Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 유래된 철-황 함유 효소인 L-세린 탈수화효소의 동력학적 특성 Kinetic Characterization of an Iron-sulfur Containing Enzyme, L-serine Dehydratase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv원문보기
L-세린 탈수화효소(LSD)는 L-serine을 피루브산과 암모니아로 전환하는 반응을 촉매하는 iron-sulfur 함유 효소이다. 세균성 아미노산 탈수화 효소 중에서, L-serine에 대한 이들 특정 효소만이 촉매 부위에서 iron-sulfur cluster를 이용하는 것으로 보고되고 있다. 또한, 세균성 LSD는 구조적 특성과 도메인의 배열에 따라 네 가지 유형으로 분류된다. 현재까지, 이 효소들은 소수의 균주로부터 얻어진 LSD 효소에 대해서만 연구되었지만, 다양한 세균성 LSD의 촉매 메커니즘을 이해하기 위해서는 더 많은 자세한 조사가 요구된다. 본 연구에서, Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 유래된 유형 II LSD (MtLSD) 단백질을 효소 동력학적 방법을 이용하여 생화학적 및 촉매적 특성을 규명하기 위해 발현 및 정제되었다. MtLSD에 대한 L-serine의 포화 곡선은 알로스테릭 협동성(allosteric cooperativity)을 나타내는 전형적인 S자형(sigmoid)의 특성을 보였다. 이때의 $K_m$과 $k_{cat}$ 값은 각각 $59.35{\pm}1.23mM$과 $18.12{\pm}0.20s^{-1}$로 계산되었다. 또한, 고정된 L-serine 농도 하에서 D-serine의 농도 대비 초속도에 대한 그래프는 비선형 쌍곡선 감쇠 형태를 보였고, $k_{cat}$ 값의 변화 없이 $30.46{\pm}5.93mM$의 겉보기 $K_i$ 값으로 D-serine에 대한 경쟁적 억제(competitive inhibition)를 나타내었다. 이들 연구는 MtLSD의 촉매 특성 및 기질 특이성에 관한 통찰력 있는 생화학적 정보를 제공한다.
L-세린 탈수화효소(LSD)는 L-serine을 피루브산과 암모니아로 전환하는 반응을 촉매하는 iron-sulfur 함유 효소이다. 세균성 아미노산 탈수화 효소 중에서, L-serine에 대한 이들 특정 효소만이 촉매 부위에서 iron-sulfur cluster를 이용하는 것으로 보고되고 있다. 또한, 세균성 LSD는 구조적 특성과 도메인의 배열에 따라 네 가지 유형으로 분류된다. 현재까지, 이 효소들은 소수의 균주로부터 얻어진 LSD 효소에 대해서만 연구되었지만, 다양한 세균성 LSD의 촉매 메커니즘을 이해하기 위해서는 더 많은 자세한 조사가 요구된다. 본 연구에서, Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 유래된 유형 II LSD (MtLSD) 단백질을 효소 동력학적 방법을 이용하여 생화학적 및 촉매적 특성을 규명하기 위해 발현 및 정제되었다. MtLSD에 대한 L-serine의 포화 곡선은 알로스테릭 협동성(allosteric cooperativity)을 나타내는 전형적인 S자형(sigmoid)의 특성을 보였다. 이때의 $K_m$과 $k_{cat}$ 값은 각각 $59.35{\pm}1.23mM$과 $18.12{\pm}0.20s^{-1}$로 계산되었다. 또한, 고정된 L-serine 농도 하에서 D-serine의 농도 대비 초속도에 대한 그래프는 비선형 쌍곡선 감쇠 형태를 보였고, $k_{cat}$ 값의 변화 없이 $30.46{\pm}5.93mM$의 겉보기 $K_i$ 값으로 D-serine에 대한 경쟁적 억제(competitive inhibition)를 나타내었다. 이들 연구는 MtLSD의 촉매 특성 및 기질 특이성에 관한 통찰력 있는 생화학적 정보를 제공한다.
