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문제 정의
- , 2012; Yip and Reed, 2008). 그러므로 본 연구에서는 YD-10B세포에서 백작약 추출물 및 분획물들에 의한 Bax와 Bcl-2 유전자들의 발현을 조사하고 Bax/Bcl-2 ratio를 통해 구강암세포 사멸 효과를 조사하였다. 그 결과, 120㎍/㎖ 농도로 48시간 처리했을 때 물 추출물이 대조군에 비해 5배 이상 가장 높은 세포사멸 효과를 보였다(Fig.
- 백작약의 다양한 생리활성이 알려져 있지만 항암효과에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 극성이 큰 물을 추출용매로 백작약의 다양한 유효성분들을 추출하고자 하였으며, 또한 백작약의 물 추출물 및 유기용매 분획물에서 항산화, 트롬빈억제 효과와 종양형성과 종양전이 능력이 우수하다고 이미 밝혀진 인간구강암세포주를 사용하여 암세포 사멸 및 암전이 억제 효과를 조사하였다.
- , 2005). 본 연구에서는 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물들의 thrombin 저해 활성을 측정하여 혈관계 질환의 예방 물질로 사용 가능한지 조사하였다. 그 결과 에틸아세테이트 분획물이 87.
- 본 연구에서는 백작약 추출물 및 분획물들의 YD-10B 인간구강암세포에서 암 침윤 및 MMPs 활성 증가에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여 40 ㎍/㎖ 농도의 백작약 추출물 및 분획물과 2.
제안 방법
- , Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 RNA를 가지고 ReverTra ACE PCR RT Master Mix Kit (TOYOBO Co., Osaka, Japan) 을 이용하여 PCR를 수행하였다. 본 실험에서는 Bcl-2, Bax 및 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primers (Table 1)을 사용하였고, Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다.
- 40 ㎍/㎖ 농도의 백작약 추출물 및 분획물과 2.5 Unit 농도의 Thrombin을 단독 또는 동시에 처리된 혈청 없는 배지에서 YD-10B (5 × 105) 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지를 모아 Centriprep YM-10 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 농축하였다.
- 02% NaN3)로 37℃에서 18시간 동안 반응하였다. Gel은 Coomassie Brilliant Blue (7% glacial acetic acid, 40% methanol, 0.25% coomassie blue)로 1시간 동안 염색한 후, destaining solution (7% glacial acetic acid, 40% methanol)으로 탈색하여 white band을 확인하였다.
- YD-10B 세포를 96-well plate에 well (200 ㎕)당 2 × 104개의 수로 seeding하고 12시간 동안 배양한 후, 추출물 농도를 0, 30, 60, 120, 및 240 ㎍/㎖이 되도록 처리하였다.
- YD-10B 세포에서 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물을 0, 30, 60, 120 및 240 ㎍/㎖의 다양한 농도로 함께 처리하여 24, 48시간 동안 배양한 후 세포의 생존율을 조사하였다. 30 그리고 60 ㎍/㎖ 농도로 48시간 동안 처리한 후 대조군과 비교한 결과, 물 추출물에서는 96.
- 5 unit 농도의 thrombin을 단독 또는 동시에 처리하여 YD-10B세포를 혈청 없는 배지에서 배양하였다. 그리고 24시간동안 배양한 후, 배지의 상층액은 gelatin zymography법을 통해 MMP-2/pro-MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 분석하였다. 그 결과는 Fig.
- 74 g의 물 추출물을 얻었다. 또한 이 여과한 용액을 다양한 종류의 유기용매를 이용하여 추출한 분획물의 수득율을 측정하였다. 그 결과 헥산 분획물이 0.
- 백작약 추출물에 따른 세포독성을 조사하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. YD-10B 세포를 96-well plate에 well (200 ㎕)당 2 × 104개의 수로 seeding하고 12시간 동안 배양한 후, 추출물 농도를 0, 30, 60, 120, 및 240 ㎍/㎖이 되도록 처리하였다.
