[논문]사료 급여 방식에 따른 반추위액 내 휘발성지방산과 단당류 비교 분석과 대사산물 분석

엄준식; 이신자; 이유경; 이성실

doi:10.5762/kais.2018.19.12.814

사료 급여 방식에 따른 반추위액 내 휘발성지방산과 단당류 비교 분석과 대사산물 분석
Comparison of Volatile Fatty Acids, Monosaccharide Analysis and Metabolic Profiling in Rumen Fluid According to Feeding Methods 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.19 no.12, 2018년, pp.814 - 824

엄준식 (경상대학교 응용생명과학부(BK21Plus)) , 이신자 (경상대학교 농업생명과학연구원(중점연구소)) , 이유경 (국립축산과학원 영양생리팀) , 이성실 (경상대학교 응용생명과학부(BK21Plus))

초록
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거세한우 3두를 $3{\times}3$ Latin square design 시험방법에 적용하여 사료 적응 기간 10일 후 사료 급여 방식에 따른 반추위액 내 휘발성지방산과 단당류 비교 분석 및 대사산물 분석에 대한 연구를 수행하였다. 연구 결과 HPLC와 HPAEC에서 측정되지 않은 휘발성지방산과 단당류들은 $^1H-NMR$에서는 측정이 가능 한 것을 알 수 있었다. $^1H-NMR$에서 측정된 대사산물 중, carbohydrate 계열 대사산물 pyruvate는 사료 급여 전 반추위액에서만 측정 되었으며, succinate는 사료 급여 전 후에서 모두 측정 되었다. Amino acid 계열 대사산물은 총 9가지가 측정 되었다. Lipid 계열 대사산물 ethylene glycol는 사료 급여 전 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 높게 측정 되었다. Aiphatic acylic compounds 계열 대사산물 trimethylamine N-oxide는 유의적인 차이는 보이지 않았다. 이번 연구를 통해 $^1H-NMR$를 이용하여 반추위액 내 많은 대사산물 측정이 가능한 것을 알 수 있었으며 사료 급여 전 후 급여 방식에 따라 대사산물의 변화가 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate VFA, monosaccharides and metabolites in rumen fluid according to feeding methods. Three castrated Hanwoo steers were used to the $3{\times}3$ Latin square design, 10 day for the diet adaptation period. VFA and monosaccharides which were not detected by HPLC and HPAEC however, those were detected by $^1H-NMR$. Among the metabolites measured by $^1H-NMR$ carbohydrate metabolites, pyruvate was detected only in the rumen fluid before feeding and succinate was detected before and after feeding rumen fluid. In amino acid total 9 metabolites were detected. In lipid metabolites, ethylene glycol was significantly higher (P<0.05) in before feeding Con group. In aliphatic acylic metabolite, trimethylamine N-oxide was no significant difference observed compare to Con group. In this study, many metabolites were observed in the rumen fluid by $^1H-NMR$, and it confirmed that rumen metabolic products were changed by feeding methods.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. The Chemical Composition of Rice Straw, Timothy and Concentrate Used in the Experiment
표 Table 2. Concentration of Volatile Fatty Acids in Rumen Fluid by High Performance Liquid Chromatography and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
표 Table 3. Concentration of Monosaccharide in Rumen Fluid by High Performance Anion-Exchange Chromatography and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
그림 Fig. 1. The Representative Spectrum ¹H-NMR Obtained from Rumen Fluid Samples. The Spectra were Constructed Using TSP at 0.00 ppm as Reference
그림 Fig. 2. Continued
표 Table 4. List of Metabolites in Rumen Fluid According to Different Feeding Methods and Fermentation Time

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구의 목적은 사료 급여 방식에 따른 사료 급여 전·후 반추위액을 1H-NMR를 이용하여 분석하고, HPLC와 HPAEC를 이용하여 대사산물 비교 분석을 실시하였다.

