RAW 264.7 대식세포에서 Nrf2/HO-1 신호 전달계 활성화와 MAPKs 경로 억제를 통한 소청자와 소청2호의 LPS 매개 염증성 및 산화적 스트레스 반응의 억제 Socheongja and Socheong 2 Extracts Suppress Lipopolysaccharide-induced Inflammation and Oxidative Stress in RAW 264.7 Macrophages through Activating Nrf2/HO-1 Signaling and Suppressing MAPKs Pathway원문보기
염증 반응과 산화적 스트레스는 다양한 질환의 발생과 진행에 중요한 역할을 담당한다. 따라서 염증과 산화적 스트레스를 동시에 억제할 수 있는 소재의 발굴은 인체 질환 제어에 매우 유용하게 적용될 수 있다. 본 연구의 목적은 RAW 264.7 대식세포에서 검은콩 품종인 소청자와 소청2호 추출물이 염증성 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위함이다. 본 연구의 결과에 의하면 소청자 및 소청2호 추출물은 LPS에 의한 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하여 NO와 $PGE_2$의 생성을 억제하였으며, $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$와 같은 염증성 cytokine의 분비와 발현을 감소시켰다. 또한 소청자 및 소청2호 추출물은 LPS로 자극된 세포 내 ROS 축적을 유의적으로 차단시켰고, Nrf2와 HO-1 발현을 증가시켰다. 또한 LPS에 의해 유도된 MAPKs의 활성화도 소청자 및 소청2호 추출물에 의하여 억제되었다. 결론적으로 소청자 및 소청2호 추출물은 RAW 264.7 대식세포에서 MAPKs 경로를 차단시킴으로써 LPS-유도 염증 및 산화 반응에 대한 보호 역할을 할 수 있으며, 이러한 효과에는 최소한 Nrf2/HO-1 경로 활성화가 관련되어 있었다. 이러한 결과를 고려해 볼 때 소청자 및 소청2호 추출물은 대식세포의 과다 활성화로 인한 염증성 및 산화적 반응 차단에 잠재적인 효과가 있음을 일 수 있었다.
염증 반응과 산화적 스트레스는 다양한 질환의 발생과 진행에 중요한 역할을 담당한다. 따라서 염증과 산화적 스트레스를 동시에 억제할 수 있는 소재의 발굴은 인체 질환 제어에 매우 유용하게 적용될 수 있다. 본 연구의 목적은 RAW 264.7 대식세포에서 검은콩 품종인 소청자와 소청2호 추출물이 염증성 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보기 위함이다. 본 연구의 결과에 의하면 소청자 및 소청2호 추출물은 LPS에 의한 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하여 NO와 $PGE_2$의 생성을 억제하였으며, $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$와 같은 염증성 cytokine의 분비와 발현을 감소시켰다. 또한 소청자 및 소청2호 추출물은 LPS로 자극된 세포 내 ROS 축적을 유의적으로 차단시켰고, Nrf2와 HO-1 발현을 증가시켰다. 또한 LPS에 의해 유도된 MAPKs의 활성화도 소청자 및 소청2호 추출물에 의하여 억제되었다. 결론적으로 소청자 및 소청2호 추출물은 RAW 264.7 대식세포에서 MAPKs 경로를 차단시킴으로써 LPS-유도 염증 및 산화 반응에 대한 보호 역할을 할 수 있으며, 이러한 효과에는 최소한 Nrf2/HO-1 경로 활성화가 관련되어 있었다. 이러한 결과를 고려해 볼 때 소청자 및 소청2호 추출물은 대식세포의 과다 활성화로 인한 염증성 및 산화적 반응 차단에 잠재적인 효과가 있음을 일 수 있었다.
Inflammatory response and oxidative stress play critical roles in the development and progression of many human diseases. Therefore, a great deal of attention has been focused on finding functional materials that can control inflammation and oxidative stress simultaneously. The purpose of this study...
Inflammatory response and oxidative stress play critical roles in the development and progression of many human diseases. Therefore, a great deal of attention has been focused on finding functional materials that can control inflammation and oxidative stress simultaneously. The purpose of this study was to investigate the effects of Socheongja and Socheong 2, Korean black seed coat soybean varieties, on the inflammatory and oxidative stress induced by lipopolysaccharide (LPS) in RAW 264.7 macrophages. Our data indicated that the extracts of Socheongja (SCJ) and Socheong 2 (SC2) significantly suppressed LPS-induced production of nitrite oxide (NO) and prostaglandin $E_2$, key pro-inflammatory mediators, by suppressing the expression of inducible NO synthase and cyclooxygenase-2. It was also found that SCJ and SC2 reduced the LPS-induced secretion of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis $factor-{\alpha}$ and $interleukin-1{\beta}$, which was concomitant with a decrease in the protein levels. In addition, SCJ and SC2 markedly diminished LPS-stimulated intracellular reactive oxygen species accumulation, and effectively enhanced nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase (HO)-1 expression. Furthermore, LPS-induced activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) was abrogated by SCJ and SC2. Taken together, these data suggest that SCJ and SC2 may offer protective roles against LPS-induced inflammatory and oxidative responses in RAW 264.7 macrophages through attenuating MAPKs pathway, and these effects are mediated, at least in part, through activating Nrf2/HO-1 pathway. Given these results, we propose that SCJ and SC2 have therapeutic potential in the treatment of inflammatory and oxidative disorders caused by over-activation of macrophages.
