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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 복합제품 등에 적용 가능한 실리마린 분석법을 개발 하였으며, 그 결과를 토대로 공전시험법을 개정하여 건강기능식품 품질관리의 효율성 및 신뢰성을 확보하고 국민건강에 이바지하고자 하였다.
제안 방법
- 3.3 σ/S를 검출한계(LOD)로 10 σ/S를 정량한계(LOQ)로 산출하였고, 실리크리스틴은 0.3, 0.8, 실리디아닌은 9.0, 27.3, 실리빈A은 3.3, 9.9, 실리빈B는 5.4, 16.3, 이소실리빈A는 4.9, 14.9, 이소실리빈B는 3.2, 9.7 μg/L이었다.
- LC-MS/MS를 이용한 실리마린(실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈A, 실리빈B, 이소실리빈A, 이소실리빈B) 분석법을 확립하고 유효성을 검증하였다. 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection), 정량한계(LOQ, limit of quantification), 정확도(Accuracy), 정밀도(Precision)등에 대해 검증하였으며, AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시하는 방법을 참고하였다15).
- 질량분석기를 이용한 분석은 전자분무이온화법(Electro-Spray Ionization, ESI)으로 음이온 모드(Negative ion mode)에서 수행하였다. 각 6개 실리마린 구성성분의 모분자에서 형성된 딸이온들에 대한 정량이온과 정성이온을 가장 감도가 크고 안정적으로 쪼개지는 이온들을 선정하기 위하여 문헌을 검토하고 예비시험을 실시하였다.
- 각각의 실험에서 희석용매(메탄올 : 5 mM 암모늄아세테이트 수용액 = 3 : 7)를 이용하여 표준원액을 적정농도로 단계별 희석한 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 표준용액으로 하였다.
- 검체량의 변화에 대한 반복 정밀도를 확인하기 위하여 검체를 각각 70 mg(실리마린으로서 10 mg 해당량), 105 mg(실리마린으로서 15 mg 해당량), 140 mg(실리마린으로서 20 mg 해당량)을 취하여 5회 반복 측정하였다. 각 농도의 상대표준편차는 각각 일내 1.
- 검체를 메탄올로 추출한 후 5 mM 암모늄아세테이트 수용액이 함유된 희석용매를 사용하여 단계별 희석하였다. 최적의 분석조건을 선정하기 위하여 메탄올과 5 mM 암모늄아세테이트 수용액의 혼합비율을 각각 10 : 90, 20 : 80, 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50 등 다양한 조성에서 비교분석하였다.
- 균질화한 시료를 실리마린으로서 약 10 mg 해당량을 정밀하게 달아 메탄올 100 mL에 녹이고 이 용액을 희석용매(메탄올 : 5 mM 암모늄아세테이트 수용액 = 3 : 7)로 적절한 농도로 희석한 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 하였다.
- 기질바탕시료에 실리마린표준용액을 각각 300, 600, 900 μg/L이 되도록 첨가하여 3회 반복 실험을 하였다.
- 분석감도를 증가시키기 위하여 검체를 메탄올로 추출한 후 5 mM 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올의 비율을 달리하면서 희석하여 시험하였다. 메탄올과 5 mM 암모늄아세테이트 수용액의 혼합비율을 각각(10 : 90), (20 : 80), (30 : 70), (40 : 60), (50 : 50) 등 다양한 조성에서 비교분석을 하여 최적조건을 확립하였다.
- 9 g당 실리마린 130 mg을 함유하는 유통제품을 구입하여 이용하였다. 반복성 시험에서는 실리마린으로서 10 mg, 15 mg, 20 mg에 해당하도록 검체 각각 70 mg, 105 mg, 140 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 실험실간 정밀도를 확인하기 위하여서는 두 실험실에서 각 5회 반복 측정하였다.
- 본 연구를 통하여 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 건강기능식품 중 정성·정량 가능한 실리마린 시험법을 확립하고 시험법 유효성을 검증하였다.
- 검체는 대부분의 문헌에서 메탄올 추출법을 사용하였고 본 시험에서도 메탄올을 추출용매로 사용하였다7-11). 분석감도를 증가시키기 위하여 검체를 메탄올로 추출한 후 5 mM 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올의 비율을 달리하면서 희석하여 시험하였다. 메탄올과 5 mM 암모늄아세테이트 수용액의 혼합비율을 각각(10 : 90), (20 : 80), (30 : 70), (40 : 60), (50 : 50) 등 다양한 조성에서 비교분석을 하여 최적조건을 확립하였다.
