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문제 정의
- 본 실험에서는 간척지 밭작물 재배 작부체계 매뉴얼 개발을 위하여 간척지 토양에서 재배 가능한 작물 선별을 목표로 원예작물 중 내염성에 대하여 MT 등급인 비트와 MS 등급인 순무를 양액 재배하여 NaCl 처리 농도(EC 값 기준)에 따른 2차 대사산물인 베타시아닌과 GSL 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
가설 설정
- Peak numbers refer to the GSLs listed in Table 6. b) ND, not detected.
- b)Only used tap-water.
제안 방법
- GSL 분석은 Inertsil ODS-3 column(150×3.0 mm I.D., particle size 3 μm), 가드 컬럼은 Inertsil ODS-2 Cartridge Guard column E(10×2.0 mm I.D., particle size 5 μm) (GL Science, Tokyo, Japan)을 사용하였고 HPLC(Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 19분에는 31% 를 유지시키고 21분까지 31에서 0%로 감소, 27분에는 0%를 유지시켰다. 각 GSL 성분은 본 연구진의 실험실 내부 HPLC 및 LC-MS 분석자료와 기 발표한 문헌의 자료(Chun et al., 2016)를 참고하여 동정하였고, 외부표준물질인 Sinigrin의 HPLC 피크 면적(area)을 기준으로 각 GSL 성분의 피크 면적을 비교하여 정량하였다.
- 34 kg)을 하였다. 간척지 토양을 채취할 때 토양 수분(37.8%), 토양 온도 (28.3℃), 토양 전기전도도(EC, 3.8~4.3 dS․m-1)를 측정하였다.
- 45 µm hydrophilic PTFE syringe filter (직경 13 mm)로 여과한 후, 감압농축기로 EtOH이 완전히 제거될 때까지 농축시켰다. 농축 시료를 1.0 mL EtOH와 1.0 mL 증류수를 넣어 녹인 다음 HPLC용 갈색 vial병에 담아 HPLC로 분석하였다.
- 0으로 구분하여 실시하였다. 무처리구는 수돗물(EC 0.3), 양액 EC 값은 일본원예처방액(Kimiharu et al., 2010)을 기본으로 해서[대조구(EC 2.0)] NaCl를 첨가하여 EC 4.0, EC 8.0으로 조절하고, EC 1.0은 희석하였다(Table 1). 한 실험구 당 비트, 순무 시료는 4반복으로 하고, 일본원예처방액은 1주 2회씩, 총 4주간 처리하였다.
- 무처리구는 수돗물, 대조구는 EC 2.0, 실험구는 EC 1.0, EC 4.0, EC 8.0으로 구분하여 실시하였다. 무처리구는 수돗물(EC 0.
- 베타시아닌 분석은 Synergi 4 µ POLAR-RP 80A 컬럼 (250×4.6 mm, 4 µm Phenomenex)을 장착한 1200 series HPLC (Agilent Technologies, CA, USA)를 사용하였다.
-
베타시아닌 추출 및 분석
분말시료(100 mg)를 칭량하여 2.0 mL-eppendorf tube에 넣고 2.0 mL 초순수를 넣고 5분 동안 진동혼합(vortex) 한 후 초음파 분산기(sonicator)로 15분간 약하게 초음파 처리(sonication)를 하였다. 그 다음 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 15 min) 한 후, Sep-pak Plus C18 Cartridges을 통과 시켜 추출물을 정제시켰다.
- 분석 조건은 검출 파장(detection wavelength) 227 nm, 유량(flow rate) 0.4 mL/min, 컬럼 온도(column temperature) 40°C로 설정하여 분석하였다.
- 분석 조건은 검출 파장(detection wavelength) 538 nm, 유량 (flow rate) 1.0 mL/min, 컬럼 온도(column temperature) 35°C로 설정하여 분석하였다.
- 1분에 0%로 급격히 감소시킨 후 25분까지 0%를 유지시켰다. 분석된 각 성분은 외부표준물질인 Betanin의 머무름 시간(retention time, RT)이 동일하여 동정하였고, HPLC 피크 면적(area)을 기준으로 각 베타시아닌 성분의 피크 면적을 비교하여 정량하였다.
