넙치의 경우 두 방법에 의한 샘플 모두 현미경으로 포자가 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터, 유전자 검사의 결과 양성이며, 현미경으로 포자가 검출되는 수준으로 감염 된 넙치에서는, 쿠도아 검출을 위한 PPM 과 ETM 두 실험 방법의 결과가 일치함을 확인하였다.
- /g), 4 번 넙치의 경우 두 방법에 의한 샘플 모두 현미경으로 포자가 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터, 유전자 검사의 결과 양성이며, 현미경으로 포자가 검출되는 수준으로 감염 된 넙치에서는, 쿠도아 검출을 위한 PPM 과 ETM 두 실험 방법의 결과가 일치함을 확인하였다.
- 쿠도아 양성 넙치 2마리를 사용하여 등근육 부위별(Point 1-6) 쿠도아의 분포 조사를 위해 PPM방법으로 근육을 채취하여 분석한 결과, 1번 넙치에서는 6개 point의 샘플 모두에서 PCR 양성이었으며, qPCR 결과 모든 point에서(point 2의 1개 샘플 제외) 7.72-9.73 log rDNA copy no./g의 범위로 검출되어 쿠도아 유전자 검출 양성이었다.
- /g의 범위로 검출되어 쿠도아 유전자 검출 양성이었다. 또한, 현미경으로 포자 확인 결과 6개point의 샘플 모두에서 쿠도아 포자가 5.06-6.59 log spores/g범위로 검출되어 쿠도아가 등근육 전체에 고르게 분포함을 확인하였다. 반면, 2번 넙치의 경우 등근육 부위별 쿠도아 분포에 차이가 나타났는데, point 1에서는 3샘플(triplicates) 모두 PCR 음성이었으며, point 2에서는 3샘플 중 1개, point 2에서는 3샘플 중 2개에서 PCR 양성으로 검출되었으며, point 4-6에서는 모든 샘플에서 PCR 양성으로 검출되었다.
- 현미경 검사 결과 모든 샘플에서 쿠도아가 검출되지 않았다(Table 2). 이상의 결과로부터, 쿠도아 포자가 검출되는 수준의 감염 단계에 서는 근육의 6개 point에서 쿠도아가 동일한 수준으로 검출되는 것을 확인하였다.
- 양식장에 사육중인 넙치 100마리(평균 전중500g)에 대하여 꼬리 근육 부분에서 PPM 방법에 의한 근육 채취 후, 한달 간 사육한 결과 폐사가 발생하지 않아(data not shown) 넙치를 죽이지 않고 살아있는 상태에서 근육 채취 방법의 가능성을 입증하였다. 100마리 넙치에 대한 쿠도아 감염 조사 결과, 7마리의 넙치에서 모든 실험 방법(PCR, qPCR, 현미경 검사)에서 쿠도아 감염 양성으로 나타났으며, 4마리의 넙치에서 PCR과 qPCR에 의한 쿠도아 양성, 1마리의 넙치에서 PCR에 의한 쿠도아 양성 판정을 받았다(Table 3).
- 양식장에 사육중인 넙치 100마리(평균 전중500g)에 대하여 꼬리 근육 부분에서 PPM 방법에 의한 근육 채취 후, 한달 간 사육한 결과 폐사가 발생하지 않아(data not shown) 넙치를 죽이지 않고 살아있는 상태에서 근육 채취 방법의 가능성을 입증하였다. 100마리 넙치에 대한 쿠도아 감염 조사 결과, 7마리의 넙치에서 모든 실험 방법(PCR, qPCR, 현미경 검사)에서 쿠도아 감염 양성으로 나타났으며, 4마리의 넙치에서 PCR과 qPCR에 의한 쿠도아 양성, 1마리의 넙치에서 PCR에 의한 쿠도아 양성 판정을 받았다(Table 3). 이러한 결과로부터, PPM 방법을 사용 하여 넙치의 상품 가치를 훼손하지 않으면서 살아있는 넙치에서 효율적으로 쿠도아 감염 여부 확인이 가능함을 확인하였다.
- 100마리 넙치에 대한 쿠도아 감염 조사 결과, 7마리의 넙치에서 모든 실험 방법(PCR, qPCR, 현미경 검사)에서 쿠도아 감염 양성으로 나타났으며, 4마리의 넙치에서 PCR과 qPCR에 의한 쿠도아 양성, 1마리의 넙치에서 PCR에 의한 쿠도아 양성 판정을 받았다(Table 3). 이러한 결과로부터, PPM 방법을 사용 하여 넙치의 상품 가치를 훼손하지 않으면서 살아있는 넙치에서 효율적으로 쿠도아 감염 여부 확인이 가능함을 확인하였다.
- septempunctata 감염 모니터링 선행 연구를 통해 얻은 감염 넙치 5마리를 사용하여 기존에 사용 된 근육 채취 방법 인 등근육 전체로부터 근육을 채취하여 검사를 하는 ETM방법과, 넙치를 죽이지 않고도 가능한 부분적 근육채취 방법인 PPM 방법에 대하여 쿠도아 검출 효과를 비교하였다. 그 결과, 쿠도아 양성 기준치 이상(7 log rDNA copy/g 이상) 감염어의 경우 ETM과 PPM의 PCR 검출 결과는 모두 양성으로 동일하였고, 쿠도아 포자도 모두 검출되었다. 하지만, 유전자 농도가 기준치 이하이며 포자가 검출되지 않는 수준의 감염어의 경우, ETM 샘플은 PCR 양성이었으나, PPM의 경우 PCR 음성으로 나타나 두 방법의 결과가 일치하지 않았다.