- 반복성 시험에서는 실리마린으로서 10 mg, 15 mg, 20 mg에 해당하도록 검체 각각 70 mg, 105 mg, 140 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 실험실간 정밀도를 확인하기 위하여서는 두 실험실에서 각 5회 반복 측정하였다.
- 정확도(회수율)를 확인하기 위하여 실리마린을 함유하지 않은 비타민C 제품을 기질바탕시료(matrix blank : 기질 포함, 실리마린 불포함)로 선정하여 회수율을 검토하였다. 기질바탕시료에 실리마린표준용액을 각각 300, 600, 900 μg/L이 되도록 첨가하여 3회 반복 실험을 하였다.
- 정확도를 확인하기 위하여 기질바탕시료에 실리마린을 각각 300, 600, 900 μg/L 첨가하여 3회 반복 실험을 하였다.
- 직선성은 실리마린 표준용액 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125.0 250.0 μg/L을 이용하여 유효성을 검증하였다.
- 질량분석방법에서는 ESI negative ionization mode를 사용하였고 각 실리마린의 모분자에서 딸이온들에 대한 문헌검토를10) 통해 정량이온과 정성이온을 선정하였다. 개개의 피크에서 가장 감도가 크고 안정적으로 쪼개지는 이온들을 실리크리스틴의 모분자 [M-H]−= m/z 481 ion에서 m/z 325 ion, m/z 125 ion으로, 실리디아닌의 모분자 [M-H]−= m/z 481 ion에서 m/z 151 ion, m/z 125 ion으로 확인되었다.
- 검체를 메탄올로 추출한 후 5 mM 암모늄아세테이트 수용액이 함유된 희석용매를 사용하여 단계별 희석하였다. 최적의 분석조건을 선정하기 위하여 메탄올과 5 mM 암모늄아세테이트 수용액의 혼합비율을 각각 10 : 90, 20 : 80, 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50 등 다양한 조성에서 비교분석하였다. 10 : 90에서는 물의 함량이 많아 이온화과정에서 이동상이 휘발되지 않고 결국 감도가 현저히 떨어지는 결과를 얻었다.
- 특이성을 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액에서의 실리마린 각각의 피크에 대하여 분리도 및 머무름 시간을 확인한 결과 동일한 위치에 단일 피크가 측정되었다. Fig 1은 표준용액과 시험용액을 분석한 크로마토그램이며 동일한 위치에 단일 피크를 확인하였다.
대상 데이터
- 으로 치환된 역상칼럼을 사용한 것을 확인하였으며 본 시험법에서도 동일한 것을 사용하였다. 검체는 대부분의 문헌에서 메탄올 추출법을 사용하였고 본 시험에서도 메탄올을 추출용매로 사용하였다7-11). 분석감도를 증가시키기 위하여 검체를 메탄올로 추출한 후 5 mM 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올의 비율을 달리하면서 희석하여 시험하였다.
- 검체량의 변화에 대한 반복 정밀도와 시험실간 정밀도를 확인하기 위하여 검체 0.9 g당 실리마린 130 mg을 함유하는 유통제품을 구입하여 이용하였다. 반복성 시험에서는 실리마린으로서 10 mg, 15 mg, 20 mg에 해당하도록 검체 각각 70 mg, 105 mg, 140 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다.
- 국내에서 건강기능식품으로 유통되고 있는 실리마린제품 17건을 구입하여 검체로 사용하였다. 대상제품은 실리마린기능성 원료를 주원료로 함유하며 그 기능성과 함량을「건강기능식품 표시기준」에 따라 표기한 것으로 하였다.
- 국내에서 건강기능식품으로 유통되고 있는 실리마린제품 17건을 구입하여 검체로 사용하였다. 대상제품은 실리마린기능성 원료를 주원료로 함유하며 그 기능성과 함량을「건강기능식품 표시기준」에 따라 표기한 것으로 하였다. 회수율시험을 위해서는 제품에 사용되는 캡슐기제(젤라틴, 천연 및 합성색소) 및 부형제(스테아린산마그슘 및 대두레시틴) 등의 영향을 확인하기 위하여 실리마린을 함유하지 않은 건강기능식품으로 이러한 부형제를 함유하는 비타민함유 제품을 선정하고 구입하여 시험에 사용하였다.