L-Serine dehydratase (LSD) is an iron-sulfur containing enzyme that catalyzes the conversion of L-serine to pyruvate and ammonia. Among the bacterial amino acid dehydratases, it appears that only the L-serine specific enzymes utilize an iron-sulfur cluster at their catalytic site. Moreover, bacteria...
L-Serine dehydratase (LSD) is an iron-sulfur containing enzyme that catalyzes the conversion of L-serine to pyruvate and ammonia. Among the bacterial amino acid dehydratases, it appears that only the L-serine specific enzymes utilize an iron-sulfur cluster at their catalytic site. Moreover, bacterial LSDs are classified into four types based on structural characteristics and domain arrangement. To date, only the LSD enzymes from a few bacterial strains have been studied, but more detailed investigations are required to understand the catalytic mechanism of various bacterial LSDs. In this study, LSD type II from Mycobacterium tuberculosis (MtLSD) H37Rv was expressed and purified to elucidate the biochemical and catalytic properties using the enzyme kinetic method. The L-serine saturation curve of MtLSD exhibited a typically sigmoid character, indicating an allosteric cooperativity. The values of $K_m$ and $k_{cat}$ were estimated to be $59.35{\pm}1.23mM$ and $18.12{\pm}0.20s^{-1}$, respectively. Moreover, the plot of initial velocity versus D-serine concentration at fixed L-serine concentrations showed a non-linear hyperbola decay shape and exhibited a competitive inhibition for D-serine with an apparent $K_i$ value of $30.46{\pm}5.93mM$ and with no change in the $k_{cat}$ value. These results provide insightful biochemical information regarding the catalytic properties and the substrate specificity of MtLSD.
L-Serine dehydratase (LSD) is an iron-sulfur containing enzyme that catalyzes the conversion of L-serine to pyruvate and ammonia. Among the bacterial amino acid dehydratases, it appears that only the L-serine specific enzymes utilize an iron-sulfur cluster at their catalytic site. Moreover, bacterial LSDs are classified into four types based on structural characteristics and domain arrangement. To date, only the LSD enzymes from a few bacterial strains have been studied, but more detailed investigations are required to understand the catalytic mechanism of various bacterial LSDs. In this study, LSD type II from Mycobacterium tuberculosis (MtLSD) H37Rv was expressed and purified to elucidate the biochemical and catalytic properties using the enzyme kinetic method. The L-serine saturation curve of MtLSD exhibited a typically sigmoid character, indicating an allosteric cooperativity. The values of $K_m$ and $k_{cat}$ were estimated to be $59.35{\pm}1.23mM$ and $18.12{\pm}0.20s^{-1}$, respectively. Moreover, the plot of initial velocity versus D-serine concentration at fixed L-serine concentrations showed a non-linear hyperbola decay shape and exhibited a competitive inhibition for D-serine with an apparent $K_i$ value of $30.46{\pm}5.93mM$ and with no change in the $k_{cat}$ value. These results provide insightful biochemical information regarding the catalytic properties and the substrate specificity of MtLSD.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 유래된 LSD-Ⅱ (MtLSD, SdaA) 단백질을 분리·정제하고, 효소활성 측정을 통한 효소동력학적 변수를 분석하여 생화학적 촉매 특성을 규명하고자 한다.
본 연구는 M. tuberculosis H37Rv부터 유래된 LSD-II를 대상으로 효소 동력학적 변수의 분석을 통해 생화학적 촉매 특성을 비교 분석하였다. 향후, 분자수준에서의 촉매기전을 명확히 규명하기 위해, MtLSD의 3차원 입체구조 결정 및 활성부위잔기의 돌연변이를 통한 좀 더 자세한 연구가 남아있지만, 본 연구를 통해 얻어진 결과들은 세균성 LSD의 촉매 기전을 활용한 새로운 접근방법의 항생제 개발에 중요한 기초 자료로 활용되어질 수 있을 것이다.