- YD-10B 세포, human oral squamous carcinoma cells는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 RPMI-1640 (Gibco-BRL, Life technologies Inc., Grand Island, New York, USA)배지에 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL), 1% penicillin/streptomycin (Gibco-BRL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 계대배양 하였다.
- 1)하고 동결 건조한 다음 물 추출물 시료로 사용하였다. 유기용매 분획물은 위의 Whatman No.1 여과지로 여과하여 얻은 여과액을 같은 부피의 헥산(hexane), 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 3번씩 추출 후 각각의 추출물을 농축시키고, 마지막에 남은 물 층을 동결 건조하여 물 분획물을 얻었다. 실험에 사용한 물 추출물과 분획별 시료는 50% Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma- Aldrich)와 증류수에 10 ㎎/㎖로 준비하였다.
- 6 ㎖을 가하여 6 ㎖이 되도록 하였다. 이 혼합액을 4분간 반응시키고 다시 여과한 다음, 총 반응시간이 10분이 되면 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(UV-1201; Shimadzu). 전자공여능은 다음 식에 의해 산출하였다.
- 본 연구에서는 백작약 추출물 및 분획물들의 YD-10B 인간구강암세포에서 암 침윤 및 MMPs 활성 증가에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여 40 ㎍/㎖ 농도의 백작약 추출물 및 분획물과 2.5 unit 농도의 thrombin을 단독 또는 동시에 처리하여 YD-10B세포를 혈청 없는 배지에서 배양하였다. 그리고 24시간동안 배양한 후, 배지의 상층액은 gelatin zymography법을 통해 MMP-2/pro-MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 분석하였다.
- 5 NIH units/㎖) 50 ㎕를 첨가한 후 혼합하였다. 준비한 백작약 물 추출물이나 유기용매 분획물(10 ㎎/㎖) 10 ㎕를 첨가하고 실온에서 15 분간 incubation 후, H-D-phenylalanine-L-pipecolyl-L-arginine-paranitro aniline dihydrochloride를 이용하여 준비한 기질 용액(0.5 mM) 50 ㎕을 가하고 5분 동안 incubation시킨 후 405 ㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다(UV-1601PC; Shimadzu, Kyoto, Japan). 트롬빈 활성 저해율은 다음 식에 의해 산출하였으며, 사용한 흡광도는 대조구의 흡광도를 제외한 수치를 이용하였다.
- 본 실험에서는 Bcl-2, Bax 및 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primers (Table 1)을 사용하였고, Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. 증폭된 PCR 생성물은 ethidium bromide가 포함된 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 UV light상에서 확인하였다.
- 항산화 활성을 알아보기 위하여 DPPH radical 소거능력을 이용하여 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물의 활성산소 제거능력을 측정하였다. 백작약 물 추출물 및 유기용매 분획물들의 시료 농도는 0.
대상 데이터
- YD-10B 세포, human oral squamous carcinoma cells는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 RPMI-1640 (Gibco-BRL, Life technologies Inc.
- 본 실험에 사용한 백작약(P. japonica)은 경북 영천에서 생산한 것을 제천약초시장에서 구입하여 사용하였다. 생리활성 측정에 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, St.
- , Osaka, Japan) 을 이용하여 PCR를 수행하였다. 본 실험에서는 Bcl-2, Bax 및 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primers (Table 1)을 사용하였고, Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. 증폭된 PCR 생성물은 ethidium bromide가 포함된 1.
- japonica)은 경북 영천에서 생산한 것을 제천약초시장에서 구입하여 사용하였다. 생리활성 측정에 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Thrombin (Sigma-Aldrich), Fibrinogen (Sigma-Aldrich), H-D-phenyl-alanine-L-pipecolyl-L- arginine-paranitroaniline dihydrochloride (Chromogenix S-2238; Chromogenix, Orangeburg, NY, USA)을 사용하였고 나머지 시약도 모두 일등급을 사용하였다.
- 세포로부터 TRIzol 시약(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 RNA를 가지고 ReverTra ACE PCR RT Master Mix Kit (TOYOBO Co.