제안 방법

각 시료에 대하여 ¹H-NMR 데이터를 얻은 후 Chenomx 8.4 소프트웨어(Chenomx NMR Suite 8.4, Chenomx Inc., Edmonton, Alberta, Canada)를 사용하여 baseline과 phase를 동일하게 맞추었다. 전체 스펙트럼 범위는 0~10 ppm이며 기준 물질로 사용한 TSP는 피크의 위치와 적분값을 일정하게 맞추기 위해 사용하였고, 마지막으로 Chenomx 8.
국외 선행연구의 전처리 방법을 참고하여 ¹H-NMR의 분석을 위한 전처리를 실시하였다[18-20]. 반추위액 1 mL를 4℃가 유지되는 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm × 3 min 원심분리 후 상등액 300 µL와 기준물질 TSP용액 300 µL를 혼합하였다.
그 후 혼합된 샘플 600 µL를 5mm NMR tube에 옮겨 담아 SPE-800mHz NMR-MS Spectrometer (Bruker BioSpin AG)를 이용하여 분석을 하였다.
20 µM syringe filter를 이용하여 여과하였다. 분석은 전류도 검출기가 장착된 HPAEC (ICS-3000, Dionex co., USA)를 사용하여 분석하였으며, CarboPac PA-100 (4 mm x 250 mm, Dionex co., USA)을 컬럼으로 사용하였고, 이동상은 100 mM NaOH 용액을 사용하였다. Flow rate은 1.
사료 급여 방식에 따른 반추위액 내 대사산물은 기준물질 TSP를 포함하여 총 55개를 정량하였으며, 휘발성지방산 계열 6종, carbohydrate 계열 13종, amino acid 9종, lipid 계열 5종 그리고 기타계열 22종으로 대사산물을 분류 하였다. 반추위액의 ¹H-NMR 스펙트럼 피크의 양상은 비슷하였으나, 1,3-Dihydroxyacetone, isocitrat pyruvate, ethylene glycol, methyl succinate, proline, N-acetylornithine, furmarate 및 gluconate는 사료 급여 전 반추위액에서만 정량되었고, valerate, isovalerate, mannose, xylitol, thymol, isopropanol, O-phosphocholine, guanidoacetate, malonate 및 succinylacetone는 사료 급여 3시간 후 반추위액에서만 정량된 대사산물임을 확인할 수 있었다.
사료 급여 방식에 따른 사료 급여 전·후 반추위액을 1H-NMR를 이용하여 분석하고, HPLC와 HPAEC를 이용하여 대사산물 비교 분석을 실시하였다.
시험은 3 x 3 Latin square design 방법으로 수행하였고, 사료는 Con구(농후사료 급여 40분 후 조사료 급여), T1구(조사료 급여 40분 후 농후사료 급여), T2구(조사료와 농후사료 혼합 급여)로 나누어 사료 급여 전, 급여 3시간 후에 stomach tube를 이용하여 반추위액을 채취하였다. 채취한 반추위액은 50 mL conical tube에 30 mL 옮겨 담아 액체질소로 급속 냉동시킨 후 –80℃에 보관하였다.
연구 절차 및 공시축의 사양관리는 국립축산과학원 축산생명환경부 실험동물 복지 윤리법에 따라 수행 되었으며 거세 한우 3두(평균체중 533 kg)에게 조사료 0.9 kg(볏짚 0.45 kg + Timothy 0.45 kg)와 농후사료 2.7 kg를 1일 2회 급여하여 시험 시작 전 10일간 사료 적응기간을 설정하였다. 시험에 사용된 사료의 일반성분은 Table 1과 같다[27].
, Edmonton, Alberta, Canada)를 사용하여 baseline과 phase를 동일하게 맞추었다. 전체 스펙트럼 범위는 0~10 ppm이며 기준 물질로 사용한 TSP는 피크의 위치와 적분값을 일정하게 맞추기 위해 사용하였고, 마지막으로 Chenomx 8.4 소프트웨어와 ¹H-NMR Suite 라이브러리를 이용하여 대사산물에 대한 정량 값을 산출하였다.
분석은 25℃에서 진행하였고, 물의 피크를 최소화하기 위해 pre-saturation 방법을 사용하였다. 조건은 spectral width 20ppm, acquisition time 2s, time domain 64k로 128번 스캔 하였으며 Saturation delay 1.5초 saturation power는 6인 saturation frequency에서 분석하였다[25].
휘발성지방산은 반추위액 1.5 mL를 4℃가 유지되는 원심분리기를 이용하여 12,000 rpm × 3 min 원심분리 후 상등액 1 mL를 0.20 µM syringe filter를 이용하여 여과 하였으며 UV detector (L-2400, Hitachi, Tokyo, Japan)와 column(Metacarb 86H, Varian, Palo Alto, USA)이 장착된 HPLC (L-2200, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다[28].

데이터처리

시험 결과에 대한 통계분석은 SAS package program(2002)의 general linear model (GLM) procedure를 이용하여 분산분석을 하였고, Duncan’s multiple range test[29]의 다중검정방법으로 평균 간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.