제안 방법
MtLSD의 기질 L-serine에 대한 Km 값을 고려하여, L-serine의 농도를 각각 40, 60, 80, 120 mM로 고정된 조건하에서 D-serine의 농도 범위를 20~200 mM로 변화하여 효소 활성을 측정하였다. 반응 완충액에 고정된 농도의 L-serine과 다양한 농도 범위의 D-serine을 혼합하여 30℃에서 5분간 pre-incubation한 후, 효소의 최종 농도가 1 ug/ml이 되도록 혼합액에 첨가하여 효소 반응을 개시하였으며, 30℃에서 15분간 반응하였다.
MtLSD의 효소활성 측정은 탈아미노기 반응으로 생성된 2-ketoacid와 2,4-dinitro-phenylhydrazine (2,4-DNPH)가 결합하여 발색되는 높은 알칼리 조건보다 낮은 산성의 조건하에서 반응시켜 hydrazone을 얻은 후에, 최종 알칼리 조건하에서 퀴노이드형의 hydrazine (적갈색)으로 변환시켜 발색된 정색반응을 피루브산 표준액의 정색과 대비하여 촉매 활성도를 측정하였다[13]. 효소활성 반응은 최종 반응 혼합액의 양이 1ml가 되도록, 반응 완충액(20 mM potassium phosphate pH7.
증폭을 위한 primer는 vector로의 삽입을 위하여 제한효소인 NdeI과 HindⅢ site를 첨가하여 디자인하였다. PCR에 의해 증폭된 DNA 절편과 발현 vector인 pET-28a를 제한효소를 사용하여 절단하였다. 재조합 plasmid의 제작을 위해 절단된 각각의 DNA 절편과 pET-28a vector는 T4-DNA ligase를 이용하여 연결하였다.
이전의 연구[6]에서 보고된 바와 같이, LSD의 촉매 활성에 억제 현상을 일으키는 tris, tricine, glycine, barbital, borate, MES 등과 같은 완충액을 배제하기 위하여 potassium phosphate 완충액을 사용하였다. 또한, po-tassium phosphate 완충액의 허용 pH 범위 내에서 측정하기 위하여 상기와 같은 pH 범위를 설정하였다. 반응 완충액에 80 mM L-serine을 기질로 사용하였으며, 각 온도 및 pH 조건의 변화 외에는 앞서 기술한 효소 활성 측정방법과 동일한 조건하에서 실시하였다.
또한, po-tassium phosphate 완충액의 허용 pH 범위 내에서 측정하기 위하여 상기와 같은 pH 범위를 설정하였다. 반응 완충액에 80 mM L-serine을 기질로 사용하였으며, 각 온도 및 pH 조건의 변화 외에는 앞서 기술한 효소 활성 측정방법과 동일한 조건하에서 실시하였다.
은 Michaelis 상수, h는 Hill coefficient를 나타낸다. 속도상수인 kcat 값은 최대속도(Vmax)를 초기의 효소농도(ET)로 나누어 계산하였다.
일반적인 LSD의 효소활성에서 요구되는 기질의 형태가 아미노산이기 때문에, MtLSD의 기질인 L-serine과 구조적 입체 이성질체인 D-serine을 대상으로 기질 또는 억제제로써 작용되어질 것인가를 알아보기 위해 효소 활성을 측정하였다. 앞선 실험에서 얻어진, MtLSD의 기질인 L-serine에 대한 Km 값을 고려하여, L-serine의 농도를 각각 40, 60, 80, 120 mM로 고정시킨 후, D-serine의 농도 변화에 따른 촉매활성 변화를 측정하였다.
온도 및 pH 변화에 따른 MtLSD의 효소 활성 변화를 알아보기 위하여, 20~35℃의 온도 범위와 pH 6.5~8.0 범위에서 각각 효소 활성을 측정하였다. 이전의 연구[6]에서 보고된 바와 같이, LSD의 촉매 활성에 억제 현상을 일으키는 tris, tricine, glycine, barbital, borate, MES 등과 같은 완충액을 배제하기 위하여 potassium phosphate 완충액을 사용하였다.
