[논문]Ultrafast Real-time PCR법을 이용한 살모넬라의 신속 검출

김석환; 이유시; 주인선; 곽효선; 정경태; 김순한

doi:10.13103/jfhs.2018.33.1.50

Ultrafast Real-time PCR법을 이용한 살모넬라의 신속 검출
Rapid Detection for Salmonella spp. by Ultrafast Real-time PCR Assay 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.33 no.1, 2018년, pp.50 - 57

김석환 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과) , 이유시 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과) , 주인선 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과) , 곽효선 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과) , 정경태 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과) , 김순한 (식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과)

초록
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Salmonella는 전세계적으로 식중독을 유발하는 주요 원인 균으로서, 식중독을 유발하는 Salmonella를 신속하게 검출하는 방법은 식품 안전을 위한 중요한 도구이다. Real-time PCR은 식중독균을 검출하기 위한 신속검사법으로 널리 사용되어 왔다. 최근에는 NBS LabChip real-time PCR이라는 새로운 시스템이 칩타입으로 조작이 간편하며 초고속의 real-time PCR 시스템이라는 보고가 있었다. 본 연구에서는 살모넬라의 신속한 검출을 위하여 NBS LabChip real-time PCR에 기반하여 real-time PCR 반응 시간이 20분 이내인 검출법을 확인하고자 하였다. 프라이머와 프로브 설계를 위해 두 개의 타겟 유전자(invA, stn)가 선택되었으며, 특이도와 민감도(검출한계)를 평가함으로 개발된 검출법을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 특이도 검증을 위해 Salmonella 균주 42주와 Non-Salmonella 균주 21주를 포함하였으며, 본 방법으로 Salmonella 42주에 대해서만 정확하게 검출이 가능하였다. 검출한계는 살모넬라 genome DNA 기준으로 $10^1copies/{\mu}L$으며, 소시지에서는 4시간 증균 이후 접종균수로서 $10^1CFU/g$에서 $10^2CFU/g$까지 검출이 가능하였다. 본 연구에서 개발된 검출법은 신속한 식중독 원인조사에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Salmonella continue to be a major cause of food poisoning worldwide. The rapid detection method of food-borne Salmonella is an important food safety tool. A real-time polymerase chain reaction (PCR) has been used as a rapid method for the detection of pathogens. It has been recently reported that NBS LabChip real-time PCR is a novel, ultrafast, and chip-type-convenient real-time PCR system. We developed the assay method based on NBS LabChip real-time PCR for the rapid detection of Salmonella, which its reaction time was within 20 minutes. Two target genes (invA and stn) were selected to design target specific primers and probes. The new method was validated by checking specificity and sensitivity (limit of detection). This study included forty-two target and twenty-one non-target strains to assess the specificity. This assay was able to identify the 42 Salmonella strains correctly. The limit of detection (LOD) was $10^1copies/{\mu}L$ in Salmonella genomes DNA, while LOD incubated for 4 hr in the inoculated sausage sample ranged from $10^1CFU/g$ to $10^2CFU/g$ as an inoculated cell count. The assay developed in this study could be applied for the investigation of food poisoning pathogens.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

최근에도 병원체를 신속하게 검출하기 위해 다양한 real-time PCR 시스템이 개발되고 있으며, 20분 이내로 PCR 반응이 가능한 칩타입의 초고속 realtime PCR 시스템(NBS Labchip G2-4)이 보고되어 감염병진단에 활용되고 있다^23,24). 따라서 본 연구에서는 식중독의 주요 원인균으로 알려진 살모넬라를 신속하게 검출하기 위해 초고속 real-time PCR 기법을 이용하여 검출한계(민감도)와 특이 도를 확인하였다.

제안 방법

반응액의 조성은 PCR 튜브에 Master Mix (Nanobiosys,Seoul, Korea), primer/probe, DW를 7 µL이 되도 혼합한후 시료 DNA 2 µL를 첨가하여 총량을 9 µL로 하였고, 이를 8 µL씩 각 채널에 주입하였다. NBS LabChip real-timePCR (UltraFast real-time PCR G2-4 system, Nanobiosys,Seoul, Korea)를 사용하여 95oC 12초를 반응시킨 후 95oC4초, 56oC 15초를 1회로 하여 총 40 cycles을 수행하였으며, running time으로 18분이 소요되었다. ;
Real-time PCR법에 사용된 primer와 probe 서열은 Salmonella의 병원성 유전자인 invA (GenBank accessionno. DQ644631)와 stn (L16014)을 타겟으로 설계하였다. 각각의 프라이머와 프로브는 primer 3 프로그램(http://www.

대상 데이터

Salmonella spp. 표준균주 9주와 식품 등에서 분리한 균주(MFDS 균주) 33주 및 Non-target Salmonella spp. 21주등 총 63주를 확보하여 VITEK 2 compact system (BioMerieux, Marcy I’Etoile, France)을 통해 생화학적 동정형을 거쳐 확인한 후 실험에 사용하였다(Table 1).
특이도 평가를 위해서 Salmonella spp. 균주 42주와 비대상균주 21주를 대상으로 real-time PCR을 실시하였다.또한 국내에서 동일 타겟으로 시판되고 있는 살모넬라 검출 kit (KogeneBiotech, Seoul, Korea)로 real-time PCR (7500Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Carlsbad, CA,USA)을 시행하여, 두 real-time PCR법에 대한 결과 일치도를 비교하였다.

