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문제 정의
- 본 연구에서는 앞서 소개한 화장품 소재로서 항산화, 미백 작용에 대한 연구결과들을 바탕으로 paeoniflorin과 paeonol 두 성분을 지표성분으로 동시에 고려하여 각각 60 μg/mL 이상을 농도 기준으로 설정하고, 그 이상을 함유하는 모란 추출액을 제조하고자 하였다.
제안 방법
- 1. Paeoniflorin과 paeonol을 두 가지 지표성분으로 하여 항산화, 미백 활성을 위한 천연 화장품 원료로서 모란 전초를 이용할 수 있는 함량 기준을 설정하였다. 뿌리, 잎, 꽃 부위별두 성분의 함량과 추출용매, 추출온도, 추출 시간, 부위별 배합비율에 따른 paeoniflorin 과 paeonol의 함량 변화를 평가하였다.
- 30% 1,3-BG, 75℃, 4 h 추출조건에서 뿌리, 잎, 꽃의 최종 배합비율로 선정한 2+2+1g/0.5kg 를 10kg 배치 크기까지 스케일업 하면서 제조하였으며 그 추출액 중의 paeoniflorin과 paeonol의 농도를 Table 6에 나타내었다. 0.
- Paeoniflorin과 paeonol의 분석에 관한 선행 연구들을 참조로 하여 모란 추출액 속의 paeoniflorin과 paeonol의 함량을 동시에 정량하기 위한 방법을 검토하고 본 연구실의 조건에 맞게 변경하고 Table 2에서와 같이 정량분석을 실시하였다[5, 6, 14-17].
- 이 조건에서 추출할 때 뿌리, 잎, 꽃의 적절한 배합비울을 선정하기 위하여 여러 가지 비율로 배합한 원료로 추출액을 제조한 후 paeoniflorin과 paeonol의 농도를 비교하여 Table 5에 나타내었다. 기준 농도의 paeonol을 얻기에 충분하다고 판단되는 뿌리의 양을 2 g으로 결정하고 뿌리, 잎, 꽃 각 부위로부터 예상되는 paeoniflorin의 농도를 고려하여 잎과 꽃의 양을 2.5+0.5g, 2+1g, 1.5+1.5g, 1+2g으로 조절해 보았다. Paeonol의 농도는 모든 배합조건에서 유사한 농도를 보였고, 잎과 꽃의 상대적인 비율이 높을수록 paeoniflorin의 농도가 약간 높은 경향을 보였다.
- 두 가지 보관용 표준용액을 혼합한 후 계열 희석하여 검량선(두 성분 각각 400, 200, 100, 50, 20, 10, 5 μ g/mL)과 QC(두 성분 각각 320, 80, 15 μ g/mL)용 검액을 조제한 후 증류수로 2배 희석하였다.
- 본 실험에서는 모란 중의 성분 분석에 관한 선행연구[1,3,4]을 참고하여, HPLC-UV를 이용한 paeoniflorin과 paeonol의 동시분석 조건을 설정 하고 이에 대한 검증을 수행하였다.
- Paeoniflorin과 paeonol을 두 가지 지표성분으로 하여 항산화, 미백 활성을 위한 천연 화장품 원료로서 모란 전초를 이용할 수 있는 함량 기준을 설정하였다. 뿌리, 잎, 꽃 부위별두 성분의 함량과 추출용매, 추출온도, 추출 시간, 부위별 배합비율에 따른 paeoniflorin 과 paeonol의 함량 변화를 평가하였다.
- 뿌리, 잎, 꽃 부위별로 추출 시 paeoniflorin과 paeonol의 농도 수준을 확인하기 위해 각 부위별로 30% 1,3-BG 추출용매에서 80℃, 6 h 동안 추출하여 두 성분의 농도를 분석한 결과를 Table 3에 나타내었다. 식물 각 부위 원재료의 사용량은 1 g과 4 g 두 방법으로 추출액을 제조하였다. Paeoniflorin은 뿌리뿐만 아니라 잎, 꽃에서도 다량으로 존재하며 뿌리에 비해 잎, 꽃에서 더 높은 농도를 보인 반면, paeonol은 뿌리에서만 존재하고 잎과 줄기에서는 검출되지 않았다.
