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문제 정의
- . 본 연구에서는 선행연구15)를 통하여 캐피어로부터 분리한 E. faecium CJNU 2008 유래 박테리오신의 일부 특성을 규명하였으며 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 37ºC에서 12시간 배양 후 생육저해환을 관찰하여 박테리오신의 위치를 확인하였다.
- E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신의 작용 양상(정균 혹은 살균)을 확인하였다. 지시균으로 병원성 세균인 L.
- HPLC 정제를 위해 ACE 5 C18(4.6 × 150 mm) 컬럼(Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, UK)을 사용하였으며 이동상 A용매(물 + 0.1% TFA)와 B용매(아세토니트릴 + 0.1% TFA)를 조합하여 60분 동안 0-10분 A용매 100%, 10-50분 A용매 100% → B용매 100%, 50-60분 B용매 100%의 농도기울기를 적용하였다.
- 마지막으로 효소에 대한 안정성 시험은 Protease (Tokyo chemical, Tokyo, Japan), Lipase (Tokyo chemical) 및 α-Amylase (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하였으며, 박테리오신 용액 50 μL에 1 uint의 효소를 첨가한 후 37ºC에서 1시간 반응시킨 뒤 잔존 활성을 측정하였다.
- 부분 정제된 박테리오신의 분자량 확인을 위하여 Tricine-SDS-PAGE (tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였으며 15% 겔을 사용하여 110 V에서 1시간 30분간 전기영동 한 후 bioassay를 수행하였다18,19). 즉, 전개된 겔을 적당한 크기로 자른 후 증류수에서 2시간 동안 세척하였다.
- 부분 정제된 박테리오신의 분자량 확인을 위하여 Tricine-SDS-PAGE를 실시하였다. 분석 결과, 분자량이 작아 염색액(Coomassie Brilliant Blue G, Daejung, Siheung, Korea)으로 염색한 겔에서는 단백질 밴드(band)의 확인이 어려웠으며 동시에 수행한 bioassay에서만 특정 위치에서 생육저해환(inhibition zone)이 확인되었다.
- 즉, 전개된 겔을 적당한 크기로 자른 후 증류수에서 2시간 동안 세척하였다. 세척한 겔을 MRS 고체배지에 올리고 그 위에 지시균(L. monocytogenes)이 포함된 5 mL의 MRS 배지(0.7% agar 함량)를 부었다. 37ºC에서 12시간 배양 후 생육저해환을 관찰하여 박테리오신의 위치를 확인하였다.
- 유기용매에 대한 박테리오신의 안정성을 확인하기 위해 메탄올(Honeywell B & J, Ulsan, Korea), 에탄올(Honeywell B & J), 아세톤(Honeywell B & J), 아세토니트릴(Honeywell B & J) 및 클로로포름(Avantor Performance Materials, Center Valley, PA, USA)을 사용하였으며 박테리오신 용액 100 μL와 유기용매 100 μL를 섞은 다음 37ºC에서 2시간 반응 후 잔존 활성을 측정하였다.
- 이렇게 조제된 부분 정제 박테리오신의 열 안정성 시험은 60ºC, 80ºC, 100ºC에서 각각 15분, 30분, 60분 및 121ºC에서 15분 동안 방치 후 잔존하는 박테리오신 활성을 측정하였다.
- 이를 30분간 방치한 다음 박테리오신 시료 2 μL를 그 위에 점적한 후 배양하면서 생육저해환(inhibition zone)을 관찰하였다.
- monocytogenes KCTC 3569를 지시균으로 사용하여 시험하였다. 즉, 30 mL 펩톤수(0.1%, w/v)에 지시균을 1% 접종하고 박테리오신 용액을 각각 0, 10, 50, 100 AU/mL되게 첨가한 후 2시간 동안 배양하면서 지시균의 생균수(Log CFU/mL)를 MRS 고체배지 상에서 측정하였다.
- 박테리오신 활성은 한천확산법(agar diffusion method)으로 실시하였으며 활성의 크기는 임의단위(AU/mL)를 사용하여 나타내었다. 즉, 시료원액을 2배씩 연속해서 희석한 다음 활성을 나타내는 최고 희석배수의 역수를 취하여 그 값으로 하였다17). 항균활성 시험의 지시균은 L.
대상 데이터
- E. faecium CJNU 2008로부터 생산된 박테리오신의 작용 양상을 L. monocytogenes KCTC 3569를 지시균으로 사용하여 시험하였다. 즉, 30 mL 펩톤수(0.
- 박테리오신 생산 E. faecium CJNU 2008 및 지시균 L. monocytogenes KCTC 3569는 MRS 배지(BD, Sparks, MD, USA)에서 배양하였으며 작용 양상(mode of action) 시험을 위해서는 Peptone (BD, Sparks, MD, USA)이 사용되었다.
- 즉, 시료원액을 2배씩 연속해서 희석한 다음 활성을 나타내는 최고 희석배수의 역수를 취하여 그 값으로 하였다17). 항균활성 시험의 지시균은 L. monocytogenes KCTC 3569를 사용하였으며 MRS 배지, 37o C에서 12시간 배양한 균 배양액을 5 mL MRS 배지(0.7% agar 함량)에 섞고 현탁한 다음 MRS 고체배지 위에 부었다. 이를 30분간 방치한 다음 박테리오신 시료 2 μL를 그 위에 점적한 후 배양하면서 생육저해환(inhibition zone)을 관찰하였다.
