본 연구에서는 높은 민감성을 가진 측방유동면역분석(lateral flow immunoassay) 스트립 센서를 제작하기 위하여 mercaptoundecanoic acid (MUA)와 L-lysine 단분자를 사용하여 금나노입자 표면을 개질할 수 있는 합성법을 개발하였다. 균일한 사이즈의 금나노입자를 합성하기 위하여 Turkevich-Frens 합성법을 이용하였으며 $16.7{\pm}2.1nm$ 크기의 금나노 입자를 제조하였다. 기능화된 금나노입자의 특성을 확인하기 위하여 투과전자현미경(TEM), 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectroscopy), X선 광전자분광기(XPS), 푸리에 변환 적외선 분광기(FT-IR)를 사용하여 분석하였다. 금나노입자와 항체 간의 안정적인 접합(conjugation)을 위한 pH 및 항체의 농도 조건은 pH 7.07, 항원의 농도 $10{\mu}g/mL$로 최적화되었다. B형간염 표면항원을 검출하기 위하여 측방유동면역분석 스트립 센서를 제작하였으며, 표면개질된 금나노입자로 제작된 면역스트립 센서에서 10 ng/mL로 낮은 검출한계를 나타내었으며, 이는 기능화되지 않은 금나노입자 기반 면역스트립센서의 100 ng/mL보다 높았다.
본 연구에서는 높은 민감성을 가진 측방유동면역분석(lateral flow immunoassay) 스트립 센서를 제작하기 위하여 mercaptoundecanoic acid (MUA)와 L-lysine 단분자를 사용하여 금나노입자 표면을 개질할 수 있는 합성법을 개발하였다. 균일한 사이즈의 금나노입자를 합성하기 위하여 Turkevich-Frens 합성법을 이용하였으며 $16.7{\pm}2.1nm$ 크기의 금나노 입자를 제조하였다. 기능화된 금나노입자의 특성을 확인하기 위하여 투과전자현미경(TEM), 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectroscopy), X선 광전자분광기(XPS), 푸리에 변환 적외선 분광기(FT-IR)를 사용하여 분석하였다. 금나노입자와 항체 간의 안정적인 접합(conjugation)을 위한 pH 및 항체의 농도 조건은 pH 7.07, 항원의 농도 $10{\mu}g/mL$로 최적화되었다. B형간염 표면항원을 검출하기 위하여 측방유동면역분석 스트립 센서를 제작하였으며, 표면개질된 금나노입자로 제작된 면역스트립 센서에서 10 ng/mL로 낮은 검출한계를 나타내었으며, 이는 기능화되지 않은 금나노입자 기반 면역스트립센서의 100 ng/mL보다 높았다.
In this work, the surface of gold nanoparticles (AuNPs) was modified with small molecules including mercaptoundecanoic acid (MUA) and L-lysine for the development of highly sensitive lateral flow (LF) sensors. Uniformly sized AuNps were synthesized by a modified Turkevich-Frens method, showing an av...
In this work, the surface of gold nanoparticles (AuNPs) was modified with small molecules including mercaptoundecanoic acid (MUA) and L-lysine for the development of highly sensitive lateral flow (LF) sensors. Uniformly sized AuNps were synthesized by a modified Turkevich-Frens method, showing an average size of $16.7{\pm}2.1nm$. Functionalized AuNPs were then characterized by transmission electron microscopy, UV-vis spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, and Fourier transform infrared spectroscopy. The stable conjugation of AuNPs and antibodies was obtained at pH 7.07 and the antibody concentration of $10{\mu}g/mL$. The functionalized AuNP-based LF sensor exhibited lower detection limit of 10 ng/mL for hepatitis B surface antigens than that of using the bare AuNP-based LF sensor (100 ng/mL).
In this work, the surface of gold nanoparticles (AuNPs) was modified with small molecules including mercaptoundecanoic acid (MUA) and L-lysine for the development of highly sensitive lateral flow (LF) sensors. Uniformly sized AuNps were synthesized by a modified Turkevich-Frens method, showing an average size of $16.7{\pm}2.1nm$. Functionalized AuNPs were then characterized by transmission electron microscopy, UV-vis spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, and Fourier transform infrared spectroscopy. The stable conjugation of AuNPs and antibodies was obtained at pH 7.07 and the antibody concentration of $10{\mu}g/mL$. The functionalized AuNP-based LF sensor exhibited lower detection limit of 10 ng/mL for hepatitis B surface antigens than that of using the bare AuNP-based LF sensor (100 ng/mL).
