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문제 정의
- , 2016). 이에 따라 본 연구에서는 경기지역에서 2014년부터 2015년까지 발생한 노로바이러스성 식중독 발생특성 및 유전형을 분석하여 세계적인 유행 양상과 비교하였으며, 이를 토대로 경기지역 식중독 예방 대책 수립의 기초 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 2014년 1월부터 2015년 12월까지 경기도내 집단식중독 검체 2,917건을 대상으로 발생양상을 파악하고 노로바이러스의 분자유전학적 특성을 분석하였다.
- 2014년 말부터 전세계적으로 GII-17 kawasaki 변이주의 출현으로 노로바이러스 집단 식중독이 크게 유행하였다는 보고에 따라, 본 연구에서 확인된 노로바이러스 중 GII-17형에 대한 유전계통학적 분석을 수행하였다. GII-17형으로 확인된 52건의 검체 중에서 50건이 GII-17 kawasaki 형으로 확인되었고, 이 중 2015년 초 집단식중독을 유발했던35건의 검체에 대한 유전계통학적 분석을 한 결과 일본의 Hu/GII/JP/2014/GII.
- Onestep RT-PCR를 위해 2X RT-PCR Master mix 12.5 µl, 10 pmole sense primer와 antisense primer 각각 2 µl, DW 6 µl, RNA 2 µl를 포함한 25 µl 반응액을 사용하였다.
- PCR 산물은 QIAxel (QIAGEN) 전기영동장치로 확인하였다.
- PCR을 통해서 증폭된 노로바이러스 양성 PCR 산물을 이용하여 각각의 유전자형에 특이적인 프라이머를 사용하여 양쪽 방향으로 dideoxynucleotide chain termination 기법을 사용하는 Bigdye sequencing kit (ABI prism Applied Biosystems, Perkin Elmer)을 사용하여 sequencing reaction을 하였다. 얻어진 PCR 산물을 이용하여 ABI PrismBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
- RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물은, Marcrogen사를 통해 정제와 유전자 분석을 수행하였다. 즉, 증폭된 유전자를 1% 아가로즈 젤(Gibco)로 전기영동하여 확인한 뒤, DNA절편을 절단한 후, AccuPrep Gel Purification kit (Bioneer)를 사용하여 정제하였다.
- RT-PCR이 종료된 산물 2 µl를 이용하여 semi-nested RT-PCR을 수행하였으며 10 × PCR reaction buffer, 2.5 mM dNTP, 20pmol primer, 1U Taq polymerase (Bioneer)를 넣어서 50 µl 반응액 제조한 후 실험에 사용하였다.
- 노로바이러스 RNA 추출은 분변 검체 140 µl를 QIAamp microspin columns (viral RNA mini kit: QIAGEN)을 이용하였으며, 추출된 RNA는 사용할 때까지 -70°C에서 보관하였다.
- 반응조건은 94°C에서 3분 동안 반응시킨 후 94°C 30초, 56°C 30초, 72°C 45초로 25 cycles를 반복한 후 72°C에서 7분간 반응하였다.
- 4 변이주의 출현으로 전세계적으로 2~3년 주기로 유행하고 있다. 본 연구에서는 2014년부터 2015년까지 2년간 경기도 내 집단식중독 검체 2,917건을 대상으로 노로바이러스성 식중독 발생양상을 파악하고 분자유전학적 특성을 분석하였다. 검사결과 노로바이러스가 247건으로 가장 많았으며, 분자유전학적 특성은 GI 형에서 8종(GI-1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14), GII형에서 10종(GII-2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 16, 17)으로 다양하게 분포하고 있는 것으로 나타났다.
- 분석된 경기도내 분리주의 nucleoprotein (N) 부위 염기서열은 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov) database에 등록되어 있는 기존의 노로바이러스 표준주 염기서열과 비교분석을 통해 가장 높은 상동성을 나타낸 유전형을 확인하였다. 서열들은 ClustalW program을 사용하여 정렬하였으며, MEGA v 6.
- gov) database에 등록되어 있는 기존의 노로바이러스 표준주 염기서열과 비교분석을 통해 가장 높은 상동성을 나타낸 유전형을 확인하였다. 서열들은 ClustalW program을 사용하여 정렬하였으며, MEGA v 6.06 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.06) program을 이용하여 maximum composite likelihood model과 neighbor -joining method에 의해 염기서열간의 유전적 거리와 phylogenetic tree를 추론하였다. 또한, bootstrap 값은 1,000회의 resampled data로부터 추론하였다.