- 1 여과지로 여과하여 얻은 여과액을 같은 부피의 헥산(hexane), 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 3번씩 추출 후 각각의 추출물을 농축시키고, 마지막에 남은 물 층을 동결 건조하여 물 분획물을 얻었다. 실험에 사용한 물 추출물과 분획별 시료는 50% Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma- Aldrich)와 증류수에 10 ㎎/㎖로 준비하였다.
데이터처리
- 세포독성효과, RT-PCR 그리고 gelatinase 활성 분석은 Student’s t-test를 실시하였다.
- 항산화 및 트롬빈억제 효과 분석은 Instat TM statistical software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 분산분석(ANOVA)를 실시하였다. 세포독성효과, RT-PCR 그리고 gelatinase 활성 분석은 Student’s t-test를 실시하였다.
이론/모형
- Blois (1958) 및 Kim et al. (1997)의 방법에 따라 준비한 백작약 물 추출물이나 유기용매 분획물 적정 희석액 0.4 ㎖를 시험관에 넣고, 1 × 10 -4M의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)- ethanol 용액 5.6 ㎖을 가하여 6 ㎖이 되도록 하였다.
- 트롬빈 저해 활성은 Doljak et al. (2001)의 방법을 이용하여 측정하였다. 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich, St.
성능/효과
- YD-10B 세포에서 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물을 0, 30, 60, 120 및 240 ㎍/㎖의 다양한 농도로 함께 처리하여 24, 48시간 동안 배양한 후 세포의 생존율을 조사하였다. 30 그리고 60 ㎍/㎖ 농도로 48시간 동안 처리한 후 대조군과 비교한 결과, 물 추출물에서는 96.78% 그리고 88.44%, 핵산 분획물은 81.59% 그리고 76.84%, 클로로포름 분획물은 84.71% 그리고 70.82%, 에틸아세테이트 분획물은 80.84% 그리고 53.90%, 부탄올 분획물은 86.27% 그리고 75.26% 그리고 물 분획물은 96.84% 그리고 95.24%의 생존율을 보였다. 이와 같은 결과를 통해 백작약 추출물 및 모든 분획물은 60 ㎍/㎖의 농도까지는 에틸아세테이트 분획물을 제외하고는 거의 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물들의 thrombin 저해 활성을 측정하여 혈관계 질환의 예방 물질로 사용 가능한지 조사하였다. 그 결과 에틸아세테이트 분획물이 87.54%의 가장 높은 저해활성을 나타냈으며, 부탄올 분획물은 80.58%의 트롬빈 저해활성을 나타냈다(Fig. 3). 이는 Kim et al.
- 또한 이 여과한 용액을 다양한 종류의 유기용매를 이용하여 추출한 분획물의 수득율을 측정하였다. 그 결과 헥산 분획물이 0.02%, 클로로포름 분획물 0.14%, 에틸아세테이트 분획물 1.15%, 부탄올 분획물 4.00%, 물 분획물 11.44%로 물 분획물의 수득율이 가장 높았다(Fig. 1).
- 그러므로 본 연구에서는 YD-10B세포에서 백작약 추출물 및 분획물들에 의한 Bax와 Bcl-2 유전자들의 발현을 조사하고 Bax/Bcl-2 ratio를 통해 구강암세포 사멸 효과를 조사하였다. 그 결과, 120㎍/㎖ 농도로 48시간 처리했을 때 물 추출물이 대조군에 비해 5배 이상 가장 높은 세포사멸 효과를 보였다(Fig. 6).
- 그리고 24시간동안 배양한 후, 배지의 상층액은 gelatin zymography법을 통해 MMP-2/pro-MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 분석하였다. 그 결과는 Fig. 5에서 나타난 것처럼 thrombin를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-9의 변화는 없었지만 MMP-2/pro-MMP-2 단백질 활성이 뚜렷하게 증가하였다. 그리고 thrombin과 백작약 추출물 및 분획물을 동시 처리한 세포에서는 에틸아세테이트 분획물이 thrombin에 의해 유도된 MMP-2/pro-MMP-2 단백질 활성이 가장 뚜렷하게 억제하였다.
