선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 M. aeruginosa에 대한 현장에서의 즉석 측정이 가능한 정량 유전자 검사법을 개발하고자 하였으며, 이를 위하여 M. aeruginosa를 대상으로 microcystin B (mcyB) 유전자를 이용한 M. aeruginosa 특이 초고속 PCR법을 개발하고자 하였다.
- 본 연구는 M. aeruginosa의 개체 수를 정량이 가능하고, 또한 현장 즉석 측정이 가능한 정량 유전자 검사법을 추구하였으며, 이를 위하여 M. aeruginosa에 단일 유전자로 존재하는 microcystin synthetase 유전자 중 mcyB 유전자의 특이 염기서열을 이용한 mcyB 특이 초고속 정량 PCR법을 개발하고자 하였다.
- 본 연구는 현미경 하에서 Microcystis의 계수를 기준으로 하나 계수는 단 한번의 기준 값을 정하기 위하여 수행하고 이하의 정량은 mcyB 특이 초고속 정량 PCR을 통하여 정확성과 간편성, 그리고 신속성과 이에 따른 현장성을 함께 제고하고자 시도된 것이다.
- 시료를 채취하는 현장에서 바로 mcyB 특이 초고속 PCR에 의한 정량 실험을 수행하기 위하여, 보다 빠르고 쉬운 유전자 분리방법을 고안하고, 이 방법에 의한 DNA시료가정량을 위한 유전자시료가 될 수 있을 것인지를 검토하였다. 적용된 간단한 gDNA의 추출 방법은 99°C에서 끓임과 액체질소를 사용한 얼림의 방법이었으며, 양자 모두 5.
- 현장시료(현장수)는 M. aeruginosa 외의 다른 생물, 환경 DNA (environmental DNA; eDNA) 그리고 다양한 오염원이 존재할 수 있을 것으로 가정되어 이런 요인들이 본 연구에서 제안하는 mcyB 특이 초고속 PCR에 영향을 미칠 수 있는지 실험하였다.
제안 방법
- 100μl의 세포배양액은 끓임과 얼림을 각기 1분, 2분, 3분, 5분, 10분간 처리한 후, 바로 상온으로 조정하고, 각기 1 μl씩을 분자 수 정량을 위한 초고속 PCR의 주형으로 사용하였다.
- 3 × 104 cells/μl) under the microscope, respectively. A black line with a dot (●) was calculated by using a regression based on the quantitatively measured mcyB-specific DNAs and estimated CTs by mcyBspecific Ultra-Rapid PCR, respectively.
- KG07를 배양한 후, 이를 연속 희석하여, 현미경 하의 계수와 각 배양희석액으로부터 gDNA를 3가지 방법으로 분리 또는 추출하여 초고속 정량 PCR에 적용하였다.
- PCR의 온도 및 시간조건은 95°C 초기변성 5분 후, 95°C 변성 30초, 66°C 혼성 30초, 72°C 중합 30초를 30회전 수행하였다. McyB 유전자의 PCR 증폭산물은 TA cloning하여 확보하였다. 방법을 약술하면, Xcm I (NEB, England) 제한효소를 사용하여 절단시킨 pBlueXcm (pBX) vector와 mcyB 특이 PCR 증폭산물을 ligation한 후, 대장균 DH5αF’에 형질전환 시킨 것이며, 이를 항생제 함유 배지에서 군락들을 선발하고, primer TOX2M/TOX2P를 사용한 colony PCR을 통해 대장균 클론을 선별하였다(Yoon et al.
- PCR의 온도 및 시간조건은 95°C 초기변성 5분 후, 95°C 변성 30초, 66°C 혼성 30초, 72°C 중합 30초를 30회전 수행하였다.
- gDNA의 분리는 100 μl의 배양희석액을 각 DNeasy Plant Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 gDNA를 분리하는 방법과 99°C에서 각 1분, 2분, 3분, 5분, 10분으로 처리하는 방법, 그리고 액체질소를 사용하여 각 1분, 2분, 3분, 5분,10분으로 동결시키는 3가지 방법을 사용하였다.