이론/모형
- E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위해 아세톤추출법16)으로 부분정제 한 후 HPLC 에 적용하였다. HPLC 분석 결과, 29분대에서 단백질 피크(peak)가 확인되었으며 그 분획(fraction)은 사용한 지시균(L.
- E. faecium CJNU 2008 균주로부터 생산된 박테리오신의 부분정제를 위해 앞서 언급한 아세톤추출법16)을 이용하였으며 이를 HPLC (high performance liquid chromatography) 정제에 사용하였다. HPLC 정제를 위해 ACE 5 C18(4.
- 이렇게 조제된 부분 정제 박테리오신의 열 안정성 시험은 60ºC, 80ºC, 100ºC에서 각각 15분, 30분, 60분 및 121ºC에서 15분 동안 방치 후 잔존하는 박테리오신 활성을 측정하였다. 박테리오신 활성은 한천확산법(agar diffusion method)으로 실시하였으며 활성의 크기는 임의단위(AU/mL)를 사용하여 나타내었다. 즉, 시료원액을 2배씩 연속해서 희석한 다음 활성을 나타내는 최고 희석배수의 역수를 취하여 그 값으로 하였다17).
- 박테리오신이 포함된 E. faecium CJNU 2008의 배양상등액을 아세톤추출법16)으로 부분 정제한 후 이를 열처리, 유기용매 및 효소에 대한 안정성 시험에 사용하였다. 부분 정제 박테리오신의 조제는 E.
- 분획에서의 박테리오신 활성은 각각의 분획을 20 μL 3차 증류수에 녹인 다음 앞서 언급한 한천확산법으로 확인하였다.
성능/효과
- E. faecium CJNU 2008 균주의 부분정제 박테리오신에 대한 열 안정성을 시험한 결과, 100ºC, 60분 열처리를 제외한 모든 열처리 조건에서 안정성을 보였다(Table 1).
- faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위해 아세톤추출법16)으로 부분정제 한 후 HPLC 에 적용하였다. HPLC 분석 결과, 29분대에서 단백질 피크(peak)가 확인되었으며 그 분획(fraction)은 사용한 지시균(L. monocytogenes KCTC 3569)에 대하여 항균활성을 나타내었다(Fig. 4). 이렇게 정제된 박테리오신은 앞으로 생화학적인 분석 등에 활용할 계획이다.
- 마지막으로 효소(Protease, Lipase 및 α-Amylase)에 대한 안정성을 시험한 결과 Lipase와 α-Amylase 처리에서는 박테리오신의 활성이 유지된 반면 Protease 처리에서는 활성이 완전히 소실되는 것을 확인하였다(Fig. 1).
- 부분 정제된 박테리오신의 분자량 확인을 위하여 Tricine-SDS-PAGE를 실시하였다. 분석 결과, 분자량이 작아 염색액(Coomassie Brilliant Blue G, Daejung, Siheung, Korea)으로 염색한 겔에서는 단백질 밴드(band)의 확인이 어려웠으며 동시에 수행한 bioassay에서만 특정 위치에서 생육저해환(inhibition zone)이 확인되었다. 이 생육저해환은 박테리오신에 기인하는 것으로 추정되며 그 위치는 6.
- 특히, 멸균 조건인 121ºC, 15분에서도 박테리오신 활성 소실이 전혀 없어 열에 대한 안정성이 아주 우수한 것으로 확인되었다. 유기용매에 대한 안정성 시험을 위해 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴 및 클로로포름을 사용하였으며 사용한 모든 유기용매에 대해서 안정성을 나타내었다. 마지막으로 효소(Protease, Lipase 및 α-Amylase)에 대한 안정성을 시험한 결과 Lipase와 α-Amylase 처리에서는 박테리오신의 활성이 유지된 반면 Protease 처리에서는 활성이 완전히 소실되는 것을 확인하였다(Fig.
- 1). 이 결과는 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 항균물질이 단백질성의 박테리오신임을 추가적으로 증명하는 것이다.
- 다만, 최종농도 50과 100 AU/mL 사이에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신의 작용 양상은 정균(bacteriostatic)이 아닌 살균(bactericidal)작용을 나타내고 있음을 의미하는 것이다. 선행연구15)에서 E.
- faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신의 작용 양상(정균 혹은 살균)을 확인하였다. 지시균으로 병원성 세균인 L. monocytogenes 균주를 사용하여 작용 양상을 시험한 결과, 박테리오신 처리 시 생균수가 감소하는 것을 확인하였으며 박테리오신 농도가 높을수록 감소율이 증가하였다(Fig. 2). 다만, 최종농도 50과 100 AU/mL 사이에서는 큰 차이를 보이지 않았다.
- 특히, 멸균 조건인 121ºC, 15분에서도 박테리오신 활성 소실이 전혀 없어 열에 대한 안정성이 아주 우수한 것으로 확인되었다.
후속연구
- 현재까지 케피어에서 분리된 Enterococcus 속 균주가 생산하는 박테리오신에 대한 연구는 극히 드물다. 본 연구에서 규명한 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신은 안정성이 우수한 특성(class I 혹은 class II)을 나타내고 있어 천연보존제로서 산업적 활용도가 클 것으로 판단된다.
- 4). 이렇게 정제된 박테리오신은 앞으로 생화학적인 분석 등에 활용할 계획이다.
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