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제안 방법
이에 반해 MUA와 L-lysine으로 표면 개질된 금나노입자 기반의 면역스트립 센서의 경우 10 ng/mL의 낮은 항원 농도에서도 검출이 될 수 있음을 확인하였다(Figure 6c and 6d). AuNP/L-lysine의 경우 보다 더 밝은 발색이 일어남을 관찰하였다. 이는 L-lysine의 -NH2와 -COOH의 그룹들이 항체와의 conjugation을 보다 용이하게 하여 면역 스트립 센서에서 보다 안정적으로 면역반응이 일어날 수 있도록 유도하였기 때문이다.
nitrocellulose 멤브레인의 test line과 control line의 항체는 각각 hepatitis B virus antibody와 goat anti-mouse IgG를 1 mg/mL씩 분주한 후 상온에서 건조시켰다. Backing card를 back-bone structure로 사용하여 각 구성요소들을 결합시킴으로써 스트립 센서를 제작하였다. 스트립 테스트를 위하여 항원의 농도(100 µg/mL~1 ng/mL)에 따라 100 µL씩 떨어뜨린 후 test line과 control line의 발색을 확인하였다.
MUA와 L-lysine으로 표면개질 된 금나노입자와 항체를 접합 최적화를 위하여 pH와 hepatitis B surface antibody의 농도를 조절하였다[16]. 먼저 표면개질 된 금나노입자 분산액 2 mL를 10 mL vial에 넣고0.
pH가 최적화된 금나노입자를 이용하여 hepatitis B surface antibody의 농도(0.5~10 µg/mL)에 따라서 접합 최적화를 진행하였으며 rotator를 이용하여 20 rpm으로 30 min 동안 표면개질된 금나노입자와 항체를 접합하였다.
표면개질 금나노입자와 항체 간의 접합을 위하여 pH 및 항체의 농도에 따라 최적화 조건 및 금나노입자의 안정성을 분석하였다. 금나노입자의 안정성을 위하여 pH와 항체의 농도에 따라 적정된 표면개질 금나노입자에 10 wt% NaCl 용액을 첨가한 뒤 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Figure 5a는 pH에 따라 적정된 표면개질 금나노입자를 분석하였으며 pH 7.
상기 제조된 분산액은 재료분석과 센서 제작을 위하여 냉장보관 하였다. 금나노입자의 입자크기 및 구조는 투과전자현미경(transmission electron microscopy (TEM), JEOL Ltd., JEM-2100F)으로 분석하였으며, 광학적 특성은 UV-vis spectroscopy (Optizen 2120UV)를 이용하였고, 표면 화학구조를 분석하기 위하여 X선 광전자분광기(X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)를 사용하였으며, 금나노입자의 관능기 분석을 위하여 Fourier transform infrared spectroscopy (Jasco, FT/IR-4600)를 이용하여 분석하였다.
표면개질된 금나노입자와 항체 간의 접합(conjugation) 최적화를 위하여 상기 분산액의 pH와 항체 농도를 조절하였다. 금나노입자의 작용기 효과에 따른 측방유동면역분석 성능을 분석하기 위하여 B형 간염표면항원 면역스트립 센서를 제작하였다. L-lysine으로 표면개질된 금나노입자 기반의 면역스트립 센서가 뚜렷한 발색과 낮은 검출한계를 나타내었다.
본 연구에서는 Turkevich-Frens 합성법으로 금나노입자를 제조하였으며 mercaptoundecanoic acid (MUA)와 L-lysine 등의 단분자들을 사용하여 금나노입자의 표면개질을 진행하였다. 금나노입자의 표면개질은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectroscopy)를 통한 흡광도세기변화와 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectroscopy)의 금나노입자 표면 작용기 분석을 통하여 확인하였다. 표면개질된 금나노입자와 항체 간의 접합(conjugation) 최적화를 위하여 상기 분산액의 pH와 항체 농도를 조절하였다.
기능화 된 금나노입자의 면역센서 효과를 관찰하기 위하여 B형간염표면항원 검출을 위한 측방유동면역분석 스트립 센서를 제작하였다(Figure 6a). 스트립 센서의 구성요소들로써 cotton 샘플패드, polyester 접합패드, nitrocellulose 멤브레인, cotton 흡수패드 등을 사용하였다.
다양한 B형간염 표면항원 농도(100 µg/mL~1 ng/mL)에서 면역 스트립 센서의 test line에서 발색되는 금나노입자의 색상을 관찰함으로써 센서의 성능을 측정하였다.