- 분석문헌 자료 검토7-11) 및 예비시험을 통하여 이동상은 A, B 두 가지 용매를 기울기 용리방식으로 사용하였으며, 이동상 A는 0.1% 개미산이 함유된 5 mM 암모늄아세테이트 수용액, 이동상 B는 0.1% 개미산이 함유된 메탄올을 사용하였다(Table 2).
- 시험분석을 위해 사용된 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)는 Waters사의 ACQUITY UPLC System이 결합된 QUATTRO MICRO tandem 사중극자 질량분석기를, 분석용 칼럼으로는 Acquity UPLC® BEH C18(100 mm × 2.1 mm (i.d), 1.7 μm)를 사용하였다.
- 실리크리스틴(Silychristin), 실리디아닌(Silydianin), 실리빈A(Silybin A), 실리빈B(Silybin B), 이소실리빈A(Isosilybin A), 이소실리빈B(Isosilybin B)는 각각 Chromadex사(Irvine, CA, USA)에서, 메탄올, 아세토니트릴 등은 Merck사(Whitehous station, USA)로부터, 이동상조제용으로는 HPLC급으로 구입하였다.
- 실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈A, 실리빈B, 이소실리빈A, 이소실리빈B 표준품 약 10 mg을 각각 정밀하게 달아 메탄올 100 mL에 녹여 표준원액으로 하였다. 각각의 실험에서 희석용매(메탄올 : 5 mM 암모늄아세테이트 수용액 = 3 : 7)를 이용하여 표준원액을 적정농도로 단계별 희석한 후 0.
- 유통·판매되고 있는 실리마린 함유 건강기능식품을 17건을 구입하여 질량분석법에 대한 적용성 시험을 실시하였다.
- 실리마린은 국화과에 속하는 마리아엉겅퀴(Silybum marianun)의 열매에서 추출한 밀크씨슬(카르두스 마리아누스, Cardus marianus) 추출물의 주성분이다. 플라보리그난 계열 화합물들의 복합체이며 실리크리스틴(Silychristin), 실리디아닌(Silydianin), 실리빈A(Silybin A), 실리빈B(Silybin B), 이소실리빈A(Isosilybin A) 및 이소실리빈B(Isosilybin B) 총 6개 물질로 구성되어 있다. 밀크씨슬 추출물은 간 기능 회복 및 세포 보호효과가 있는 것으로 알려져 있고, 약물로서 간질환의 보조요법에 사용되고 있으며 간장질환의 치료를 위해 유럽이나 아시아에서 널리 사용되어 왔다3-5) (Table 1).
- 대상제품은 실리마린기능성 원료를 주원료로 함유하며 그 기능성과 함량을「건강기능식품 표시기준」에 따라 표기한 것으로 하였다. 회수율시험을 위해서는 제품에 사용되는 캡슐기제(젤라틴, 천연 및 합성색소) 및 부형제(스테아린산마그슘 및 대두레시틴) 등의 영향을 확인하기 위하여 실리마린을 함유하지 않은 건강기능식품으로 이러한 부형제를 함유하는 비타민함유 제품을 선정하고 구입하여 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 분석법의 유효성 확인을 위하여 실험실간 교차검증을 실시하였다. 실리마린분석에 대한 상대표준편차는 2.
- 정량한계와 검출한계는 직선선을 구하기 위하여 사용한 검량선을 3회 반복측정하여 기울기의 평균값(S)과 y절편의 표준편차(σ)를 이용하여 구하였다.
- 직선선을 구하기 위하여 사용한 검량선을 3회 반복측정하여 기울기의 평균값(S)과 y절편의 표준편차(σ)를 이용하여 구하였다(Fig. 2).
이론/모형
- LC-MS/MS를 이용한 실리마린(실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈A, 실리빈B, 이소실리빈A, 이소실리빈B) 분석법을 확립하고 유효성을 검증하였다. 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection), 정량한계(LOQ, limit of quantification), 정확도(Accuracy), 정밀도(Precision)등에 대해 검증하였으며, AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시하는 방법을 참고하였다15).
- 질량분석기를 이용한 분석은 전자분무이온화법(Electro-Spray Ionization, ESI)으로 음이온 모드(Negative ion mode)에서 수행하였다. 각 6개 실리마린 구성성분의 모분자에서 형성된 딸이온들에 대한 정량이온과 정성이온을 가장 감도가 크고 안정적으로 쪼개지는 이온들을 선정하기 위하여 문헌을 검토하고 예비시험을 실시하였다.