- 시험물질은 시험이 종료되는 기간까지 냉장, 차광보관 하였다. 예비적으로 추출용매 종류의 영향, 원재료 부위 간의 차이, 뿌리의 세절 크기의 영향을 비교하는 단계에서 추출조건을 80℃, 6 h으로 하였으며, 그 후 여러 추출온도에서의 농도를 비교하기 위해 45℃, 60℃, 75℃, 그리고 90℃까지 검토하였다. 추출시간에 따른 차이를 비교하는 단계에서는 추출온도를 75℃로 하였다.
- 실험에 사용된 모란꽃, 모란잎/줄기, 목단피, 모란 묘목은 ㈜카낙스바이오에서 구매 후 40℃ 이하에서 음건한 후 그물망에 넣어 보관하였다. 원물 각 2 g을 100℃, 1h 조건에서 수분측정기 (FD-610)로 함수율을 측정하여 20% 이내인 것을 확인하고 사용하였다. 모란잎/줄기의 함수율은 7.
- 이동상인 0.1% acetic acid in distilled water 와 acetonitrile을 기울기용리(gradient) 조건으로 20분간 흐르게 하여 paeoniflorin과 paeonol을 분리, 확인하였다. Paeoniflorin이 5.
- 본 연구에서는 앞서 소개한 화장품 소재로서 항산화, 미백 작용에 대한 연구결과들을 바탕으로 paeoniflorin과 paeonol 두 성분을 지표성분으로 동시에 고려하여 각각 60 μg/mL 이상을 농도 기준으로 설정하고, 그 이상을 함유하는 모란 추출액을 제조하고자 하였다. 이를 위하여 고성능액 체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 paeoniflorin과 paeonol 두 성분을 동시 정량하는 분석법을 설정한 후, 모란 전초를 사용하여 뿌리, 잎, 꽃 부위별로 paeoniflorin과 paeonol 성분의 분포를 파악하고 원재료의 배합비율, 용매, 온도, 시간 등의 추출조건에 따른 함량을 비교 검토하여 모란 추출액 제조를 위한 최적의 공정을 제안하고자 하였다.
-
추출 온도를 45℃, 60℃, 75℃ 및 90℃로 달리 하여 추출한 액 중 paeoniflorin과 paeonol의 농도를 비교하기 위하여, 뿌리, 잎, 꽃 각 부위별로 4g/0.5kg of batch 크기로 하여 30% 1,3-BG 추출용매에서 6시간 동안 추출하였다(Fig. 2). 뿌리, 잎, 꽃 모두 추출온도가 높을수록 두 성분의 농도가 높아지는 경향을 보였는데, 75℃에 비해 9
- 추출기에 원재료와 추출용매를 혼합하여 총중량 0.5 kg으로 하여 추출기 안에서 여러 추출 조건 하에 추출한 후 추출액을 0.20 μm 멤브레인 필터(Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA)로 여과하여 시험물질을 제조하였다.
- 추출을 위해 사용하는 모란 뿌리 원재료의 조각 크기 또는 분쇄 정도가 추출 후 paeoniflorin 과 paeonol의 농도에 미치는 영향을 평가하기 위하여 구입한 형태 그대로의 조각(>1 cm), 조과립 형태로 크게 분쇄 및 작게 분쇄(직경<1mm)한 뿌리 4 g를 각각 사용하여 0.5 kg 배치 크기로 추출액을 제조했다.
대상 데이터
- HPLC 시스템은 Waters 2690 HPLC separating system (Milford, MA, USA), UV detector는 Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector (Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 분석용 컬럼은 Phenomenex Luna C18(2) column (250 x 4.6 mm, 5 µm, Phenomenex, USA)를 사용하였다.
- Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. Paeoniflorin(Paeoniflorin-2015, 99.7%)과 paeonol(Paeonol-2007, 100%) 표준품은 식품의 약품안전처(Osong, Korea)로부터 생약 지표성분 표준품을 분양받아 사용하였다.
- 정량 분석에 사용된 용매와 시약은 HPLC용 acetonitrile 및 물과 초산은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. Paeoniflorin(Paeoniflorin-2015, 99.