일반적인 LSD의 효소활성에서 요구되는 기질의 형태가 아미노산이기 때문에, MtLSD의 기질인 L-serine과 구조적 입체 이성질체인 D-serine을 대상으로 기질 또는 억제제로써 작용되어질 것인가를 알아보기 위해 효소 활성을 측정하였다. 앞선 실험에서 얻어진, MtLSD의 기질인 L-serine에 대한 Km 값을 고려하여, L-serine의 농도를 각각 40, 60, 80, 120 mM로 고정시킨 후, D-serine의 농도 변화에 따른 촉매활성 변화를 측정하였다.
PCR에 의해 증폭된 DNA 절편과 발현 vector인 pET-28a를 제한효소를 사용하여 절단하였다. 재조합 plasmid의 제작을 위해 절단된 각각의 DNA 절편과 pET-28a vector는 T4-DNA ligase를 이용하여 연결하였다. 완성된 재조합 plasmid는 E.
tuberculosis H37Rv genomic DNA로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 유전자를 증폭하였다. 증폭을 위한 primer는 vector로의 삽입을 위하여 제한효소인 NdeI과 HindⅢ site를 첨가하여 디자인하였다. PCR에 의해 증폭된 DNA 절편과 발현 vector인 pET-28a를 제한효소를 사용하여 절단하였다.
5, 500 mM KCl, 5 mM βME, 5% glycerol)로 pre-equilibration되어있는 Ni2+-chelated HiTrap chelating HP 컬럼(GE Healthecare, USA)에 흘려 보냈다. 컬럼에 결합된 단백질은 농도구배(gradient)를 위한 완충액 B (20 mM potassium phosphate pH 7.5, 500 mM KCl, and 5 mM BME, 5% glycerol, 500 mM imidazole)를 사용하여 용출하였다. 최종 정제된 단백질의 농도는 Bradford 분석을 사용하여 추정하였다.
5 M NaOH를 1 ml 첨가하여 실온에서 5분 방치하였다. 피루브산과 반응하여 생성된 퀴노이드형 hydrazine은 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 모든 실험은 3번 이상 반복 측정하였다. 효소 동력학적 변수는 SigmaPlot v10.
대상 데이터
0 범위에서 각각 효소 활성을 측정하였다. 이전의 연구[6]에서 보고된 바와 같이, LSD의 촉매 활성에 억제 현상을 일으키는 tris, tricine, glycine, barbital, borate, MES 등과 같은 완충액을 배제하기 위하여 potassium phosphate 완충액을 사용하였다. 또한, po-tassium phosphate 완충액의 허용 pH 범위 내에서 측정하기 위하여 상기와 같은 pH 범위를 설정하였다.
데이터처리
여기에서, Ki는 효소 반응에 대한 억제 상수를 나타낸다. 상기의 모든 그래프는 SigmaPlot v10.0을 이용하여 작성되었으며, 각 상수의 값은 Prism 7을 이용하여 재확인하였다.
피루브산과 반응하여 생성된 퀴노이드형 hydrazine은 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 모든 실험은 3번 이상 반복 측정하였다. 효소 동력학적 변수는 SigmaPlot v10.0과 Prism 7 프로그램을 이용하여 계산하였다.
이론/모형
D-Serine 의한 MtLSD의 효소 활성 억제 반응은 각각의 Km값에 해당하는 L-serine의 기질 농도를 고정하여 측정하였으며, 다음의 식에 나타낸 바와 같이 hyperbolic decay 식을 이용하였다.
L-Serine 농도에 대비한 MtLSD의 효소 활성 그래프는 반응의 협동성(cooperativity)을 접목한 Michaelis-Menten 식으로 보정하기 위하여 다음과 같은 식을 이용하였다.
5, 500 mM KCl, and 5 mM BME, 5% glycerol, 500 mM imidazole)를 사용하여 용출하였다. 최종 정제된 단백질의 농도는 Bradford 분석을 사용하여 추정하였다.