MUA와 L-lysine으로 표면개질 된 금나노입자와 항체를 접합 최적화를 위하여 pH와 hepatitis B surface antibody의 농도를 조절하였다[16]. 먼저 표면개질 된 금나노입자 분산액 2 mL를 10 mL vial에 넣고0.25 M K2CO3를 이용하여 pH 5~10까지 적정하였으며 pH를 조절한 금나노입자 분산액을 UV-vis spectroscopy를 이용하여 흡광도를 비교하였다. 이후 10 wt% NaCl 100 µL를 첨가하여 표면개질 된 금나노입자의 변화를 확인하였다.
금나노입자 제조를 위한 Turkevich-Frens 합성법은 전구체인 HAuCl4용액에 환원제인 citrate를 첨가하여 Au3+ 이온이 Au 나노입자가 생성되게 하는 방법이다. 보다 균일한 금나노입자를 제조하기 위하여 본 연구에서는 Turkevich-Frens 합성법으로 금나노입자 seed를 먼저 형성시키고, 이후 gold chloride 용액을 첨가하면서 Au3+들이 형성된 seed표면 위에 흡착된 후 추가 환원시켜 금나노입자의 크기를 조절하였다. 금나노입자의 크기는 금 전구체 및 citrate 농도와 증착 횟수에 따라서 조절이 가능하다[14-18].
본 연구에서는 MUA와 L-lysine을 이용하여 금나노입자의 표면을 개질하였으며 광학분석 및 표면분석을 수행하였다. 광학분석을 통하여 표면개질 금나노입자의 흡광도가 낮아짐을 확인하였으며 항체와의 접합을 위한 최적화 조건으로는 표면개질 금나노입자는 pH 7.
본 연구에서는 Turkevich-Frens 합성법으로 금나노입자를 제조하였으며 mercaptoundecanoic acid (MUA)와 L-lysine 등의 단분자들을 사용하여 금나노입자의 표면개질을 진행하였다. 금나노입자의 표면개질은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectroscopy)를 통한 흡광도세기변화와 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectroscopy)의 금나노입자 표면 작용기 분석을 통하여 확인하였다.
스트립 테스트를 위하여 항원의 농도(100 µg/mL~1 ng/mL)에 따라 100 µL씩 떨어뜨린 후 test line과 control line의 발색을 확인하였다.
이후 10 wt% NaCl 100 µL를 첨가하여 표면개질 된 금나노입자/항체의 변화를 확인하였다.
이후 10 wt% NaCl 100 µL를 첨가하여 표면개질 된 금나노입자의 변화를 확인하였다.
금나노입자의 크기는 금 전구체 및 citrate 농도와 증착 횟수에 따라서 조절이 가능하다[14-18]. 제조된 금나노입자의 표면처리를 위하여 -COOH 그룹기를 가지는 MUA와 -COOH와 -NH2 그룹기를 가지는L-lysine를 사용하여 citrate 분자로 막 형성된 금나노입자와 conjugation 시켜주었다(Figure 1).
표면개질 금나노입자와 항체 간의 접합을 위하여 pH 및 항체의 농도에 따라 최적화 조건 및 금나노입자의 안정성을 분석하였다. 금나노입자의 안정성을 위하여 pH와 항체의 농도에 따라 적정된 표면개질 금나노입자에 10 wt% NaCl 용액을 첨가한 뒤 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
금나노입자의 표면개질은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectroscopy)를 통한 흡광도세기변화와 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectroscopy)의 금나노입자 표면 작용기 분석을 통하여 확인하였다. 표면개질된 금나노입자와 항체 간의 접합(conjugation) 최적화를 위하여 상기 분산액의 pH와 항체 농도를 조절하였다. 금나노입자의 작용기 효과에 따른 측방유동면역분석 성능을 분석하기 위하여 B형 간염표면항원 면역스트립 센서를 제작하였다.
5~10 µg/mL)에 따라서 접합 최적화를 진행하였으며 rotator를 이용하여 20 rpm으로 30 min 동안 표면개질된 금나노입자와 항체를 접합하였다. 항체의 농도를 조절한 금나노입자/항체 접합체를 UV-vis spectroscopy를 이용하여 흡광도를 비교하였다. 이후 10 wt% NaCl 100 µL를 첨가하여 표면개질 된 금나노입자/항체의 변화를 확인하였다.