- 3%)에서 가장 높았다. 수확 후 일본원예처방액에 의한 EC 값 조절에 따른 변화를 살펴보았다. 비트와 순무의 생장은 EC 2.
- 한 실험구 당 비트, 순무 시료는 4반복으로 하고, 일본원예처방액은 1주 2회씩, 총 4주간 처리하였다. 수확한 작물은 실험 구별 생육상태(엽장, 엽폭, 생체중 등)를 측정하고, 동결건조 후 막자와 막자사발로 분말화하였다.
- 용출시킨 시료는 0.45 µm hydrophilic PTFE syringe filter (직경 13 mm)로 여과한 후, HPLC용 갈색 vial병에 담아 HPLC로 분석하였다.
- 0 mL-Eppendorf tube를 원심분리(12¸000 rpm, 4°C, 10 min)하였고, 분리된 상층액은 시험관(test tube)에 수거하였다. 위 과정을 동일하 게 2회 더 반복하여, 총 3회 실시하였고 각 상층액을 수거하여 합하였다. Mini-column (1¸000 µL pipet tip) 충진용 DEAE Sephadex A-25는 초순수에 녹여서 분액여두에 넣은 다음 초순수가 거의 빠져나간 다음에 sodium acetate (0.
- 5 mL를 넣어 진동혼합 (vortex)하였다. 진동혼합 후 항온수조(75℃)에서 5분간 조 (crude) GSLs를 추출하였다. 이후 2.
- 시중에서 구입한 비트[‘제일비트’, 제일종묘재단]와 순무 [‘강화순무’, 아시아종묘㈜]를 2017년 9월 2일(0 DAS, days after sowing) 충남대학교 농업생명과학대학 부속 유리온실에서 육묘 트레이(plug tray, 105홀)에 파종하였다. 파종을 하고 육묘 트레이르 신문지로 덮고 물을 주어 발아의 적정 습도를 유지시켰다. 비트는 55개, 순무는 50개를 파종하였고, 각각 100, 98%의 발아율을 나타내었다.
- 평균 온도 23°C, 광량 180~205 μmol․m-2․s -1, 광주기 주/야 11/13 h, 습도 9~12%인 환경에서 재배를 하였다.
- 0은 희석하였다(Table 1). 한 실험구 당 비트, 순무 시료는 4반복으로 하고, 일본원예처방액은 1주 2회씩, 총 4주간 처리하였다. 수확한 작물은 실험 구별 생육상태(엽장, 엽폭, 생체중 등)를 측정하고, 동결건조 후 막자와 막자사발로 분말화하였다.
대상 데이터
- 개미산(formic acid, HCOOH)은 Samchun Chemicals (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다. Acetonitrile (CH3CN), methanol (MeOH, CH3OH)은 J.T. Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ, USA) 것을 사용하였다. Sodium acetate (NaC2H3O2․3H2O)와 ethanol (EtOH)은 Samchun Pure Chemical Co.
- (Phillipsburg, NJ, USA) 것을 사용하였다. Sodium acetate (NaC2H3O2․3H2O)와 ethanol (EtOH)은 Samchun Pure Chemical Co., Ltd. (Pyeongtaek, Korea)에서 구입하였다. 컬럼 충진물인 DEAE-Sephadex A-25는 GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden) 것을 사용하였고, aryl sulfatase (type H-1, EC 3.
- 개미산(formic acid, HCOOH)은 Samchun Chemicals (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다. Acetonitrile (CH3CN), methanol (MeOH, CH3OH)은 J.
- 파종을 하고 육묘 트레이르 신문지로 덮고 물을 주어 발아의 적정 습도를 유지시켰다. 비트는 55개, 순무는 50개를 파종하였고, 각각 100, 98%의 발아율을 나타내었다. 파종 후 7일(7 DAS)에 비트와 순무는 중형포트(13×13×15 cm3, 간척지 토양 2.