성능/효과
MtLSD 효소 활성의 최적 조건을 알아보기 위하여 다양한 온도 및 pH 변화에 따른 특이 활성도(specific activity)를 측정한 결과, Fig. 1에서 보인 바와 같이, 최적 온도로써 30℃에서 가장 높은 활성을 보였다. 낮은 온도 범위의 20℃와 25℃에서는 두드러진 활성도 차이를 보였으나, 35℃의 조건에서는 최적 온도에서와 유사한 촉매활성을 나타내었다.
61 s-1로 계산되었다(Table 2). 기질 L-serine에 대한 MtLSD의 효소 동력학적 변수와 D-serine에 의한 억제 반응으로부터 얻어진 변수 값을 비교하였을 때, 속도 상수인 kcat 값의 변화는 없었으며, 단지 Ki 값에 의한 Km 값의 변화를 초래하게 됨으로써 D-serine은 MtLSD의 촉매반응에서 경쟁적 억제제로써 작용한다는 것을 암시한다. 또한, D-serine에 대한 MtLSD의 효소활성 억제상수인 Ki 값은 L.
기질 L-serine에 대한 MtLSD의 효소 동력학적 변수와 D-serine에 의한 억제 반응으로부터 얻어진 변수 값을 비교하였을 때, 속도 상수인 kcat 값의 변화는 없었으며, 단지 Ki 값에 의한 Km 값의 변화를 초래하게 됨으로써 D-serine은 MtLSD의 촉매반응에서 경쟁적 억제제로써 작용한다는 것을 암시한다. 또한, D-serine에 대한 MtLSD의 효소활성 억제상수인 Ki 값은 L. pneumophila [20]로부터 유래된 LSD-II에서 보인 D-serine에 대한 Ki 값보다 대략 4배 정도의 높은 값을 나타내었다. 하지만, 이는 기질로써 L-serine에 대한 MtLSD의 Km 값에서 큰 차이를 보인 것과는 달리, 억제제로써 D-serine에 대한 경쟁적 억제반응은 이들 두 균주 간에 유사한 경향성을 보여준다는 것을 인지할 수 있었다.
낮은 온도 범위의 20℃와 25℃에서는 두드러진 활성도 차이를 보였으나, 35℃의 조건에서는 최적 온도에서와 유사한 촉매활성을 나타내었다. 또한, 효소 활성에 억제 반응을 보이지 않는 potassium phosphate 완충액을 선택하여 pH 6.5~8.0까지의 범위에서 촉매 활성도를 비교하였을 때, MtLSD는 pH 7.5에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 그 외의 pH 조건에서는 최적 pH에서의 활성과 큰 차이를 보여 주었다(Fig. 2). 이는 다른 LSD-II 효소에서 나타낸 효소 활성 최적 조건인 pH 7.
또한, 이들 LSD 효소에서 공통적으로 제기되는 의문점 중에 하나인 L-serine에 대한 높은 Km 값은 세포 내에 적정 농도의 L-serine을 유지함으로써, L-serine의 부족으로 인한 대사작용의 부재를 방지하고, 아울러 세포성 독소로써의 작용이나 세포벽 합성을 방해하지 않을 정도로만 유지하기 위함일 것으로 이해되고 있다[7]. 본 실험에서 얻어진 MtLSD의 L-serine에 대한 높은 Km 값은 다른 LSD-II 효소들과 비교하였을 때, 대략 10~30배 정도의 높은 값을 나타내었다. 이는 앞서 기술한 바와 같이 동일한 측면에서 이해될 수 있으나, 다른 한편으로는 일반 세균과 Mycobacterium 균종간의 대사과정 및 세포벽 합성과 같은 생리적 기전의 차이에서 보여질 수 있는 L-serine의 항상성 조절의 차이에서 초래되었음을 암시한다.
후속연구
또한, Escherichia coli K-12에서 LSD의 결손을 유발하여 실험한 결과, 세포벽 합성의 저해, 세포 분열 및 성장에 영향을 준다는 것이 보고된 바 있다[22, 23]. 따라서, 이와 같은 세균성 LSD의 촉매기전에 대한 연구는 새로운 항생제 개발을 위한 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다.