대상 데이터
금나노입자 제조 및 표면개질을 위한 gold chloride (HAuCl4⋅3H2O), trisodium citrate (S1804), mercaptoundecanoic acid (450561),L-lysine (L5501) 등을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
금나노입자 제조 및 표면개질을 위한 gold chloride (HAuCl4⋅3H2O), trisodium citrate (S1804), mercaptoundecanoic acid (450561),L-lysine (L5501) 등을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 금나노입자/항체 간의 접합을 위하여 bovine serum albumin (A2153)와 sucrouse(31367-9001)는 Sigma-Aldrich와 Junsei로부터 각각 구입하였으며,hepatitis B surface antigen (13200)과 antibody (13101), goat anti-mouse IgG (20300)는 Boreda Biotech로부터 구입하였다. 측방유동면역분석 스트립제조를 위하여 샘플패드(grade 319), 접합패드(grade805), nitrocellulose 멤브레인(LFNC-C-SS2505), 흡수패드(grade 222)는 Boreda Biotech로부터 구입하였다.
샘플패드와 흡수패드는 0.4 cm × 1.8 cm, 접합패드는 0.4 cm × 0.6cm, 멤브레인 0.4 cm × 2.0 cm로 절단한 후 사용하였으며 0.4 cm ×6.0 cm로 절단한 backing card를 back-bone structure로 사용하였다.
기능화 된 금나노입자의 면역센서 효과를 관찰하기 위하여 B형간염표면항원 검출을 위한 측방유동면역분석 스트립 센서를 제작하였다(Figure 6a). 스트립 센서의 구성요소들로써 cotton 샘플패드, polyester 접합패드, nitrocellulose 멤브레인, cotton 흡수패드 등을 사용하였다. 샘플패드와 흡수패드는 0.
금나노입자/항체 간의 접합을 위하여 bovine serum albumin (A2153)와 sucrouse(31367-9001)는 Sigma-Aldrich와 Junsei로부터 각각 구입하였으며,hepatitis B surface antigen (13200)과 antibody (13101), goat anti-mouse IgG (20300)는 Boreda Biotech로부터 구입하였다. 측방유동면역분석 스트립제조를 위하여 샘플패드(grade 319), 접합패드(grade805), nitrocellulose 멤브레인(LFNC-C-SS2505), 흡수패드(grade 222)는 Boreda Biotech로부터 구입하였다.
이론/모형
금나노입자는 Turkevich-Frens 합성법에 따라서 제조되었다[14,15].먼저, 3구 라운드 플라스크에 2.
기능화된 금나노입자의 표면 관능기를 분석하기 위하여 Fourier transform infrared spectroscope를 사용하였다. Figure 3는 MUA와 L-lysine으로 표면개질된 금나노입자의 FT-IR 스펙트럼들을 보여주고 있다.
성능/효과
AuNP/L-lysine의 경우도 위와 같은 방법으로 항체와의 conjugation 최적화를 확인하였으며, 실험결과 pH 7.0과 항체 농도 10 µg/mL에서 가장 안정적인 분산액을 유지하였다.
FT-IR과 XPS 표면분석을 통하여 실제 금나노입자 표면에 MUA 및 L-lysine 작용기로 개질이 되어있음을 확인하였다. B형간염표면항원분석용 스트립 센서를 제작하여 기능화 된 금나노입자의 면역 반응 효과를 관찰하였으며, 10 ng/mL의 B형간염항원 농도까지 검출될 수 있음을 확인하였다.
07,항원의 농도가 10 µg/mL일 때 분산액이 가장 안정적으로 나타났다.FT-IR과 XPS 표면분석을 통하여 실제 금나노입자 표면에 MUA 및 L-lysine 작용기로 개질이 되어있음을 확인하였다. B형간염표면항원분석용 스트립 센서를 제작하여 기능화 된 금나노입자의 면역 반응 효과를 관찰하였으며, 10 ng/mL의 B형간염항원 농도까지 검출될 수 있음을 확인하였다.
금나노입자의 작용기 효과에 따른 측방유동면역분석 성능을 분석하기 위하여 B형 간염표면항원 면역스트립 센서를 제작하였다. L-lysine으로 표면개질된 금나노입자 기반의 면역스트립 센서가 뚜렷한 발색과 낮은 검출한계를 나타내었다.
광학분석을 통하여 표면개질 금나노입자의 흡광도가 낮아짐을 확인하였으며 항체와의 접합을 위한 최적화 조건으로는 표면개질 금나노입자는 pH 7.07,항원의 농도가 10 µg/mL일 때 분산액이 가장 안정적으로 나타났다.
이는 자외선 영역의 특정 파장의 흡수 및 산란 시 금나노입자의 표면개질에 의한 localized surface plasmon resonance (LSPR)현상에 기인한 것이다[19]. 단분자들에 의해서 기능화된 금나노입자는 안정적인 콜로이드 형태로 수용상에 분산되어 있음을 확인하였다. 투과전자현미경 관찰을 통한 기능화된 금나노입자와 항체가의 표면 형상은 항체들이 균일하게 금나노입자 표면을 둘러싸고 있음을 확인하였다(Figure 2b).