- PCR을 통해서 증폭된 노로바이러스 양성 PCR 산물을 이용하여 각각의 유전자형에 특이적인 프라이머를 사용하여 양쪽 방향으로 dideoxynucleotide chain termination 기법을 사용하는 Bigdye sequencing kit (ABI prism Applied Biosystems, Perkin Elmer)을 사용하여 sequencing reaction을 하였다. 얻어진 PCR 산물을 이용하여 ABI PrismBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer Cetus)를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
- 유전자 증폭을 위해 Verti 96 well Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 48°C에서 40분간 reverse transcription를 수행하고, 94°C 3분 동안 반응시킨 뒤 94°C 30초, 54°C 30초, 72°C 45초로 35 cycles를 반복한 후 72°C에서 7분간 반응하였다.
- RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물은, Marcrogen사를 통해 정제와 유전자 분석을 수행하였다. 즉, 증폭된 유전자를 1% 아가로즈 젤(Gibco)로 전기영동하여 확인한 뒤, DNA절편을 절단한 후, AccuPrep Gel Purification kit (Bioneer)를 사용하여 정제하였다. 절편을 튜브에 넣고 3배 부피의 젤 용해용 완충용액(Buffer GB)을 첨가하고 50°C에서 젤을 용해시킨 뒤, Bioneer spin column으로 옮겨 4°C에서 14,000 r/min으로 1분간 원심분리한 후, 세척용 완충용액 750 µl을 첨가하고 14,000 r/min에서 1분간 원심분리한 후, 상층액을 취하여 잔여 세척용 완충용액을 제거하고 30~50 µl의 증류수로 DNA를 회수하여 다음 실험에 이용하였다.
- 노로바이러스 RNA 추출은 분변 검체 140 µl를 QIAamp microspin columns (viral RNA mini kit: QIAGEN)을 이용하였으며, 추출된 RNA는 사용할 때까지 -70°C에서 보관하였다. 질병관리본부 primer 검출 조건에 따라 노로바이러스 유전자검출을 수행하였다(Table 1). Onestep RT-PCR를 위해 2X RT-PCR Master mix 12.
대상 데이터
- 2014년 말부터 2015년 초까지 일본, 중국 등 아시아를 중심으로 노로바이러스 GII. 17 kawasaki 변이주가 출현하면서(Gao et al.
- 2014년부터 2015년까지 경기도에서 발생한 식중독 중 노로바이러스 양성 건수를 시․ 군별로 분석한 결과는 Fig. 2와 같다. 용인시 25.
- 본 연구에서는 2014년 1월부터 2015년 12월까지 2년간 경기 남부지역 21개 시·군 보건소에서 집단식중독 발생 시 의뢰된 환자 및 종사자의 분변 검체 2,917건(2014년 1,303건, 2015년 1,614건)을 사용하였다.
이론/모형
- Phylogenetic tree of noroviruses based on partial VP1 nucleotide sequences. Nucleotide sequences were analyzed by using the maximum-likelihood method. Shown are trees with the highest log likelihood.
성능/효과
- 2014년부터 2015년까지 경기도내 발생한 식중독 환자의 검체에서 분리한 노로바이러스의 genogroup의 특성을 살펴보면 GI 7.3% (18/247건), GII 81.8% (202/247건), GI과 GII 중복감염 검체가 10.9% (27/247건)를 차지하고 있어 GII group의 비중이 높았다. 월별 분포양상을 분석한 결과 2014년 12월 25.
- 2015년 초 집단발생한 노로바이러스 35건에 대한 유전계통학적 분석결과 GII-17 kawasaki 형으로 알려진 분리주와 96.6%이상 일치하여 새로운 변이주에 의한 유행임을 확인하였으며, 기숙학원을 비롯한 학교에서 섭취한 급식으로 인한 발생 비율이 44%로 나타났다.
- 2015년 초 집단발생한 노로바이러스 35건에 대한 유전계통학적 분석결과 GII-17 kawasaki 2014형으로 알려진 분리주와 96.6% 이상 일치하여 새로운 변이주에 의한 유행이었음을 확인하였으며, 학교 등 급식에 의한 비율이 44%로 단체급식 위생에 주의하는 한편 발생 원인을 파악하여, 대규모 식중독 유행에 대비하여야 할 것으로 판단된다.
- GII-17 kawasaki 변이주로 확인된 50건의 지역별 발생특성을 살펴보면, 용인시가 28% (14/50건)로 가장 높았으며 화성시 24% (12/50건), 여주시 24% (12/50건)로 나타났다. 그외 지역은 광주시 4건, 수원시 3건, 성남시, 안산시, 안양시, 시흥시, 이천시가 각각 1건으로 확인되었다.