이론/모형

반추위액 샘플에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼은 Noesy 1D sequence를 사용하여 결과를 얻었다. 분석은 25℃에서 진행하였고, 물의 피크를 최소화하기 위해 pre-saturation 방법을 사용하였다.
H-NMR 스펙트럼은 Noesy 1D sequence를 사용하여 결과를 얻었다. 분석은 25℃에서 진행하였고, 물의 피크를 최소화하기 위해 pre-saturation 방법을 사용하였다. 조건은 spectral width 20ppm, acquisition time 2s, time domain 64k로 128번 스캔 하였으며 Saturation delay 1.

성능/효과

1H-NMR에서 정량화 된 대사산물은 55개였으며, 사료 급여 방식에 따른 반추위액 내 대사산물은 많은 변화가 있었다. 또한 국외 선행연구의 반추위액 내 정량화된 대사산물과 대부분 일치하는 것을 확인 할 수 있었다.
1H-NMR에서 측정된 단당류는 fructose, glucose, 및 mannose이고 glucose가 가장 높게 측정되었다. Woods 등에 의하면 fructose는 사람과 쥐의 간에서 Pi의 일시적 감소로 인해 ATP 함량이 감소되었다고 하였고[31], Yair과 Allen에 의하면 fructose는 acetate의 전구물질로서, 착유우에 있어 ATP 함량 감소시켜 포만감 지연감소로 인한 사료 섭취량이 증가 한다고 하였다[32].
1H-NMR에서는 acetate, propionate, butyrate 및 isobutyrate가 측정 되었으며, 그 중 total VFA 및 acetate 함량은 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 높게 측정되었다.
Carboxylic acids 계열 대사산물 2-Hydroxyisobutyrate, 3-Hydroxyisovalerate 및 3-Hydroxyphenylacetate와 others 계열 대사산물 3-Phenylpropionate은 휘발성지방산의 중간대사산물로 사료되며 연구결과, 사료 급여 전·후 및 급여 방식에 따른 유의적인 차이는 보이지 않았다.
Lipid 계열 대사산물 ethylene glycol는 사료 급여 전 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 높게 측정 되었으나, methyl succinate는 유의적인 차이는 보이지 않았다.
H-NMR에서 정량화 된 대사산물은 55개였으며, 사료 급여 방식에 따른 반추위액 내 대사산물은 많은 변화가 있었다. 또한 국외 선행연구의 반추위액 내 정량화된 대사산물과 대부분 일치하는 것을 확인 할 수 있었다.
반추위액의 1H-NMR 스펙트럼 피크의 양상은 비슷하였으나, 1,3-Dihydroxyacetone, isocitrat pyruvate, ethylene glycol, methyl succinate, proline, N-acetylornithine, furmarate 및 gluconate는 사료 급여 전 반추위액에서만 정량되었고, valerate, isovalerate, mannose, xylitol, thymol, isopropanol, O-phosphocholine, guanidoacetate, malonate 및 succinylacetone는 사료 급여 3시간 후 반추위액에서만 정량된 대사산물임을 확인할 수 있었다.
사료 급여 3시간 후 반추위액 내 휘발성지방산 중 HPLC에서는 사료 급여 전 반추위액에서 측정된 목록과 일치 하였으며 total VFA, acetate, propionate 및 butyrate 함량은 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 높게 측정되었다.
사료 급여 전 반추위액 내 total VFA 및 Acetate / Propionate ratio를 제외한 6가지 휘발성지방산 중, HPLC에서는 acetate, propionate, butyrate 및 isovalerate가 측정되었고, 그 중 propionate함량은 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 높게 측정 되었으며 Acetate / Propionate ratio는 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 낮은 결과를 보였다.
사료 급여 전·후 및 급여 방식에 따른 유의적인 차이는 보이지 않았으며 proline은 사료 급여 전에서만 측정되는 특이점을 발견하였다.
연구 결과, 사료 급여 3시간 후 T2구에서 Con구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮게 측정되었다.
연구결과, ¹H-NMR과 HPLC에서 측정된 휘발성지방산 종류는 차이가 있었고, ¹H-NMR에서 valerate 및 isovalerate가 추가로 측정 되었다. HPAEC에서 측정된 단당류는 ¹H-NMR에서는 거의 측정 되지 않았지만, 단당류의 전구대사산물과 다른 종의 단당류가 측정 되었다.
연구결과, Con구에서 isovalerate 함량이 유의적(P<0.05)으로 높게 측정 되었으며 나머지 급여 방식에서도 적정수치의 결과를 보였다.
연구결과, pyruvate는 사료 급여 전에서만 측정 되었고 유의적인 차이는 보이지 않았으며, succinate는 사료 급여 전·후 모두 측정되었으나 유의적인 차이는 보이지 않았다.
연구결과, 사료 급여 3시간 후 Con구에서 fructose 함량이 유의적(P<0.05)으로 높게 측정되었고, acetate 함량 또한 Con구에서 유의적(P<0.05)으로 높게 측정된 것으로 보아 농후사료 급여 후 조사료를 급여 하게 되면 메탄 발생량이 높아 질 것으로 사료된다.
Aliphatic acylic compounds 계열 대사산물 trimethylamine N-oxide는 반추위 내 미생물이 trimethylamine을 이용하여 간에서 합성 후 생성되며, methanogen이 이용하는 trimethylamine과 밀접한 상관관계가 있다고 알려져 있다[35]. 연구결과, 사료 급여 전 T1구에서 가장 높게 측정 되었지만 Con구와 비교 하였을 때 유의적인 차이는 보이지 않았으며, 사료 급여 3시간 후 모든 급여 방식에서 비슷한 농도를 나타내었다.
연구결과, 사료 급여 전·후 및 급여 방식에 따른 유의적인 차이는 보이지 않았으며 산중독증 농도 범위를 넘지 않는 것을 확인 할 수 있었다.
Carbohydrate 대사산물 1,3-Dihydroxyacetone는 acetone의 전구물질로서 반추동물에게 급여하는 곡류사료의 비율이 높아지면 농도가 감소한다고 알려져 있다[20]. 연구결과, 사료 급여 전에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으며 사료 급여 3시간 후 반추위액에서는 측정되지 않았다. N-Acetylglucosamine은 단당류와 이당류들과 함께 Kandleria 유전체의 enzyme Ⅱ에 의해 수송된다고 알려져 있고[33], chitin의 주요 구성요소로서 골격근과 섬유소와 연관되어 있다고 알려져 있다[34].
연구결과, 사료 급여 전에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 사료 급여 3시간 후 T1구에서 Con구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높게 측정 되었다.

