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문제 정의
- 본 실험은 加味桃紅四物湯의 이상지질혈증에 대한 효과를 객관적으로 증명하기 위해 in vitro 실험으로 HUVEC cell을 이용해 加味桃紅四物湯이 eNOS, KLF2, VCAM-1, ICAM-1의 유전자 발현양에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Column 하단을 Ep tube로 교체한 후 column에 elution buffer를 50 μl 넣고 1분 동안 반응시킨 뒤 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 추출된 total RNA를 모았다.
- HUVEC cell의 RNA를 추출하여 reverse transcription 을 통해 cDNA를 합성하였다. 이후 polymerase chain reaction(PCR)을 통하여 유전자를 증폭시켜 전기 영동하여 UV촬영을 통해 각 유전자의발현양을 확인하였다.
- 桂枝는 溫經通脈, 通陽化氣하는 효능이 있으며 當歸, 芍藥, 桃仁 등의 活血祛瘀 약을 배합하여 氣血凝滯로 인한 병증을 치료한다. 단미제로써 이들 약제들이 이상지질 혈증에 대하 유효한 효능이 있는 것은 아직 확인 되지는 않았으나 한의학적 약리효과를 근거로 桃 紅四物湯에 상기 약재들을 포함하여 加味한 GDT 을 이용해 실험을 설계하였으며 기초 실험에서 GDT 가 桃紅四物湯에 대해 효과적인 결과를 나타내어 실험을 시행하게 되었다.
- 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, GDT 1, 10, 100(μg/ml) 의 농도와 1 μg/ml TNF-α를 함께 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 합성된 cDNA 2 μl와 primer F 1 μl, primer R 1 μl, DEPC-DW 16 μl 넣고 Table 2와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 생성된 product를 1.5% agarose gel에서 100 V로 30분 동안 전기영동한 후 Fusion Quick Guide를 이용하여 UV촬영을 통해 결과를 확인하였다.
- 역전사(reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture(reaction buffer, dNTPs mixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15 primer)를 사용하여 total RNA 1 μg이 되도록 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수에 최종 부피가 20 μl가 되도록 하여 첨가하였다.
- 기존 桃紅四物湯에 관한 연구로는 대한 연구로는 순환기 계통에 관한 연구, 부인과적 질환에 관한 연구, 뇌신경계 질환에 대한 연구가 보고 되었으나 이상지질혈증에 대한 연구는 없었다10-13. 이에 이상지질혈증에 대한 桃紅四物湯의 효능을 확인하기 위해 실험을 계획하였으며, 活血祛瘀 효능을 높이기 위해 麥門冬, 麻子仁, 桂枝, 人蔘 등을 加味하여 加味桃紅四物湯(GDT)을 사용하였다.
- Statin 계열의 약물이 KLF-2를 조절하여 이상지질혈증에 대한 치료 작용을 나타낸다. 이와 더불어 혈관투과 성과 관계한 ICAM-1, VCAM-1을 통해 약물이 나타내는 이상지질혈증에 대한 효과를 유추할 수 있으며 이를 확인하는 실험을 설계하여 加味桃紅四 物湯(GDT)의 세포내 이상지질혈증에 대한 효과를 확인하였다.
- HUVEC cell의 RNA를 추출하여 reverse transcription 을 통해 cDNA를 합성하였다. 이후 polymerase chain reaction(PCR)을 통하여 유전자를 증폭시켜 전기 영동하여 UV촬영을 통해 각 유전자의발현양을 확인하였다.
대상 데이터
- 1) 약 재본 실험에 사용한 加味桃紅四物湯(Gamidohongsamul -tang, GDT)의 구성 약재들은 ㈜옴니허브에서 구입하여 사용하였으며, 그 내용 및 분량은 다음과 같다(Table 1).
- HUVEC 세포는 EGM™-2 Medium과 EGM™-2 SingleQuots™ Kit으로 혼합된 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2-3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행 하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 18.0의 unpaired student's T-test와 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였고 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- HUVEC cell 내 ICAM-1 유전자 발현양을 측정하였으며 실험 결과 정상군은 22.32±4.54%, 대조군은 100.00±2.63%, 加味桃紅四物湯의 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각 99.13±1.49%, 85.15±2.70%, 25.73±3.92% 로 측정되어 加味桃紅四物湯이 10, 100(μg/ml) 농도에서 ICAM-1 유전자 발현양을 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 3).
- HUVEC cell 내 KLF-2 유전자 발현양을 측정 하였으며 실험 결과 정상군은 173.61±2.71%, 대조군은 100.00±1.74%, 加味桃紅四物湯의 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각 101.66±1.67%, 154.88±3.42%, 166.31± 2.63%로 측정되어 加味桃紅四物湯이 10, 100(μg/ml) 농도에서 KLF-2 유전자 발현양을 유의성 있게 증가시켰다(Fig. 2.).