- mcyB 유전자의 정량을 위한 표준기질 DNA를 제작하고자 유전자 클론화를 수행하였다. 먼저 PCR 반응을 통하여 목적 유전자 mcyB의 일부를 확보하였으며, 이때 PCR의 조성은 KG07로부터 순수 분리한 44 ng gDNA를 주형으로 10 μM의 특이 프라이머 쌍, 각 2.
- PCR의 회전 중 각 단계의 시간 단축은 초고속 검출에 있어서 전체 검사 시간을 단축하는데 중요한 요인이다. mcyB 유전자의 최단 시간 검출을 위해, PCR 각 단계의 시간을 3초에서 1초까지 조절하여 초고속 PCR을 시행하였으며, 이 과정에서 최적 조건을 위하여 변성, 혼성, 중합 온도를 또한 조정하였다.
- mcyB 특이 초고속 PCR에서 최적의 혼성 온도를 파악하고자, 재조합 DNA 1.0 × 105 분자 pMcyB-355를 사용하였으며, 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 95°C 초기 변성 30초 후, 95°C 변성 3초, 57-65°C 혼성 3초, 72°C 중합 3초를 표준으로 총 40회전 진행하였다.
- mcyB 특이 초고속 PCR의 최소 검출 시간에서 특이 검출의 한계를 측정하기 위하여 초고속 PCR의 각 회전 중 변성, 혼성, 중합의 시간을 각각 3초에서 1초까지 감소시켜 각 온도와 시간 조건별 CT 값과 CT 값이 측정되는 시간(CT time)을 측정하였다. 이 측정에는 재조합 DNA pMcyB-355를 108 분자부터 100 분자까지 연속 희석하여, 초고속 PCR의 주형으로 사용하였으며, 초고속 PCR의 각 단계에서 시간 및 온도 조건도 가감하여, mcyB 특이 초고속 PCR이 최소 검출 시간 내에 검출 가능한 최소 한계를 추구하였다.
- 계수된 시료는 각 100 μl씩 액체질소로 1분간 동결시킨 후 해동하여 세포 파쇄액을 제조하였다.
- 균질화된 세포 파쇄액을 1/10씩 연속 희석하였으며, 각 세포 파쇄액의 원액 및 희석액 1 μl를 분자 수 정량을 위한 mcyB 특이 초고속 PCR의 초기 주형으로 사용하였다.
- 다수의 현장 시료(현장수)를 채취하고, 이를 현미경하에서 계수하였으며, 동시에 mcyB 초고속 PCR에 의한 정량을 수행하여, 시료 중 M. aeruginosa의 양을 비교하였고, mcyB 특이 유전자의 수에 근거한 정량식을 계수에 의한 정량식으로 보정하고자 하였다.
- 따라서 mcyB 특이 초고속 PCR의 현장실험은 현장 시료(현장수 100 μl)를 담은 1.5ml 원심분리관을 소량의 액체질소가 담긴 용기에 넣고 1분간 동결시킨 후, 해동시키고 균일한 분자 수용액이 되도록 충분히 혼합한 후, 그 중 1/100(1 μl 정량)를 초고속 PCR의 주형으로 사용하게 되었다.
- 또한, 별도로 제안하는 보정법은 현장수를 즉시 현미경 계수하고, 같은 현장수에서 동결 추출된 M. aeruginosa의 gDNA 수용액을 원액 및 1/10씩 연속 희석한 gDNA 수용액들로 만들어 각기 초고속 PCR에 의한 정량을 수행하는 것이다. 이는 추출된 gDNA 용액은 정확한 희석이 가능하기에 동일 시료의 희석에 의한 다수 시료의 측정에 통하여 정확한 계산을 추구하는 것이다.