후속연구

HPAEC에서 측정된 단당류는 ¹H-NMR에서는 거의 측정 되지 않았지만, 단당류의 전구대사산물과 다른 종의 단당류가 측정 되었다. ¹H-NMR에서 측정된 대사산물의 정량화가 더욱 정밀하게 이루어진다면 반추위액 내 휘발성지방산과 단당류 분석에 쓰이는 HPLC와 HPAEC의 대처가 가능 할 것으로 사료된다.
추후 국내에서 지속적인 연구가 수행된다면 더 많은 대사산물을 정량화 할 수 있을 것이며, 더 나아가 반추위 내 대사산물의 역할 구명에 대한 연구가 필요 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	조사료는 어떤 효과가 있는가?	반추동물에게 급여하는 사료는 크게 구조탄수화물 함량이 높은 조사료와 전분함량이 높은 농후사료로 분류된다. 조사료는 반추위의 발달과 반추위 내 pH 안정으로 인한 미생물 성장의 촉진 효과 그리고 고능력 착유우의 질병 예방에 효과가 있다[1-3]. 농후사료는 반추동물에게 높은 에너지원으로 쓰일 수 있으므로[4,5] 반추동물의 영양 및 생리적 체계 유지를 위해 적절한 조사료와 농후사료의 급여방식이 필요하다.
	단당류 분석에서 High Performance Anion-Exchange Chromatography의 단점은?	반추위액 내 휘발성 지방산의 분석은 Gas Chromatography; GC[15], High Performance Liquid Chromatography; HPLC[16]등을 이용하고 있고, 단당류 분석은 High Performance Anion-Exchange Chromatography; HPAEC[17]등을 이용하고 있으며, 정확한 정량적 분석이 가능하다는 장점이 있다. 그러나 분석에 필요한 샘플의 전처리, 휘발성지방산 및 단당류에 대한 standard curve 설정과 용매 흘려주기 등 적지 않은 시간과 비용이 든다는 단점이 있다. 최근 국외에서는 NMR (Nuclear Magnetic Resonance)를 이용하여 반추위액 내 휘발성지방산과 단당류 뿐 아니라 대사산물의 분석이 많이 진행되고 있다[18-20].
	반추동물의 사료는 어떻게 분류되는가?	반추동물에게 급여하는 사료는 크게 구조탄수화물 함량이 높은 조사료와 전분함량이 높은 농후사료로 분류된다. 조사료는 반추위의 발달과 반추위 내 pH 안정으로 인한 미생물 성장의 촉진 효과 그리고 고능력 착유우의 질병 예방에 효과가 있다[1-3].

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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