성능/효과
- 10 : 90에서는 물의 함량이 많아 이온화과정에서 이동상이 휘발되지 않고 결국 감도가 현저히 떨어지는 결과를 얻었다. 20 : 80에서는 피크 끌림현상이 있었고, 50 : 50조성에서는 피크가 겹쳐지면서 분리능이 떨어졌고, 30 : 70의 비율로 혼합하였을 때 분리능과 감도 모두 좋은 결과를 나타내었다. 이상의 실험을 통하여 확립한 최적의 분석조건은 Table 2에 나타내었다.
- 검체량의 변화에 대한 반복 정밀도를 확인하기 위하여 검체를 각각 70 mg(실리마린으로서 10 mg 해당량), 105 mg(실리마린으로서 15 mg 해당량), 140 mg(실리마린으로서 20 mg 해당량)을 취하여 5회 반복 측정하였다. 각 농도의 상대표준편차는 각각 일내 1.5, 3.0, 1.4%이었고 일간에서는 1.5, 1.6, 4.4% 임을 확인하였다(Table 5).
- 각 분석물에 대한 정확도(회수율) 및 정밀도는 AOAC 가이드라인에서 제시하는 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 회수율 범위 75~120%, 상대표준편차 8%)에 모두 부합하는 결과로 높은 정확도와 정밀도를 확인할 수 있었다.
- 개개의 피크에서 가장 감도가 크고 안정적으로 쪼개지는 이온들을 실리크리스틴의 모분자 [M-H]−= m/z 481 ion에서 m/z 325 ion, m/z 125 ion으로, 실리디아닌의 모분자 [M-H]−= m/z 481 ion에서 m/z 151 ion, m/z 125 ion으로 확인되었다.
- 정확도를 확인하기 위하여 기질바탕시료에 실리마린을 각각 300, 600, 900 μg/L 첨가하여 3회 반복 실험을 하였다. 그 결과 각각의 농도에서 회수율은 96.2, 97.2, 98.6%로 나타났으며, 상대표준편차는 4.5, 3.8, 1.6%이었다(Table 4).
- Fig 1은 표준용액과 시험용액을 분석한 크로마토그램이며 동일한 위치에 단일 피크를 확인하였다. 그 결과 표준용액과 시험용액에서 지표(기능)성분인 실리마린의 각 피크의 머무름시간이 일치함을 확인할 수 있었다. 또한 각 성분에 대한 직선성(linearity)을 확인하기 위하여 실리마린 각각의 표준용액 7.
- 또한 각 성분에 대한 직선성(linearity)을 확인하기 위하여 실리마린 각각의 표준용액 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125.0 250.0 μg/L를 LC-MS/MS에 주입하여 분석한 결과 상관계수(r2)가 모두 0.999 이상으로 나타나 AOAC 가이드라인에서 제시하는 기준(r2> 0.99)을 만족시켰다15).
- 실리마린분석에 대한 상대표준편차는 2.2%로 나타났으며, AOAC 가이드라인에서 제시하는 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 상대표준편차 16%)에 적합한 결과로서 분석법의 일관성을 확인하였다(Table 6).
- 실리마린함유 제품에 대하여 확립된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 실리마린 시험을 3반복 실시한 결과, 17건 실리마린 제품은 표시 함량 대비 81.2~106.5%로 현행 기준80~120%을 만족하여 적합함을 확인하였다(Table 7).
- 질량분석법(LC-MS/MS)을 개발하기 위하여 현재까지 분석자료를 검토한 결과, 칼럼은 모두 C18으로 치환된 역상칼럼을 사용한 것을 확인하였으며 본 시험법에서도 동일한 것을 사용하였다. 검체는 대부분의 문헌에서 메탄올 추출법을 사용하였고 본 시험에서도 메탄올을 추출용매로 사용하였다7-11).
후속연구
- 본 연구를 통하여 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 건강기능식품 중 정성·정량 가능한 실리마린 시험법을 확립하고 시험법 유효성을 검증하였다. 본 시험법을 활용하여 분석의 정확성 및 효율성이 증대되고 건강기능식품 공전개정에 활용될 수 있으며, 원료 및 제품의 품질관리에 대한 신뢰성을 확보할 수 있으리라 사료된다.
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