순수한 금나노입자 표면 관능기와 비교하여 MUA로 표면개질된 금나노입자에서는 2,850와 2,916 cm-1에서 포화된 alkyl의 stretching vibration 피크가 관찰되었다(Figure 3a). 또한 AuNP/MUA 표면에서 -SH ligand (2,556 cm-1) 피크가 소멸된 것으로 보아 금나노입자의 citrate 분자와 ligand exchange가 일어났음을 확인할 수 있었다. 또한 MUA와의 결합 후 -OH, C=O (1,579 cm-1), C-H (1,399 cm-1) 피크들이 이동한 것으로 보아 MUA와 citrate간에 반데르발스 힘과 수소결합에 의하여 conjugation이 일어났음을 확인할 수 있었다[20].
Figure 4b는 MUA로 표면개질된 금나노입자의 표면 화학상태를 나타내며, 개질전의 금나노입자와 비교하여 C 1s와 O 1s 피크 세기가 현저히 증가하였음을 확인하였다. 또한, high-resolution S 2p 피크가 뚜렷하게 관찰된 것으로 보아 이는 금나노입자가 MUA로 표면 개질되었음을 확인하였다. Figure 4c는 L-lysine으로 표면개질한 금나노입자이며 surveyscan의 C 1s, O 1s 피크와 high-resolution N 1s 피크가 나타나는 것으로 보아 금나노입자의 표면이 -COOH, -NH2로 개질되었음을 확인하였다.
단분자들에 의해서 기능화된 금나노입자는 안정적인 콜로이드 형태로 수용상에 분산되어 있음을 확인하였다. 투과전자현미경 관찰을 통한 기능화된 금나노입자와 항체가의 표면 형상은 항체들이 균일하게 금나노입자 표면을 둘러싸고 있음을 확인하였다(Figure 2b).
Figure 2b는 MUA와 L-lysine으로 표면개질된 금나노입자의 자외선-가시광선 분광광도계 결과를 보여주고 있다. 표면개질 전의 금나노입자와 비교하여 520 nm에서의 흡광도 세기가 낮아지는 것을 관찰하였다. 이는 자외선 영역의 특정 파장의 흡수 및 산란 시 금나노입자의 표면개질에 의한 localized surface plasmon resonance (LSPR)현상에 기인한 것이다[19].
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
측방유동면역분석법의 장점은?
측방유동면역분석법(lateral flow immunoassay)은 분석하려는 샘플을 스트립 안에 흐르게 함으로써 항체와 항원의 면역반응을 이용한 질병을 검출하는 방법이며, 스트립 안쪽의 샘플이 모세관현상에 의하여 멤브레인 쪽으로 이동하게 된다[10]. 또한 측방유동면역분석법은 고가의 장비 및 전문 인력이 필요 없으며 검출시간이 빠르고 가격이 싸다는 장점을 가지고 있다. 하지만, 다른 측정 방법들에 비해서 상대적으로 검출한계(limit of detection)가 낮다는 단점이 있다.
측방유동면역분석법의 단점은?
또한 측방유동면역분석법은 고가의 장비 및 전문 인력이 필요 없으며 검출시간이 빠르고 가격이 싸다는 장점을 가지고 있다. 하지만, 다른 측정 방법들에 비해서 상대적으로 검출한계(limit of detection)가 낮다는 단점이 있다. 측방유동면역분석법의 스트립은 샘플패드(sample pad),접합패드(conjugation pad), 멤브레인(membrane), 흡수패드(absorbentpad)로 구성되어 있으며, 특히 접합패드에 담지하는 금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)와 항체(antigen) 간의 상호간 인력에 따라서 스트립 센서의 민감도가 많은 영향을 받는다.
방사면역측정법(radioimmunoassay)은 무엇인가?
이는 항체를 사용하여 진단하려고 하는 샘플을 항체와 항원의 반응을 통하여 질병을 검출하는 방법이다. 면역분석을 위하여 사용되는 방법으로 항체와 항원의 결합을 효소의 반응에 의하여 나타내는 색으로 분석하는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사성 동위원소의 항체와 항원의 반응을 사용하여 질병을 진단하는 방사면역측정법(radioimmunoassay), 항체와 항원의 반응을 화학발광을 통하여 분석하는 화학발광 면역분석법(chemiluminescence immunoassay) 등이 있다[6-9]. 그러나 이러한 방법들은 분석시간이 길고 고가의 장비와 전문 인력이 필요한 단점을 가지고 있다.
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