- 먼저 PCR 반응을 통하여 목적 유전자 mcyB의 일부를 확보하였으며, 이때 PCR의 조성은 KG07로부터 순수 분리한 44 ng gDNA를 주형으로 10 μM의 특이 프라이머 쌍, 각 2.5 mM dNTP, 10x PCR buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 25 μM MgCl2,pH 8.3), Taq polymerase (Geneclone, 1 Unit)로 총 20 μl이었다.
- 먼저, 3개의 현장시료를 현미경 하에서 M. aeruginosa의 농도를 계수한 결과, 6.8 × 103 세포/μl (6.8 × 106 세포/ml),5.0 × 104 세포/μl, 2.0ⅹ 105 세포/μl로 계수되었으며, 이 시료들은 mcyB 특이 초고속 PCR을 위하여, 각 시료의 100μl를 정량하여, 1분간 액체질소에 의한 동결을 시행하고,해동한 후 균질화된 세포파쇄액 1 μl를 초고속 PCR에 사용하였다.
- 먼저, 현미경 하의 계수는 배양액 및 연속 희석한 세포액 1 ml를 Raft-sedwick chamber (Sournia, 1978)에 넣고, 생세포의 검경에 의한 계수로 해당 세포의 농도를 구하였고,이와 병행하여 크리스탈 바이올렛에 의한 염색 및 포름알데히드에 의한 고정 후 검경하여 계수하였다. 양자는 약간의 불일치를 보였으나 생세포의 검경에 의한 계수를 우선으로 하였다(supplement Table 2).
- 배양된 KG07을 현미경 하에서 계수하여, 5.0 × 106 세포/ml로 조정하였고, 이를 5.0 × 105 세포/ml, 5.0 × 104 세포/ml, 5.0 × 103 세포/ml (5.0 세포/μl)가 되도록 1/10씩 연속 희석하였다.
- 배양된 M. aeruginosa strain KG07 (6.3 × 106 세포/ml로 계수)을 경기대학교 내 호수에서 채취한 현장수로 1/10씩 연속 희석하였으며, 최종 세포 농도는 5.0 × 106 세포/ml부터 5.0 × 103 세포/ml까지 조정하였다.
- 배양된 M. aeruginosa strain KG07를 15,000 rpm에서 15분간 원심분리 한 후 DNeasy Plant Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 각각 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 spectrophotometer (Eppendorf, Germany)로 농도를 정밀 정량측정 후, -20°C에서 보관하며 연구에 사용하였다.
- 분리된 gDNA 용액 및 세포 파쇄액의 각 1 μl는 mcyB 특이 초고속 PCR의 주형으로 사용하였으며, 구해진 CT 값을 기준으로 각각 함유하고 있는 분자 수를 계산하였다.
- time)을 측정하였다. 이 측정에는 재조합 DNA pMcyB-355를 108 분자부터 100 분자까지 연속 희석하여, 초고속 PCR의 주형으로 사용하였으며, 초고속 PCR의 각 단계에서 시간 및 온도 조건도 가감하여, mcyB 특이 초고속 PCR이 최소 검출 시간 내에 검출 가능한 최소 한계를 추구하였다.
- 0 × 100 분자까지 각기 사용하였다. 이 표준시료들은 각기 mcyB 특이 초고속 PCR로 CT 값을 측정하고 검출 한계 및 표준 정량식을 구하였다(Fig. 4).
- 이들 연속 희석된 시료들은 15,000 rpm, 15분의 원심분리로 침전세포들을 회수하였으며, DNeasy Plant Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 각기 gDNA의 분리에 사용되었다(최종량은 각기 100 μl).
- 25 μM에서 각기 측정하여 CT (Threshold Cycles)값이 가장 빠르게 측정되는 것을 선정하였다. 이때 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 상기의 표준조건부터 최적 혼성온도와 시간을 CT값과 최대 형광값을 기준으로 재조정하였다.
- , 2015). 이러한 연구들은 모두 현미경에 의한 남조류 계수법의 부정확함을 개선하고자 하였으며, 또는 대량 검사가 가능한 방법을 찾기 위하여 유전자 검사법을 제시하였다.