- 2014년 말부터 전세계적으로 GII-17 kawasaki 변이주의 출현으로 노로바이러스 집단 식중독이 크게 유행하였다는 보고에 따라, 본 연구에서 확인된 노로바이러스 중 GII-17형에 대한 유전계통학적 분석을 수행하였다. GII-17형으로 확인된 52건의 검체 중에서 50건이 GII-17 kawasaki 형으로 확인되었고, 이 중 2015년 초 집단식중독을 유발했던35건의 검체에 대한 유전계통학적 분석을 한 결과 일본의 Hu/GII/JP/2014/GII.P17_GII.17/Kawasaki323 (Accession No. AB983218) 분리주와 96.6% 이상, 미국의 Hu/GII.17/Gaithersburg/2014/US (Accession No. KR083017) 분리주와 98.1% 이상, 중국의Hu/GII.17/41621/Guangzhou/2014/CHN (Accession No. KR020503) 분리주와 97.7% 이상, 일본의 Hu/GII/JP/2015/GII.P17_GII.17/Kawasaki308 (Accession No. LC037415) 분리주와 97.4% 이상 일치하였다(Fig. 5).
- 본 연구에서는 2014년부터 2015년까지 2년간 경기도 내 집단식중독 검체 2,917건을 대상으로 노로바이러스성 식중독 발생양상을 파악하고 분자유전학적 특성을 분석하였다. 검사결과 노로바이러스가 247건으로 가장 많았으며, 분자유전학적 특성은 GI 형에서 8종(GI-1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14), GII형에서 10종(GII-2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 16, 17)으로 다양하게 분포하고 있는 것으로 나타났다. 2015년 초 집단발생한 노로바이러스 35건에 대한 유전계통학적 분석결과 GII-17 kawasaki 2014형으로 알려진 분리주와 96.
- 노로바이러스의 분자유전학적 특성은 GI 형에서 8종(GI-1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14), GII형에서 10종(GII-2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 16, 17)으로 다양하게 분포하고 있는 것으로 나타났다.
- 노로바이러스의 지역별 발생양상은 5개 시군(평택시, 김포시, 의왕시, 양평군, 과천시)을 제외한 16개 시군에서 모두 노로바이러스가 검출되었으며, 지역별 뚜렷한 역학관계는 찾을 수 없었다.
- 그외 지역은 광주시 4건, 수원시 3건, 성남시, 안산시, 안양시, 시흥시, 이천시가 각각 1건으로 확인되었다. 섭취 식품별 발생양상은 급식 44% (22/50건), 육류 16% (8/50건), 회 10% (5/50건), 기타 30% (15/50건)로 나타났으며(Fig. 6), 장소별 분석결과 중 학교 20% (10/50건), 고등학교 6% (3/50건), 대학교 4% (2/50건), 기숙학원 14% (7/50건), 식당 44% (22/50건), 기타 12% (6/50건)로 확인되었다(Fig. 7).
- 식중독 검체 2,917건 중 247건이 노로바이러스 양성으로 확인되었으며, 노로바이러스 양성 검출 비율은 2014년 7.0% (91/1,303건), 2015년 9.7% (156/1,614건)로 평균 8.5% (247/2,917건)로 나타났다.
- 염기서열 분석을 통한 유전형 분석결과 GI 형에서 8종(GI-1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14), GII형에서 10종(GII-2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 14, 16, 17)으로 다양하게 분포하고 있는 것으로 나타났다(Fig. 4). GII-17형의 경우 2014년에 분리된 검체가 없었으나 2015년 21% (52/247건)로, 이는 2011년부터 2013년까지 경기도에서 발생한 노로바이러스성 식중독 유전자형 분석결과 GII-4형이 31.
- 용인시 25.3% (63/247건), 화성시 17.3% (43/247건)으로 비율이 높았고, 5개 시·군(평택시, 김포시, 의왕시, 양평군, 과천시)을 제외한 16개 시군에서 모두 노로바이러스가 검출되었으며, 지역별 뚜렷한 역학관계는 찾을 수 없었다.
- 9% (27/247건)를 차지하고 있어 GII group의 비중이 높았다. 월별 분포양상을 분석한 결과 2014년 12월 25.9% (64/247건), 2015년 1월 29.6% (73/247건)으로 2014년 12월부터 2015년 1월까지 노로바이러스가 크게 유행했음을 알 수 있다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서 향후 도내 식중독 예방을 위하여 해외 유행패턴의 지속적인 모니터링 및 학교나 기숙학원 등 단체급식 취급 기관을 대상으로 식중독 예방훈련 등 위생과 관리에 주의를 기울여야 할 것으로 판단된다
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