- 추출에 사용된 용매는 2차증류수와 시약용 1,3-butylene glycol(대정화금(주), 시흥, 한국)을 사용하였다.
- 두 가지 보관용 표준용액을 혼합한 후 계열 희석하여 검량선(두 성분 각각 400, 200, 100, 50, 20, 10, 5 μ g/mL)과 QC(두 성분 각각 320, 80, 15 μ g/mL)용 검액을 조제한 후 증류수로 2배 희석하였다. 함량분석을 하고자 하는 모란 추출액 시료는 acetonitrile로 2배 희석한 후 최종 분석에 사용하였다.
성능/효과
- (1) 표준검량선은 7개 중 최소 5개(최저정량한계 및 최고정량한계는 제외) 의 calibration point로 작성되어야 하며, 작성된 calibration point의 역산출된 농도는 정확도가 ±15%를 초과하지 않으며 LLOQ에서는 20%까지 허용한다.
- (2) QC 시료는 농도당 6개 시료 중 최소 4개에서 정확도가 ±15% 이내에 있어야 하며, 6개의 QC 시료 중에서 2개가 범위를 벗어나는 경우 서로 다른 농도여야 한다.
- 물에서보다 1,3-BG를 용매로 사용했을 때 추출액 중 paeoniflorin, paeonol 모두 더 높은 농도를 보였다. 1,3-BG의 농도가 높을수록 추출액 중 두 성분의 농도가 높은 경향을 보였으나 30%와 45% 간에는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 30% 1,3-BG 용매에서 80℃, 6 h 추출액 중의 paeoniflorin과 paeonol의 농도는 각각 123.
- 2 h에서 4 h까지는 비교적 급격한 농도 상승을 보인 반면 1 h 이후로는 농도 상승 기울기가 비교적 완만해졌는데, 4 h 추출 후 paeoniflorin과 paeonol의 농도가 뿌리는 56.49 ± 5.652 μg/mL 및 203.1 ± 11.23 μg/mL, 잎과 꽃에서는 paeoniflorin만 검출되어 각각 105.3 ± 12.17 μg/mL, 68.32 ± 11.94 μg/mL이었으며 8시간 추출 후의 농도 대비 paeoniflorin 75%~83%, paeonol 89%의 수준에 도달했다.
- 2. Paeonol은 뿌리에서만 검출되었고 paeoniflorin은 잎, 꽃에서의 농도가 뿌리에서보다 높았다. 뿌리의 절도는 적당한 입자 크기로 분쇄한 후 추출할 때 두 성분 모두 농도가 높았다.
- 3. 추출온도와 시간은 고온, 장시간일수록 지표 성분의 농도가 높은 경향을 보였으나 각각 75℃, 4 h 이상에서는 상승 기울기가 완만해졌다. 뿌리, 줄기, 꽃의 배합 비율은 2+2+1g/0.
- 4. 뿌리, 줄기, 꽃을 2+2+1g/0.5kg 비율로 배합 하고 30% 1,3-butylene glycol을 추출용매로 사용하여 75℃에서 4 h 동안 추출하는 방법이 두 지표성분의 함량 기준과 제조공정의 비용을 고려할 때 최적의 조건이라고 판단하였다. 이 조건에서 10 kg의 제조 규모까지 스케일업하고 두 지표성분의 함량이 유지됨을 확인할 수 있었다.
- 5. 본 연구를 통해 모란의 전초를 사용함으로써 모란과 작약의 지표성분인 paeonol과 paeoniflorin을 동시에 품질관리 기준 이상으로 함유하는 모란추출액을 제조할 수 있었다. 이 기준을 실제 제조과정에 적용하여 화장품 원료로서 모란 추출액의 품질 관리를 위한 내부기준으로 활용할 수 있을 것이 다.
- 5g, 1+2g으로 조절해 보았다. Paeonol의 농도는 모든 배합조건에서 유사한 농도를 보였고, 잎과 꽃의 상대적인 비율이 높을수록 paeoniflorin의 농도가 약간 높은 경향을 보였다. 그 중에서 뿌리, 잎, 줄기 배합비율을 2+2+1g/0.
- 두 성분 모두 냉장(3.4 ± 0.1℃) 보관 조건에서 최소 4주 동안 안정한 것으로 평가되었다.