- 적용된 간단한 gDNA의 추출 방법은 99°C에서 끓임과 액체질소를 사용한 얼림의 방법이었으며, 양자 모두 5.0 ×106 세포/ml로 계수된 KG07의 100 μl를 사용하였다.
- 정량의 표준은 OD260 정량으로 구한 재조합 DNA pMcyB-355의 양을 계산에 의하여 1.0 × 108 분자/μl로 조정한 용액이었으며, 정량선을 구하기 위하여 이를 연속 1/10 희석한 108 - 100 분자/μl의 용액들을 제조하였고, 이들을 각기 초기 주형으로 최적화된 mcyB 특이 초고속 PCR에 사용하였다.
- 제안하는 mcyB 특이 초고속 PCR에 기반한 M. aeruginosa의 정량 측정법의 수행과정을 약술하면; 먼저, 다수의 현장 수 100 μl를 정량하여 각 1.5 ml 원심분리관에 넣고, 이들을 액체질소로 1분간 동결시킨 후 해동하여 균질화 시킨 후 그 중 1 μl를 정량하여 바로 mcyB 특이 초고속 PCR로 정량하는 것이다.
- 초고속 PCR에서 mcyB 특이 프라이머들의 최적 농도를 구하기 위하여 각 4 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.25 μM의 농도로 실험하였으며, 각 3회 반복하여 결과를 판정하였다.
- 초고속 PCR은 GENECHECKER (Genesystem, Korea)를 사용하였으며, PCR 조성은 2× Rapi mix (Genesystem, Korea)를 사용하여 1 μl templated DNA, 각 1 μl primer를 포함하여 총 10 μl로 조성하였다.
- 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 95°C 초기 변성 30초 후, 95°C 변성 3초, 혼성 3초, 72°C 중합 3초를 표준으로 하였고, 총 40회전을 진행하였다.
- 초고속 PCR의 주형으로 재조합 DNA pMcyB-355를 사용하였으며, 정량 된 DNA의 분자 수를 계산하여 1.0 × 108 분자를 기준으로 연속 희석하여 초고속 PCR에 사용하였다.
- 최적 혼성 온도는 57-65°C 범위에서 확인하였으며,최적의 프라이머 농도는 4 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM,0.25 μM에서 각기 측정하여 CT (Threshold Cycles)값이 가장 빠르게 측정되는 것을 선정하였다.
- 최적화된 mcyB 특이 초고속 PCR에서 mcyB 유전자의 초기 주형양에 대한 검출 최소 한계를 측정하였다. 사용된 초기 주형은 pMcyB-355 재조합 DNA이었으며, 1.
- 한편, 배양액(M. aeruginosa strain KG07, 5.0 × 106 세포/ml) 및 연속 희석된 배양액의 각 100 μl씩을 별도 원심분리관에 옮기고, 이들을 액체질소로 1분간 동결시킨 후 해동하여 세포 파쇄액을 각기 제조하였다.
- 현미경하의 계수는 시료 또는 시료 희석액 1 ml를 Raftsedwick chamber (Sournia, 1978)에 넣고, 검경에 의하여 생세포수를 계수하였다.
- 현장수로 희석된 각 농도의 KG07들은 1 ml를 정량 하여 각 gDNA로 분리하였으며, 분리된 gDNA 1 μl를 초고속 PCR의 주형으로 사용하였다.
대상 데이터
- PCR에 사용된 프라이머는 Microcystis aeruginosa의 mcyB 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 TOX2M(5’-CCAATCCCTATCTAAACACAGTAACTCGG-3’),TOX2P (5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’)를 선정하여 사용하였으며(Dittmann et al., 1999), 이를 초고속 PCR에서도 동일하게 사용하였다(Supplement Fig. 1).
- 대장균에서 pMcyB-355DNA는 Fast DNA-spinTM Plasmid DNA Purification kit(iNtRON, Korea)로 분리하였으며, 분리된 DNA는 OD260(Optical Density 260 nm)으로 정량 한 후, -20°C에서 보관하며 연구에 사용하였다.