- 하지만, 유전자 농도가 기준치 이하이며 포자가 검출되지 않는 수준의 감염어의 경우, ETM 샘플은 PCR 양성이었으나, PPM의 경우 PCR 음성으로 나타나 두 방법의 결과가 일치하지 않았다. 본 결과로부터, 유전자 검출 결과 기준치 이상이 검출되고 포자가 검출되는 수준의 감염 단계에서는 PPM방법을 사용하여 국소적으로 근육 샘플을 채취하더라도 ETM 방법에 의한 결과와 일치하여 쿠도아 감염 진단에 충분히 실효적인 것으로 나타났다.
- 또한, PPM 방법에 의한 넙치 등근육 부위별 검출 효과를 비교하기 위해, 쿠도아 감염 넙치 2마리를 사용하여 등근육 6개 point에 따른 쿠도아 검출 효과를 비교한 결과, 포자가 검출되는 수준의 감염 단계에서는 모든 부위에서 쿠도아가 검출되었으나, 포자가 검출되지 않는 수준의 감염 단계에서는 부위별로 차이가 발생하였다. Iijima 등(2012)에 의한 보고에서 쿠도아 감염은 유안측/무안측의 몸 전체에 퍼지는 것을 제안하였으며, Harada 등(2012b)의 연구에서, 쿠도아 포자수가 1.
- 4×10 5 spores/g의 감염 수준에서는 rDNA copy수가 다양하게 나타남을 보고하였다. 이번 연구의 결과, 포자가 검출되는 수준의 감염 단계에서는 채취 부위에 관계없이 PPM 방법에 의해 쿠도아 진단을 할 수 있는 것이 확인되어, 근육층의 두께가 비교적 얇은 꼬리 부위를 이용하여 근육을 채취하는 것이 현장에서 간단하게 채취할 수 있는 방법임을 제안한다.
- 마지막으로, 본 연구에서는 양식장에서 사육중인 넙치를 대상으로 PPM법을 이용한 근육 채취 후 다시 사육하였을 경우의 생존율을 조사한 결과, 실험어 100마리 모두 한 달 동안 폐사가 발생하지 않았다. 또한, 100마리의 쿠도아 감염 여부 조사 결과, 포자가 검출되는 7마리의 감염어는 유전자 검사법(PCR, qPCR)에서도 모두 쿠도아 양성 반응을 나타내었고, 현미경으로 포자가 검출되지 않는 경우에도 5마리에서 유전자 검사법에 의해 쿠도아가 양성으로 검출되었다.
- 마지막으로, 본 연구에서는 양식장에서 사육중인 넙치를 대상으로 PPM법을 이용한 근육 채취 후 다시 사육하였을 경우의 생존율을 조사한 결과, 실험어 100마리 모두 한 달 동안 폐사가 발생하지 않았다. 또한, 100마리의 쿠도아 감염 여부 조사 결과, 포자가 검출되는 7마리의 감염어는 유전자 검사법(PCR, qPCR)에서도 모두 쿠도아 양성 반응을 나타내었고, 현미경으로 포자가 검출되지 않는 경우에도 5마리에서 유전자 검사법에 의해 쿠도아가 양성으로 검출되었다.
후속연구
- 본 연구에서의 PPM 방법을 사용한 쿠도아 검사법은 사육 과정 또는 출하 단계의 넙치를 죽이지 않고 넙치의 가식부위 근육을 사용하여 쿠도아 검사가 가능하므로 현장에서 매우 유용하게 사용될 수 있는 방법임을 제안한다. 이러한 결과로부터, PPM 방법을 사용하여 넙치를 죽이지 않고 상품 가치를 훼손하지 않으며 근육 샘플 채취가 가능하므로, 양식장에서 넙치를 사육하는 동안 지속적인 쿠도아의 감염 모니터링에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, PPM 방법에 의해 근육을 부분채취하더라도 현미경 검사법으로 포자 검출이 가능하므로 고가의 장비를 사용하지 않고도 양식장 자체나 협회 등에서 자신의 사육생물을 모니터링 할 수 있는 효율적인 방법으로 사용될 수 있음을 제안한다.
- 이러한 결과로부터, PPM 방법을 사용하여 넙치를 죽이지 않고 상품 가치를 훼손하지 않으며 근육 샘플 채취가 가능하므로, 양식장에서 넙치를 사육하는 동안 지속적인 쿠도아의 감염 모니터링에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, PPM 방법에 의해 근육을 부분채취하더라도 현미경 검사법으로 포자 검출이 가능하므로 고가의 장비를 사용하지 않고도 양식장 자체나 협회 등에서 자신의 사육생물을 모니터링 할 수 있는 효율적인 방법으로 사용될 수 있음을 제안한다.
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