Inflammatory response and oxidative stress play critical roles in the development and progression of many human diseases. Therefore, a great deal of attention has been focused on finding functional materials that can control inflammation and oxidative stress simultaneously. The purpose of this study was to investigate the effects of Socheongja and Socheong 2, Korean black seed coat soybean varieties, on the inflammatory and oxidative stress induced by lipopolysaccharide (LPS) in RAW 264.7 macrophages. Our data indicated that the extracts of Socheongja (SCJ) and Socheong 2 (SC2) significantly suppressed LPS-induced production of nitrite oxide (NO) and prostaglandin $E_2$, key pro-inflammatory mediators, by suppressing the expression of inducible NO synthase and cyclooxygenase-2. It was also found that SCJ and SC2 reduced the LPS-induced secretion of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis $factor-{\alpha}$ and $interleukin-1{\beta}$, which was concomitant with a decrease in the protein levels. In addition, SCJ and SC2 markedly diminished LPS-stimulated intracellular reactive oxygen species accumulation, and effectively enhanced nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase (HO)-1 expression. Furthermore, LPS-induced activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) was abrogated by SCJ and SC2. Taken together, these data suggest that SCJ and SC2 may offer protective roles against LPS-induced inflammatory and oxidative responses in RAW 264.7 macrophages through attenuating MAPKs pathway, and these effects are mediated, at least in part, through activating Nrf2/HO-1 pathway. Given these results, we propose that SCJ and SC2 have therapeutic potential in the treatment of inflammatory and oxidative disorders caused by over-activation of macrophages.
본 연구에서는 LPS에 의하여 자극된 RAW 264.7 대식세포 모델을 대상으로 검은콩 품종인 소청자와 소청2호의 항산화 및 항염증 효능을 평가하였다. 이를 위하여 LPS 자극에 의한 염증성 매개인자 및 cytokine의 생성 증가에 미치는 소청자 및 소청2호 추출물의 억제 효과와, ROS의 생성 및 Nrf2/HO-1 신호계에 미치는 두 추출물의 영향을 조사하였다.
제안 방법
본 연구에서는 검은콩 품종 중에서 이들 두 품종을 선정하여 이들 추출물의 항염증 및 항산화 효능을 검증하였다. 이를 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 염증성 매개인자(NO 및 PGE2)와 염증성 cytokine (TNF-α 및 IL-1β)의 생성 억제 정도와, 염증성 반응 매개 ROS의 생성 억제 여부 및 강력한 항산화 활성 신호계로 알려진 Nrf2/HO-1 신호계에 미치는 이들 추출물의 영향을 조사하였다. 아울러 이러한 항염증 및 항산화 효능과 연관된 세포 내 주요 신호 전달계인 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)의 관련성 여부를 추가로 조사하였다.
이상에서 관찰된 소청자 및 소청2호 추출물의 항염증 및 항산화 효능과 연관된 세포 내 신호 전달계에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3가지 MAPKs의 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위하여 RAW 264.
대상 데이터
본 연구에서는 국립식량과학원(National Institute of Crop Science, Rural Development Administration, Korea)에서 분양받은 소청자 및 소청2호를 이용하여 실험을 진행하였으며, 유효성분을 보다 많이 함유할 수 있는 저온용출 방식과 25kg의 대량생산을 위한 추출법을 표준화하여 추출물을 제조하였다. 소청자 및 소청2호 추출물은 2시간 동안 저온 처리된 종자를 발아시켜 콩나물 제조기를 이용하여 실온, 암실 조건에서 6일 동안 재배하여 시료로 사용하였으며, 이를 분쇄하여 정제수와 1:1 비율로 희석하였다.
실험을 진행하기 위해 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS, WELGENE Inc., Daegu, Korea)과 L-glutamine (2 mM), penicillin (100 U/ml) 및 streptomycin (100 U/ml, WelGENE Inc.)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, WELGENEInc.)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 Statistical Package for the Social Sciences(SPSS) 통계 프로그램을 이용하여 평균 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, p<0.05 수준에서 Student’s t-test와 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 결과에 대한 유의성을 검증하였다.
이론/모형
LPS 자극에 의한 ROS 생성에 미치는 각 추출물의 억제 효과를 조사하기 위하여 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) 염색법을 이용하였다. 이를 위하여 소청자 및 소청2호 추출물을 1시간 전처리한 후 LPS (100 ng/ml)를 처리하여 6시간 동안 배양하였다.
소청자 및 소청2호 추출물의 세포독성 여부를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에 다양한 농도의 추출물을 단독 또는 LPS와 동시 처리한 후에 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 소청자 추출물이 소청2호 추출물에 비하여 최고 처리 농도인 1 mg/ml 처리군에서 약간의 세포독성을 보였으나, 큰 차이는 없었다(Fig.