- 배양된 KG07 (6.3 × 106 세포/ml로 계수)을 경기대학교 내 호수에서 채취한 현장수로 1/10씩 연속 희석 하였으며, 사용된 현장수는 Microcystis가 없음을 확인하였다.
- 본 연구에서 사용한 M. aeruginosa는 낙동강의 강정 고령보 인근인 경북 칠곡군 기산면 행정리에 위치한 제2왜관교에서 채집된 것이다. 이는 광학현미경(Axio Imager A2; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 100배-1000배 하에서 관찰되었고, Komárek and Anagnostidis (2008)을 참고하여 동정하였다.
- 사용된 초기 주형은 pMcyB-355 재조합 DNA이었으며, 1.0 × 108분자를 1/10씩 연속 희석하여 1.0 × 100 분자까지 각기 사용하였다.
- 이 실험을 위하여 새로이 채집된 현장수는 현미경하에서 M. aeruginosa가 각기 4.4 × 104 세포/μl, 5.3 × 102 세포/μl로 계수되었으며 각 시료는 100 μl씩을 정량하여 1분간 액체질소에 의한 동결을 시행하고 해동한 후, 균질화된 세포파쇄액과 각기 1/10씩 연속 희석한 파쇄희석액 각 1 μl를 mcyB 특이 초고속 정량 PCR에 사용하였다(Fig. 9).
- 이는 광학현미경(Axio Imager A2; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 100배-1000배 하에서 관찰되었고, Komárek and Anagnostidis (2008)을 참고하여 동정하였다. 파스퇴르 피펫으로 한 개의 군체를 단일 분리하여 BG-11 배지에 배양 후, M. aeruginosa strain KG07이라 명명하였으며, 대량 배양하여 이후 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 0 × 108 분자/μl로 조정한 용액이었으며, 정량선을 구하기 위하여 이를 연속 1/10 희석한 108 - 100 분자/μl의 용액들을 제조하였고, 이들을 각기 초기 주형으로 최적화된 mcyB 특이 초고속 PCR에 사용하였다. 표준 mcyB 분자들에 의해 초고속 PCR로 구해진 각 CT 값은 회귀식(regression equation) 작성에 사용되었으며, 이를 이용하여 모든 CT 값은 초기 주형의 분자 수로 계산할 수 있었다.
성능/효과
- 1.0 × 103 mcyB 분자를 기질로 사용한 초고속 PCR에서 각 혼성 시간을 3초로 조정한 결과, CT값은 29.01회전으로증가되었으며, CT time은 8분 1초로 mcyB 특이 유전자의 증폭을 확인 할 수 있었다.
- 4.4 × 104 세포/μl로 계수된 시료의 경우, 세포 파쇄액을 사용한 mcyB 특이 초고속 PCR은 CT값이 17.06회전으로 측정되었으며, 이의 1/10희석액을 사용한 CT값의 측정을 통하여 회귀식, y = -3.51x + 33.182 (R2 = 0.9925)이 계산되었다.
- 5.0 × 103 세포/μl, 5.0 × 102 세포/μl, 5.0 × 101 세포/μl에 대한 mcyB 특이 초고속 PCR들의 CT 값은 25.90회전, 30.07회전, 37.08회전으로 측정되었으며, 5.0 × 100 세포/μl의 경우는 CT 값이 측정되지 않았다.
- Based on these reasons, the optimal concentration of primers was selected as being 2 μM (CT = 21.04 ± 0.55 cycles,F = 256.67 ± 11.93).
- 각 시료는 원액 및 1/10씩 연속 희석된 세포 파쇄액을 이용한 mcyB 특이 초고속 PCR에서 각기 CT값이 측정되었으며, 이 CT값들도 각기 독립적인 회귀식을 계산할 수 있었다. 4.