따라서, 본 연구에서는 Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 유래된 LSD-Ⅱ (MtLSD, SdaA) 단백질을 분리·정제하고, 효소활성 측정을 통한 효소동력학적 변수를 분석하여 생화학적 촉매 특성을 규명하고자 한다. 이는 향후 균종 간 또는 도메인 형태별 LSD의 촉매기전에 대한 비교 분석에 중요한 자료로 활용될 것이다.
tuberculosis H37Rv부터 유래된 LSD-II를 대상으로 효소 동력학적 변수의 분석을 통해 생화학적 촉매 특성을 비교 분석하였다. 향후, 분자수준에서의 촉매기전을 명확히 규명하기 위해, MtLSD의 3차원 입체구조 결정 및 활성부위잔기의 돌연변이를 통한 좀 더 자세한 연구가 남아있지만, 본 연구를 통해 얻어진 결과들은 세균성 LSD의 촉매 기전을 활용한 새로운 접근방법의 항생제 개발에 중요한 기초 자료로 활용되어질 수 있을 것이다.
현재까지, E. coli와 Legionella pneumophila로부터 유래된 LSD-II에 대한 생화학적 연구 결과[14, 20]가 보고되었지만, LSD-II의 도메인 특성을 고려한 촉매기전을 규명하기 위하여 여러 균종 간의 비교를 통한 더 많은 추가적인 연구가 요구된다. 따라서, 본 연구에서는 Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 유래된 LSD-Ⅱ (MtLSD, SdaA) 단백질을 분리·정제하고, 효소활성 측정을 통한 효소동력학적 변수를 분석하여 생화학적 촉매 특성을 규명하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
세포내의 L-serine 농도를 일정하게 유지해주어야 하는 이유는?
또한, L-cysteine 및 L-glycine과 같은 아미노산의 합성에도 관여하여 질소 원료로서 작용하며[8, 9], 인지질의 막 구성요소에 주요한 성분인 포스파티딜세린 합성의 전구체로써도 작용하고 있다[2, 18]. 많은 세균에서, L-serine의 합성은 인산화 경로의 결함으로 인하여 영양 요구의 결과를 초래하지만 반면에, 높은 농도의 L-serine은 세포독성을 나타내기도 하며[16], 아울러 peptidoglycan (PG)층의 합성에 문제를 야기시켜 비정상적인 PG층 합성을 유발하게 된다[3, 23]. 따라서, 세포내의 L-serine 농도를 일정하게 유지할 수 있는 조절작용이 요구된다.
L-serine이란?
아미노산의 한 종류인 L-serine은 여러 경로에 관여하는 대사물질로써 세포 내로 들어오게 되면 단백질 합성과 메틸화 반응 등 많은 활동의 중심이 되는 1-탄소 대사과정에서 전구체 역할을 한다[4, 19]. 또한, L-cysteine 및 L-glycine과 같은 아미노산의 합성에도 관여하여 질소 원료로서 작용하며[8, 9], 인지질의 막 구성요소에 주요한 성분인 포스파티딜세린 합성의 전구체로써도 작용하고 있다[2, 18].
L-serine의 농도에 따라 세포에 끼치는 영향은?
또한, L-cysteine 및 L-glycine과 같은 아미노산의 합성에도 관여하여 질소 원료로서 작용하며[8, 9], 인지질의 막 구성요소에 주요한 성분인 포스파티딜세린 합성의 전구체로써도 작용하고 있다[2, 18]. 많은 세균에서, L-serine의 합성은 인산화 경로의 결함으로 인하여 영양 요구의 결과를 초래하지만 반면에, 높은 농도의 L-serine은 세포독성을 나타내기도 하며[16], 아울러 peptidoglycan (PG)층의 합성에 문제를 야기시켜 비정상적인 PG층 합성을 유발하게 된다[3, 23]. 따라서, 세포내의 L-serine 농도를 일정하게 유지할 수 있는 조절작용이 요구된다.
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