-
토양 채취 및 분석
석문 간척지(충청남도 당진시 송산면 가곡리 송산2공구 7 단지) 토양을 채취하여 포트실험(간척지 토양 2.34 kg)을 하였다. 간척지 토양을 채취할 때 토양 수분(37.
- 시중에서 구입한 비트[‘제일비트’, 제일종묘재단]와 순무 [‘강화순무’, 아시아종묘㈜]를 2017년 9월 2일(0 DAS, days after sowing) 충남대학교 농업생명과학대학 부속 유리온실에서 육묘 트레이(plug tray, 105홀)에 파종하였다.
- 0 μL 주입하였다. 이동상 용매는 solvent A(초순수)와 solvent B(acetonitrile, CH3CN)를 사용하였다. 용매 구배는 solvent B를 기준으로 실시하였고 총 27분의 분석 시간이 소요되었다.
- 0 μL 주입하였다. 이동상 용매는 solvent A[water: formic acid, (99: 1, v/v)]와 solvent B (acetonitrile, CH3CN)를 사용하였다. 용매 구배는 solvent B를 기준으로 실시하였고 총 25분의 분석 시간이 소요되었다.
데이터처리
- HPLC 분석 결과는 Microsoft Office Excel 2010을 이용하여 각 성분에 대한 함량의 평균값과 반복의 표준편차를 구하였다. 통계처리 프로그램은 Windows용 IBM SPSS 22 Statistics을 사용하였다.
- 통계처리 프로그램은 Windows용 IBM SPSS 22 Statistics을 사용하였다. 유의수준은 0.05 이하로 설정하였고, Tukey 검정을 시행하여 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- EC 값 차이에 따른 염 스트레스를 입은 비트와 순무의 잎 상태를 보면 EC 값이 높을수록 잎이 말려 오므라지거나 일부분 황백화현상이 일어났다(Table 2). 비트(Beta vulgaris L.
- 각 GSL 성분별 함량 범위는 progoitrin (0.20~0.68), sinigrin (0.21~0.49), glucoalyssin (0.98 ~2.17), gluconapoleiferin (0.13~0.40), gluco-brassicanapin (0.13~0.83), glucobrassicin (0.23~1.00), 4-methoxyglucobrassicin (0.10~0.41), gluconasturtiin (0.37~0.72), neoglucobrassicin (0.66~1.33 μ mol/g dry wt.)으로 나타났다.
- 각 GSL 성분별 함량 범위는 progoitrin (0.49~3.16), glucoalyssin (0.21~0.33), gluconapoleiferin (0.44~1.49), gluco-brassicanapin (1.46~3.98), glucobrassicin (0.32~1.04), 4-methoxyglucobrassicin (0.33~0.60), gluconasturtiin (7.63~10.96), neoglucobrassicin (0.94~1.78 μmol/g dry wt.)으로 나타났다.
- 51배 낮았다. 각 베타시아닌 성분별 함량 범위는 betanin (161.16~292.59), isobetanin (54.09~75.82 mg/g dry wt.)으로 나타났다. Betanin 함량은 무처리구(324.
- , 2015). 본 연구에서 EC 깂에 따른 GSL 함량은 통계적 차이가 없었지만, 순무 잎의 총 GSL 함량은 EC 값이 높을수록 감소하였다. 이 결과는 Na+ 과 Cl-가 많아 염 스트레스를 받아 수분포텐셜의 저하, 이온의 흡수 및 수송의 억제에 의한 영양불균형을 일으켜 수분흡수장애가 나타나 물질 생산이 크게 저하된 것으로 사료된다.
- Cl-은 높은 농도에서 베타시아닌 합성을 저해하기 때문에, Amaranthus 묘목은 NaCl 농도 처리를 높게 할수록 베타시아닌 합성이 감소하였다(Elliott, 1979). 본 연구에서는 EC 값이 높을수록 베타시아닌 함량은 감소하였다.