성능/효과
결론적으로, 본 연구의 결과에서는 소청자 및 소청2호 추출물이 염증성 매개인자와 cytokine의 생성과 ROS의 생성을 억제함으로서 항염증 및 항산화 효과를 나타냄을 보여주었다. 아울러 이 과정에서 Nrf2/HO-1 신호전달 활성 증대 및 MAPKs 신호경로의 활성 감소가 동반되었다.
4B). 따라서 소청자 및 소청2호 추출물은 항염증효과 뿐 만 아니라 항산화력도 매우 우수함을 알 수 있었다.
7 대식세포에서 NO 및 PGE2의 생성이 유의적으로 증가되었으며, 세포 독성이 없는 범위의 소청자 및 소청2호 추출물이 전처리된 조건에서는 이들의 방출이 현저히 저해되었다. 또한, Western blot 분석의 결과에 따르면 소청자 및 소청2호 추출물의 전처리는 LPS로 유도된 iNOS 및 COX-2 발현을 감소시켰으며, ELISA 결과에서 소청자 및 소청2호 추출물이 LPS로 유도된 TNF-α 및 IL-1β 생성 또한 억제시켰음을 알 수 있었다. 이러한 결과와 일치되게 소청자 및 소청2호 추출물이 TNF-α 및 IL-1β의 단백질 수준을 유의적으로 억제하였음을 확인하였다.
소청자 및 소청2호 추출물의 항염증 효과가 MAPKs 경로를 통해 매개되는지 여부를 조사하기 위해, LPS에 의하여 유도된 MAPKs 계열 단백질의 활성에 미치는 두 추출물의 영향을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면, 소청자 및 소청2호 추출물의 전처리는 LPS에 의하여 유발된 3가지 MAPKs (ERK, JNK 및 p38 MAPK)의 인산화를 완벽하게 억제하였다. 비록 nuclear factor-κB를 포함한 염증성 반응에 중요한 역할을 하는 또 다른 세포 내 신호전달계에 대한 평가도 추가적으로 이루어져야겠지만, 본 연구의 결과는 소청자 및 소청2호 추출물에 의한 항염증 효능에 MAPKs 활성의 차단이 최소한 관여하고 있음을 의미한다.
후속연구
아울러 이 과정에서 Nrf2/HO-1 신호전달 활성 증대 및 MAPKs 신호경로의 활성 감소가 동반되었다. 두 추출물에 의한 항염증성 및 항산화적 신호 경로 연결에 대한 추가적인 연구가 필요하지만, 소청자 및 소청2호 추출물이 다중 신호 전달 경로조절을 통하여 세포독성에 대한 차단효과를 지닐 수 있는 유용한 식의약 소재로서의 개발 가능성이 높음을 보여주었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대식세포(macrophage)가 생체방어에 대비하는 방법은 무엇인가?
염증반응은 물리적인 상처나 생체에 박테리아 독소, 바이러스 등의 외부 물질에 감염되었을 때 면역세포가 이를 인지하여 염증 유도 인자들을 분비함으로써 나타내는 생체 방어 기전 중 하나이다[34, 40]. 특히 대식세포(macrophage)는 그람음성세균(Gram negative bacteria) 표층의 peptide glycan을 둘러싸는 외막의 중요 구성성분 중의 하나인 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)등에 의해 활성화되어 염증반응을 일으키는데, 이 때 염증매개인자(pro-inflammatory mediators)인 nitric oxide (NO)나 prostaglandin E2 (PGE2)와 pro-inflammatory cytokine인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 등을 분비하여 생체방어에 대비한다[3, 9, 21]. 생체 내에서의 NO의 일반적인 기능과는 달리 inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 발현 증가에 의한 NO의 과잉생산은 혈관투과성과 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라, DNA 손상과 돌연변이를 일으킬 수 있다.
염증반응은 무엇인가?
염증반응은 물리적인 상처나 생체에 박테리아 독소, 바이러스 등의 외부 물질에 감염되었을 때 면역세포가 이를 인지하여 염증 유도 인자들을 분비함으로써 나타내는 생체 방어 기전 중 하나이다[34, 40]. 특히 대식세포(macrophage)는 그람음성세균(Gram negative bacteria) 표층의 peptide glycan을 둘러싸는 외막의 중요 구성성분 중의 하나인 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)등에 의해 활성화되어 염증반응을 일으키는데, 이 때 염증매개인자(pro-inflammatory mediators)인 nitric oxide (NO)나 prostaglandin E2 (PGE2)와 pro-inflammatory cytokine인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 등을 분비하여 생체방어에 대비한다[3, 9, 21].
염증과 산화적 스트레스를 동시에 억제할 수 있는 소재의 발굴이 인체 질환 제어에 유용하게 적용될 수 있는 까닭은 무엇인가?
염증 반응과 산화적 스트레스는 다양한 질환의 발생과 진행에 중요한 역할을 담당한다. 따라서 염증과 산화적 스트레스를 동시에 억제할 수 있는 소재의 발굴은 인체 질환 제어에 매우 유용하게 적용될 수 있다.
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