- 01회전으로증가되었으며, CT time은 8분 1초로 mcyB 특이 유전자의 증폭을 확인 할 수 있었다. 같은 조건에서 각 혼성 시간만 2초, 1초로 감소시킨 초고속 PCR들은 해당 CT값이 다소 증감하는 결과를 보여주었으나, 해당 CT time은 1초의 경우 분명한 감소세를 보여주었다(Fig. 3).
- 결국, mcyB 특이 초고속 PCR에서 최적 프라이머의 농도는 CT 값(CT= 21.04 ± 0.55), 최종 형광값(256.67 ± 11.93) 모두에서 우수한 결과를 보인 2 μM을 최적 프라이머 농도로 결정하였다(Fig. 2).
- 계수 후 희석된 M. aeruginosa strain KG07의 개체 수는 동일 시료에서 추출된 gDNA와 동결 파쇄한 세포 파쇄액에서 계산된 초기 주형의 분자 수와 비교 분석되었다.
- 그러나, 변성, 혼성, 중합 시간을 각기 1초, 2초, 1초로 단축한 결과, DNA 증폭을 나타내는 형광곡선은 초기 주형량에 따라 정상적 증가를 보여 주었으나, 변성, 혼성, 중합 시간을 각기 1초, 1초, 1초로 단축한 최단 시간의 열변환(thermocycling)의 조건은 DNA 증폭을 나타내는 형광곡선이 크게 왜곡되는 것이 자주 나타나는 현상을 발견하게 되었고, 이 이유로 mcyB 특이 초고속 PCR은 시스템의 안정성도 고려하여 각 회전의 변성, 혼성, 중합 시간을 각기 1초, 3초, 1초로 수행하는 것을 최적화의 조건으로 정하게 되었다(Supplement Fig. 2).
- 녹조현상이 일어난 수역(광교저수지, 수원시)으로부터 채집한 현장시료(현장수)를 현미경 하에서 계수한 결과, 각각 5.3 × 102 세포/μl, 4.4 × 104 세포/μl의 Microcystis species로 계수되었다.
- 먼저, 현미경에 의한 계수에서 2.3 × 103 세포/μl인 배양액은, 동량의 분리된 gDNA를 이용한 mcyB 특이 초고속 정량 PCR에서 1.3 × 104 mcyB 분자/μl로 계산되었으며(CT =23.89 ± 0.44), 99°C 처리 후 바로 정량된 것은 6.7 × 103 mcyB 분자/μl (CT = 24.93 ± 0.80)로, 액체질소 동결 처리 후 바로 정량된 것은 7.3 × 104 mcyB 분자/μl (CT = 21.29 ± 0.02)로 계산되었다(Fig. 6).
- 반복 실험 결과, 액체질소로 동결 처리한 방법은 부유되는 Microcystis 세포를 원심분리로 모아 gDNA를 분리하는 방법에 비하여 보다 손실이 적었으며, 99°C로 끓이는 방법보다 안정적이었고, 액체질소에 의한 동결 처리 시간도 1분 이상이면 거의 균일한 값으로 측정되었다(자료 미제시).
- 본 실험에서 6.8 × 103 세포/μl (6.8 × 106 세포/ml)로 계수된 현장수의 초고속 PCR의 CT값은 30.56회전이었기에, x축 6.8 × 103 분자/μl와 y축 30.56회전이 만나는 지점까지 회귀식을 수직 이동시키는 것을 제안하는 것이며, 이로써 보정된 정량식은 y = -3.4905x + 43.937이 될 것이다.
- 상기의 결과는 현미경의 의한 계수가 3가지 시료의 전처리 후 얻어진 DNA 주형에 대한 mcyB 특이 유전자의 정량값보다 상대적으로 낮음을 보여주고 있으며, 고농도의 세포배양액을 다시 희석하여 현미경하에서 계수해 본 결과, 배양희석액 중 Microcystis 세포 수는 희석비대로 감소되지않고 이 과정에서 상당한 오차가 발생할 수 있음이 발견되었다. 이는 Microcystis와 같은 생물체를 균일하게 희석하는 것은 용해되어 있는 분자를 희석하는 것과 달리 매우 어려운 것으로 판단하게 되었다.