- 또한 모든 batch에서 3 농도(15, 80, 320 μg/mL) 의 QC 시료의 정밀도는 paeoniflorin은 각각 5.4, 3.0, 3.3%, paeonol은 각각 5.0, 4.9, 4.5%로 나타났으며, QC 시료의 정확도는 paeoniflorin은 98.89%~100.4%, paeonol은 100.4%~100.9%로 기준에 적합한 결과를 보였다.
- 모든 분석배치에서 최소정량한계 농도는 5 μ g/mL이었고, 표준검량선의 결정계수(r2)는 paeoniflorin과 paeonol의 모든 batch에서 각각 0.9990 이상으로 좋은 직선성을 보였다.
- 원물 각 2 g을 100℃, 1h 조건에서 수분측정기 (FD-610)로 함수율을 측정하여 20% 이내인 것을 확인하고 사용하였다. 모란잎/줄기의 함수율은 7.5 ~ 8.5 %, 모란꽃의 함수율은 약 9.0~16.9%, 목단피의 함수율은 10.2~11.1%로 측정되었다.
- 5kg of batch로 배합하여 물, 15% 1,3-BG, 30% 1,3-BG, 45% 1,3-BG 4가지 추출용매에서 8 0℃, 6 h 동안 추출하여 용매조건을 비교한 결과를 Table 2에 나타내었다. 물에서보다 1,3-BG를 용매로 사용했을 때 추출액 중 paeoniflorin, paeonol 모두 더 높은 농도를 보였다. 1,3-BG의 농도가 높을수록 추출액 중 두 성분의 농도가 높은 경향을 보였으나 30%와 45% 간에는 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 3에 나타내었다. 뿌리, 잎, 꽃 모두 추출시간을 길게 할수록 추출액 중 농도가 높아지는 경향을 보였다. 2 h에서 4 h까지는 비교적 급격한 농도 상승을 보인 반면 1 h 이후로는 농도 상승 기울기가 비교적 완만해졌는데, 4 h 추출 후 paeoniflorin과 paeonol의 농도가 뿌리는 56.
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2). 뿌리, 잎, 꽃 모두 추출온도가 높을수록 두 성분의 농도가 높아지는 경향을 보였는데, 75℃에 비해 9
0℃에서는 유의한 변화를 보이지 않았고 오히려 감소한 경우도 있었다. 75℃에서 추출한 액에서 paeoniflorin과 paeonol의 농도는 뿌리는 62. - 추출온도와 시간은 고온, 장시간일수록 지표 성분의 농도가 높은 경향을 보였으나 각각 75℃, 4 h 이상에서는 상승 기울기가 완만해졌다. 뿌리, 줄기, 꽃의 배합 비율은 2+2+1g/0.5kg로 할 때 두 지표성분의 목표 농도에 도달 가능했다.
- Paeonol은 뿌리에서만 검출되었고 paeoniflorin은 잎, 꽃에서의 농도가 뿌리에서보다 높았다. 뿌리의 절도는 적당한 입자 크기로 분쇄한 후 추출할 때 두 성분 모두 농도가 높았다. 추출용매로는 30% 1,3-butylene glycol 을 사용할 때 농도가 가장 높았다.
- 3% 이하를 나타냈다. 역산출한 검량선 농도의 정확도(accuracy)는 전체 정량범위에서 paeoniflorin은 98.43%-101.8%, paeonol은 94.98-101.8%로 기준에 적합한 결과를 나타내어, 예상할 수 있는 모란 추출액 중 두성분의 미량까지 검출 및 정량이 가능하였다. 또한 모든 batch에서 3 농도(15, 80, 320 μg/mL) 의 QC 시료의 정밀도는 paeoniflorin은 각각 5.
- 추출조건은 30% 1,3-BG 추출 용매에서 80℃, 6 h 동안 추출하였으며 그 결과를 Table 4에 나타내었다. 원래의 형태 그대로 사용한 것에 비해 분쇄한 후 추출했을 때 추출액 중의 두 성분의 농도가 더 높았으며 paeonol보다 paeoniflorin의 농도에서 그 차이가 뚜렷했다. 크게 또는 작게 분쇄한 것 중에서는 paeoniflorin의 농도는 60.