- HUVEC cell 내 VCAM-1 유전자 발현양을 측정하였으며 실험 결과 정상군은 56.12±2.77%, 대조군은 100.00±2.32%, 加味桃紅四物湯의 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각 91.69±5.26%, 56.15±4.55%, 58.13±1.53% 로 측정되어 加味桃紅四物湯이 10, 100(μg/ml) 농도 에서 VCAM-1 유전자 발현양을 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 4).
- 세포 내 ICAM-1 유전자 발현양을 측정한 결과, 정상군을 22.32±4.54%, 대조군을 100.00±2.63%으로 나타냈을 때, 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각각 99.13± 1.49%, 85.15±2.70%, 25.73±3.92%로 나타나 10, 100 (μg/ml) 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(* : p<0.05, *** : p<0.001) 감소가 나타났다(Fig. 3).
- 세포 내 KLF2 유전자 발현양을 측정한 결과, 정상군을 173.61±2.71%, 대조군을 100.00±1.74%으로 나타냈을 때, 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각각 101.66± 1.67%, 154.88±3.42%, 166.31±2.63%로 나타나 10, 100 (μg/ml) 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01, *** : p<0.001) 증가가 나타났다(Fig. 2).
- 세포 내 VCAM-1 유전자 발현양을 측정한 결과, 정상군을 56.12±2.77%, 대조군을 100.00±2.32% 으로 나타냈을 때, 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각각 91.69±5.26%, 56.15±4.55%, 58.13±1.53%로 나타나 10, 100(μg/ml) 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (*** : p<0.001) 감소가 나타났다(Fig. 4).
- 세포 내 eNOS 유전자 발현양을 측정한 결과, 정상군을 144.11±3.43%, 대조군을 100.00±2.82%으로 나타냈을 때, 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각각 98.44± 5.86%, 123.77±5.15%, 127.98±4.60%로 나타나 10, 100 (μg/ml) 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는(* : p<0.05) 증가가 나타났다(Fig. 1).
- 실험을 통하여 加味桃紅四物湯이 HUVEC cell 에 대하여 eNOS, KLF-2 유전자 발현양을 증가시켰으며 ICAM-1, VCAM-1 유전자 발현양을 감소시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 加味桃紅四物 湯이 혈관의 경화를 억제하는 항이상지질혈증 효과가 있으리라 유추된다.
- 기존 이상지질혈증에 대한 단일 약재와 복합제에 대한 여러 연구들이 이루어졌으나 淸熱祛濕 효능을 이용한 연구와 달리 活血祛瘀 작용을 통한 연구는 적었다6,7. 이에 본 저자는 血脈에 발생하는 濕濁, 瘀血 또한 이상지질혈증의 범주에 속한다 유추하였으며 이를 근거로 活血, 化瘀, 化痰, 補血 효과가 있는 桃紅四物湯이 이상지질혈증을 치료하는데 효과적일 수 있을 것이라 판단하였다.
- 항이상지질혈증 효능을 확인하기 위해 HUVEC cell 내 eNOS 유전자 발현양을 측정하였으며 실험 결과 정상군은 144.11±3.43%, 대조군은 100.00±2.82%, 加味桃紅四物湯의 1, 10, 100(μg/ml) 농도에서 각 98.44±5.86%, 123.77±5.15%, 127.98±4.60%로 측정되어 加味桃紅四物湯이 10, 100(μg/ml) 농도에서 eNOS 유전자 발현양을 유의성 있게 증가시켰다(Fig. 1).
후속연구
- 이를 통해 加味桃紅四物 湯이 혈관의 경화를 억제하는 항이상지질혈증 효과가 있으리라 유추된다. 그러나 in vivo 실험이란 한계점이 있으며 in vitro 실험을 통하여 명확한 효능이 입증되어야 할 것으로 사료된다.
- 실험을 통하여 加味桃紅四物湯이 HUVEC cell 에 대하여 eNOS, KLF-2 유전자 발현양을 증가시켰으며 ICAM-1, VCAM-1 유전자 발현양을 감소시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 加味桃紅四物 湯이 혈관의 경화를 억제하는 항이상지질혈증 효과가 있으리라 유추된다. 그러나 in vivo 실험이란 한계점이 있으며 in vitro 실험을 통하여 명확한 효능이 입증되어야 할 것으로 사료된다.
- 加味桃紅四物湯은 eNOS와 KLF2 유전자 발현양을 유의성 있게 증가시켰으며 ICAM-1과 VCAM-1 유전자 발현양을 유의성 있게 감소시켰다. 이를 통해 加味桃紅四物湯은 in vitro 실험에서 항이상지 질혈증 효능이 있음을 확인하였으며, 향후 in vivo 실험을 통해 생체 내 효능을 확인하는 실험이 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.
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