- 5). 상기의 범위에서, 초기분자량을 10 : 1로 하여 구해진 각 초고속 PCR의 CT값 간의 차, 즉, dCT10은 평균 3.53회전으로 계산되었다.
- 상기의 조건에서 mcyB 유전자는 초기 주형 1.0 × 108 분자부터 1.0 × 100 분자까지 각 CT 값에 비례하는 정확한 증폭이 이루어졌으며, 모두 82.75°C로 일치된 Tm (Temperature of midpoint)을 보여주었다.
- , 2014). 선별된 클론들의 재조합 DNA는 양방향 염기서열의 결정 후(Solgent,Korea), pMcyB-355라 명명하였으며, 이 355염기 크기의 염기서열은 GenBank의 염기서열 분석에서 M. aeruginosa stainB-47 (GenBank, AB474594)의 mcyB 유전자와 가장 유사한 것으로 분석되었으나, 동일한 서열이 아니었다(identity, 354/355 nts). 따라서, M.
- 아울러, mcyB 특이 주형 대신 증류수를 넣어준 mcyB 특이 초고속 PCR은 46회전 부근에서 CT선을 넘는 이상증폭이 관찰되었으나, 그 Tm값은 정상 Tm과 4°C수준의 차이를 보이는 86.25°C로 측정되어 특이적 증폭이 아님을 쉽게 판단할 수 있었다(N; none template, Fig. 4)
- 100μl의 세포배양액은 끓임과 얼림을 각기 1분, 2분, 3분, 5분, 10분간 처리한 후, 바로 상온으로 조정하고, 각기 1 μl씩을 분자 수 정량을 위한 초고속 PCR의 주형으로 사용하였다. 연속 희석에 의하여 세포의 농도를 조정하고 이에 따른 끓임과 얼림의 처리 효과도 각기 측정되었으며, 현장수를 사용한 현장 정량 실험에서도 그 유효성을 입증하였다.
- 이 결과는 계수된 세포 수와 mcyB 특이 초고속 PCR에 의하여 계산된 세포 수와 약간의 차이만 있음을 보여주며, 101 세포/μl 이상에서 현장수를 사용한 정량이 충분히 가능한 범위에 있음을 보여주었다(Fig. 7).
- 이 계산된 정량 값은 현미경 하에서 계수한 값에 비하여 97.6% 감소(6.8 × 103 세포/μl), 97.2% 감소(5.0 × 104 세포/μl), 94% 감소(2.0 × 105 세포/μl)로 계산되었다.
- 재조합 DNA pMcyB-355를 이용한 회귀식(Regressionequation; y = -3.4905x + 38.273, R2 = 0.9977)을 이용하여 계산된 정량 값은 3.5 × 103 분자/μl (5.0 × 103 세포/μl), 2.2 ×102 분자/μl (5.0 × 102 세포/μl), 2.1 × 100 분자/μl (5.0 × 101 세포/μl)으로 나타났으며, 각기 계수된 세포 수에 비하여약 1/2로 감소된 분자수로 계산되었다.
- 전반적으로 초기 주형 1.0 × 108 분자부터 1.0 × 101 분자까지는 각 분자 수와 해당 CT 값과 매우 정확한 연관관계를 보여주었으며(Regression equation: y = -3.4905x + 38.273 [y =numbers of initial mcyB molecules]; Regression coefficient:R2 = 0.9977; Amplification efficiency (E value) = 93.41 %),이 범위가 mcyB 특이 초고속 PCR에서 정량 가능 범위로 판단하였다(Fig. 5).
- 0 × 102 세포(분자)/μl 이상일 경우 CT 값은 30회전 내가 되며, 이에 걸리는 시간은 10분내로 측정되었다. 최대 10개 시료를 동시에 정량 할 수 있으며, 시료 채수 1분, 동결파쇄 1분, 해동 분주 1분으로, 10여분이 소요되는 초고속 PCR 정량은 총 20-30분에 현장에서 완료될 수 있을 것으로 기대된다.