- 비트 내 베타시아닌을 HPLC로 분석한 결과, 2종류의 베타시아닌(betanin, isobetanin)를 분리하였다(Table 4, Fig. 3). 실험구[무처리구, EC 1.
- 순무 내 GSLs를 HPLC로 분석한 결과, 뿌리 내에서는 총 8종류의 GSLs (progoitrin, glucoalyssin, gluconapoleiferin, glucobrassicanapin, glucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin, glucona sturtiin, neoglucobrassicin)를 분리하였고, 잎 내 에서는 뿌리에서 분리한 8종류에 sinigrin을 더해서 총 9종류의 GSLs를 분리하였다(Table 6, Fig. 4). 순무 뿌리에서, 총 GSL 함량은 EC 2.
- )으로 나타났다. 순무의 뿌리와 잎을 비교 분석해 본 결과, EC 2.0 대조구에서 재배한 순무가 가치가 높을 것으로 판단된다. 식물은 스트레스가 많은 환경조건(염, 수분, 온도, 광 스트레스 등)에 노출되었을 때 자신을 보호하기 위한 방어 기작의 하나로써 항산화 물질을 포함한 다양한 이차대사산물을 생합성하여 식물체내에 축적하게 된다(Dixon and Paiva, 1995; Davies, 1995; Hwang et al.
- 3). 실험구[무처리구, EC 1.0, 대조구(EC 2.0), EC 4.0, EC 8.0] 에서 총 베타시아닌 함량은 EC 2.0 대조구(327.46)와 비교하였을 때, 무처리구(425.29)에서는 약 1.29배 높았고, EC 1.0 실험구(368.41)에서는 대조구보다 1.12배 높았다(Table 5). EC 4.
- 본 연구에서 EC 깂에 따른 GSL 함량은 통계적 차이가 없었지만, 순무 잎의 총 GSL 함량은 EC 값이 높을수록 감소하였다. 이 결과는 Na+ 과 Cl-가 많아 염 스트레스를 받아 수분포텐셜의 저하, 이온의 흡수 및 수송의 억제에 의한 영양불균형을 일으켜 수분흡수장애가 나타나 물질 생산이 크게 저하된 것으로 사료된다. 이러한 연구 결과의 불일치는 환경의 다양성과 식물 발달 단계 및 식물 기관의 다양성에서 기인한다고 생각된다.
- 8 g)에서 가장 높았다. 잎의 수분함량은 EC 1.0 실험구(91.5)에서, 뿌리의 수분함량은 EC 1.0 실험구(84.2%)에서 가장 높았다.
- 2 g)에서 가장 높았다. 잎의 수분함량은 EC 1.0 실험구(93.4)에서, 뿌리의 수분함량은 EC 1.0 실험구 (86.3%)에서 가장 높았다. 수확 후 일본원예처방액에 의한 EC 값 조절에 따른 변화를 살펴보았다.
후속연구
- 이러한 염농도 수준에 따른 작물의 수량 반응 및 내염성 자료는 간척지 밭에 정식 또는 파종 될 수 있는 작물을 선발하는데 기초 자료로 활용될 가치가 있다. 그리고 향후 간척지에 도입될 가능성이 있는 경제작물을 위한 염농도 및 수분 관리 기술 개발 연구에 활용이 가능하다.
- 본 실험에서는 간척지 밭작물 재배 작부체계 매뉴얼 개발을 위하여 간척지 토양에서 재배 가능한 작물 선별을 목표로 원예작물 중 내염성에 대하여 MT 등급인 비트와 MS 등급인 순무를 양액 재배하여 NaCl 처리 농도(EC 값 기준)에 따른 2차 대사산물인 베타시아닌과 GSL 함량에 미치는 영향을 조사하였다. 이러한 염농도 수준에 따른 작물의 수량 반응 및 내염성 자료는 간척지 밭에 정식 또는 파종 될 수 있는 작물을 선발하는데 기초 자료로 활용될 가치가 있다. 그리고 향후 간척지에 도입될 가능성이 있는 경제작물을 위한 염농도 및 수분 관리 기술 개발 연구에 활용이 가능하다.
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