- Paeoniflorin은 뿌리뿐만 아니라 잎, 꽃에서도 다량으로 존재하며 뿌리에 비해 잎, 꽃에서 더 높은 농도를 보인 반면, paeonol은 뿌리에서만 존재하고 잎과 줄기에서는 검출되지 않았다. 원재료의 양을 1 g에서 4 g으로 증량하여 추출했을 때도 같은 경향을 보이면서 paeoniflorin과 paeonol의 농도가 sub-proportional하게 증가하는 양상을 보였다.
- 5kg 비율로 배합 하고 30% 1,3-butylene glycol을 추출용매로 사용하여 75℃에서 4 h 동안 추출하는 방법이 두 지표성분의 함량 기준과 제조공정의 비용을 고려할 때 최적의 조건이라고 판단하였다. 이 조건에서 10 kg의 제조 규모까지 스케일업하고 두 지표성분의 함량이 유지됨을 확인할 수 있었다.
- 추출 온도와 시간의 변화가 추출액 중의 paeoniflorin과 paeonol의 농도에 미치는 영향을 검토 결과로부터 30% 1,3-BG 추출용매를 사용 하여 75℃에서 4 h 동안 추출하는 방법이, 본 기술개발사업에서 목표로 한 두 지표성분의 기준 농도 이상에 도달하면서 제조공정 상의 시간, 비용을 함께 고려할 때 최적의 추출조건이라고 판단하였다. 이 조건에서 추출할 때 뿌리, 잎, 꽃의 적절한 배합비울을 선정하기 위하여 여러 가지 비율로 배합한 원료로 추출액을 제조한 후 paeoniflorin과 paeonol의 농도를 비교하여 Table 5에 나타내었다.
- 추출 온도와 시간의 영향 검토 결과로부터 7 5℃, 4 h 조건에서 추출하는 방법이 목표로 하는 두 지표성분의 기준 농도 이상인 추출액을 얻을 수 있으며, 제조공정 상의 시간, 비용을 함께 고려할 때 최적의 추출조건이라고 판단하였다.
- 항산화작용 및 미백작용에 대한 연구들을 살펴보면, 목단피 추출물 125 μ g/mL이 가지는 a,a-diphenyl-b-picrylhydrazyl (DPPH) free radical 소거능이 57.4%였고 1000 μg/mL에서는 84.7%로 항산화제로 널리 이용 되는 vitamin C 1 mg/mL에 비해 다소 낮으나 우수한 항산화 효과를 보이는 것으로 확인되었다.
후속연구
- 이 기준을 실제 제조과정에 적용하여 화장품 원료로서 모란 추출액의 품질 관리를 위한 내부기준으로 활용할 수 있을 것이 다. 또한 액상 화장품 원료인 모란 추출액을 물파우더 등의 다른 화장품 제형에 적용할 때도 활용할 수 있을 것으로 기대하며, 모란 외의 다른 천연 화장품 소재 개발에서도 이 같은 품질관리 노력을 지속해야 할 것으로 사료된다.
- 본 연구를 통해 모란의 전초를 사용함으로써 모란과 작약의 지표성분인 paeonol과 paeoniflorin을 동시에 품질관리 기준 이상으로 함유하는 모란추출액을 제조할 수 있었다. 이 기준을 실제 제조과정에 적용하여 화장품 원료로서 모란 추출액의 품질 관리를 위한 내부기준으로 활용할 수 있을 것이 다. 또한 액상 화장품 원료인 모란 추출액을 물파우더 등의 다른 화장품 제형에 적용할 때도 활용할 수 있을 것으로 기대하며, 모란 외의 다른 천연 화장품 소재 개발에서도 이 같은 품질관리 노력을 지속해야 할 것으로 사료된다.
- 3%이며 tyrosinase 활성을 유의하게 억제하면 서도 세포독성은 없는 농도로서, 이는 잘 알려져 있는 한약재인 감초, 인삼, 창출 추출물을 같은 농도로 처리할 때보다 우수한 효능이라고 한다 [13]. 이러한 결과들은 모란 추출액을 미백 및 노화방지 화장품 개발에 활용할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.
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