- 최적조건하에서 mcyB 특이 초고속 PCR의 최소 검출 시간을 측정한 결과, 초기 주형으로 1.0 × 108 mcyB 분자가 주어진 경우 9.80 회전 만에 CT 선에 도달하였으며 이 시간 즉, CT time은 3분 21초(초기 변성 30초 포함)이었다.
- 측정된 CT 값은 순서대로 30.56, 27.32, 24.00으로 나타났으며, 이를 mcyB 특이 유전자의 수에 근거한 정량식(회귀식; y = -3.4905x + 38.273)에 적용하면, 순서대로 1.6 × 102 mcyB 분자/μl, 1.4 × 103 mcyB 분자/μl, 1.2 × 104 mcyB 분자/μl로 계산되었다.
- 특이 프라이머의 최적 농도는 가장 빠른 CT 값과 최종 형광 값을 기준으로 판단 하였으며, 최종 농도 4 μM에서 초고속 PCR은 가장 빠른 21.04회전의 CT 값을 보였으나, 최종 형광 값은 비교적 낮게 측정되었으며, 전기영동 결과(자료 미제시)에서도 최종농도 4 μM의 초고속 PCR의 산물들은 상대적으로 약한 증폭량을 보였기에 최적조건에서 제외하였다.
- 한편, PCR 반응에서 중합 시간 역시 3초에서 2초, 1초로 감소시킨 결과, 1초의 중합 시간을 준 초고속 PCR에서 CT 값은 31.16회전으로 측정되어 미세하게 증가됨을 보여주었으나, CT time은 7분 23초로 크게 감소하는 것으로 측정되었다. 이는 mcyB 특이 초고속 PCR의 각 변성, 혼성, 중합 시간을 각 1초로 설정하여도 특이 증폭이 가능함을 보여준 것이다(Fig.
- 한편, 초기주형 1.0 × 100 분자의 경우, mcyB 특이 초고속 PCR에서 나타난 평균 CT 값은 38.07회전이었고, 평균 CT time은 11분 36초로 측정되었으나, 초기 주형 1.0 × 100 분자는 사실 1개 분자에 해당되는 극단의 희석 때문인지 특이 증폭 자체가 되지 않는 결과도 자주 발생되었다.
- 현 시점에서 현미경하에서 계수한 값을 기준으로 mcyB 특이 초고속 PCR의 계산 값을 맞추는 보정이 최선이라 판단되었으며, 보정하는 방법으로 간단히, 재조합 DNA pMcy355의 결과로 계산된 표준 회귀식(y = -3.4905x + 38.273; Fig. 5)을 상하로 조정하는 것을 고안하게 되었다.
- 80 회전 만에 CT 선에 도달하였으며 이 시간 즉, CT time은 3분 21초(초기 변성 30초 포함)이었다. 형광의 강도는 25회전(CT time으로 7분 40초) 전후에 최대형광값(증폭된 DNA량)을 나타내었으며, 50회전의 초고속 PCR은 16분 35초에 종료되었다.
후속연구
- 계수된 M. aeruginosa의 보다 정확한 농도의 측정은 상기의 방법으로 gDNA 추출에 의한 mcyB 특이 초고속 PCR을 적용할 수 있으며, 한번의 초고속 PCR에 의한 정량이 적용된다면 다수의 시료에 대하여 한번의 반응으로 많은 수의 시료들을 간단한 동결 추출에 의한 mcyB 특이 초고속 PCR에 의하여 빠르게 정량 할 수 있을 것이다.
- 9977)과 y-절편에서는 차이를 보여주나 그 기울기에서는 높은 유사성을 보이고 있다. 이 현장시료에서 계산된 회귀식들은 각기 동일 사이트의 다수 시료들에 대하여 mcyB 특이 초고속 PCR의 CT값 측정을 통하여 바로 세포 수를 산출해 낼 수 있는 기준이 될 수 있을 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.