데이터처리

균주 42주와 비대상균주 21주를 대상으로 real-time PCR을 실시하였다.또한 국내에서 동일 타겟으로 시판되고 있는 살모넬라 검출 kit (KogeneBiotech, Seoul, Korea)로 real-time PCR (7500Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Carlsbad, CA,USA)을 시행하여, 두 real-time PCR법에 대한 결과 일치도를 비교하였다.

성능/효과

Real-time PCR의 특이도는 target만 검출해내는 inclusivity와 non target은 검출하지 않는 exclusivity 결과로 평가하게 된다. 본 연구에서는 invA 및 stn 유전자를 target인Salmonella 균주 42주에서 모두 검출하였고, non target 균주 21주에서는 검출되지 않아 위양성, 위음성 결과가 나타나지 않았음을 확인하였다(Table 1). 또한 기존에 살모넬라 검출을 위해 사용되고 있는 국내 제품인 살모넬라검출 kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)와 비교를 진행한 결과, 모두 100% 일치하여 두 방법 간 특이도 결과에 차이가 없었다(Table 1).
4에 나타내었다. 대조군인 증균 전 단계로 적용된 살모넬라 순수배양액(before enrichment)의 경우 invA와 stn 모두 10³CFU/g이며, 접종 후 4시간 증균한(after enrichment) 결과 invA 유전자는 접종균수로서 10¹CFU/g, stn 유전자는 접종균수로서 10²CFU/g 수준의 감도를 보였다(Fig. 4). 식품으로부터 병원균의 검출은 특이성뿐만 아니라 민감성 또한 매우 중요한 요인으로 작용한다²⁷⁾.
따라서 본 연구에서 개발한 프라이머/프로브를 이용하여 NBS LabChip real-time PCR법으로 4시간 동안 배양한 증균액만으로 20분 내에 결과를 판정할 수 있기 때문에 분석 시간 및 비용을 절감할 수 있고, 시료 내에 적은 농도로 존재하는 Salmonella 균을 검출할 수 있었다. 또한 식품에서 검출감도를 높이기 위해서는 최소 4시간 이상의 증균 과정을 거쳐야 할 것으로 사료된다.

후속연구

또한 식품에서 검출감도를 높이기 위해서는 최소 4시간 이상의 증균 과정을 거쳐야 할 것으로 사료된다. 최종적으로 본 연구에서는 Salmonella의 stn과 invA gene의 신속 검출법을 마련하여 민감도와 특이성을 확인하였으며, 향후 식품과 식중독 원인조사에 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	살모넬라 검출법 중에서 배양법의 한계는 무엇인가?	일반적인 살모넬라 표준검출법으로는 선택 배지를 이용한 배양법이 사용되지만, 이 시험법은 증균배양, 분리배양,생화학 시험 등의 과정이 필요하기 때문에 5일 이상의 장시간이 소요되며 많은 노동력이 필요하다6,8). 이러한 배양에 의한 시험방법은 국제적으로 식중독 원인체 규명을 위한 표준 시험법으로 널리 통용되고 있지만 신속한 결과를 규명하기에는 시간적으로 한계점이 따른다. 식중독 세균의신속 검출법(rapid method)으로는 ELISA (Enzyme LinkedImmuno-Sorbent Assay), 직접형광항체법, 유전자 기반의검출 방법인 DNA hybridization과 PCR (Polymerase ChainReaction)법이 널리 응용되고 있다19).
	살모넬라란 무엇인가?	살모넬라는 동물의 장내에서 서식할 수 있는 장내세균과로 닭, 소, 돼지 등 가축의 장관 및 토양과 물 등 자연계에 널리 분포하고 있다7). 주로 살모넬라균이 오염된 식품이나 가축의 매개 형태로 발생하여 장독소(enterotoxin)를 생성하여 48시간 이내에 위장염을 일으켜 설사, 발열,복통, 장티푸스 등 심각한 질병을 발생시키기도 한다8-14).
	식중독 세균의 신속 검출법에는 무엇이 있는가?	이러한 배양에 의한 시험방법은 국제적으로 식중독 원인체 규명을 위한 표준 시험법으로 널리 통용되고 있지만 신속한 결과를 규명하기에는 시간적으로 한계점이 따른다. 식중독 세균의신속 검출법(rapid method)으로는 ELISA (Enzyme LinkedImmuno-Sorbent Assay), 직접형광항체법, 유전자 기반의검출 방법인 DNA hybridization과 PCR (Polymerase ChainReaction)법이 널리 응용되고 있다19). 그 중 Polymerasechain reaction (PCR)법은 식중독균의 특정 유전자를 증폭시켜 전기영동 겔을 통해 확인하는 방법으로 단시간 내에 결과를 도출하고 높은 특이도와 민감도를 나타낸다8,20,21).

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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