- 5에서 나타난 것처럼 thrombin를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-9의 변화는 없었지만 MMP-2/pro-MMP-2 단백질 활성이 뚜렷하게 증가하였다. 그리고 thrombin과 백작약 추출물 및 분획물을 동시 처리한 세포에서는 에틸아세테이트 분획물이 thrombin에 의해 유도된 MMP-2/pro-MMP-2 단백질 활성이 가장 뚜렷하게 억제하였다.
- 54%의 높은 트롬빈저해 효과를 나타냈으며, 또한 구강암세포주에서도 트롬빈 처리에 의해 활성화된 MMP-2/ pro-MMP-2이 높은 암전이 억제 활성을 나타냈다. 그리고 구강암세포주에 대한 세포사멸 효과는 물 추출물이 5배 이상의 높은 능력을 보였다. 이와 같은 연구 결과를 바탕으로 백작약 에틸아세테이트 분획물은 새로운 항산화제, 트롬빈억제제 및 암전이억제제의 개발을 위한 우수한 천연물 소재 후보 물질로서의 가능성을 제시하고 있다.
- 이와 같은 결과를 통해 백작약 추출물 및 모든 분획물은 60 ㎍/㎖의 농도까지는 에틸아세테이트 분획물을 제외하고는 거의 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 120 ㎍/㎖ 고농도로 48시간동안 처리한 결과에서는, 물 추출물 64.92%, 핵산 분획물 62.24%, 클로로포름 분획물 55.03%, 에틸아세테이트 분획물 38.23%, 부탄올 분획물 56.64% 그리고 물 분획물 80.73%의 생존율을 보여 물 분획물을 제외하고는 대부분 추출 분획물들에서 구강암세포 증식억제활성을 나타냈다(Fig. 4).
- 항산화 활성을 알아보기 위하여 DPPH radical 소거능력을 이용하여 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물의 활성산소 제거능력을 측정하였다. 백작약 물 추출물 및 유기용매 분획물들의 시료 농도는 0.66 ㎎/㎖로, 헥산, 클로로포름, 물 분획물 및 물 추출물에서 6.12%, 12.23%, 13.67% 및 18.63%로 낮은 항산화 활성을 보였으며, 부탄올 분획물이 40.01%의 항산화 활성을 나타내었고, 에틸아세테이트 분획물이 85.13%의 가장 높은 활성을 나타냈다(Fig. 2). 이는 100 ㎍/㎖ 농도의 백작약 에틸아세테이트 분획물에서 92% 이상의 DPPH라디컬 소거활성을 나타내는 것으로 이미 보고된 Jeong et al.
- 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물들의 항산화 활성, 트롬빈 억제 및 구강암세포주에서의 암전이 억제 및 암세포 사멸능을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획물이 85.
- 실험결과는 3회 반복 실험을 통하여 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 유의한 결과를 얻었다(p ＜0.05).
- 백작약 물 추출물과 유기용매 분획물들의 항산화 활성, 트롬빈 억제 및 구강암세포주에서의 암전이 억제 및 암세포 사멸능을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획물이 85.13%의 높은 항산화 활성과 87.54%의 높은 트롬빈저해 효과를 나타냈으며, 또한 구강암세포주에서도 트롬빈 처리에 의해 활성화된 MMP-2/ pro-MMP-2이 높은 암전이 억제 활성을 나타냈다. 그리고 구강암세포주에 대한 세포사멸 효과는 물 추출물이 5배 이상의 높은 능력을 보였다.
- 24%의 생존율을 보였다. 이와 같은 결과를 통해 백작약 추출물 및 모든 분획물은 60 ㎍/㎖의 농도까지는 에틸아세테이트 분획물을 제외하고는 거의 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 120 ㎍/㎖ 고농도로 48시간동안 처리한 결과에서는, 물 추출물 64.
후속연구
- 악성 종양의 원인 중 하나로 알려진 활성산소(Reactive oxygen species)는 대사과정과 면역과정 중에 생성되어 정상세포에 작용하여 암이나 노화세포로 발전시키는 것으로 알려져 있다. 이 활성산소에 수소를 제공하여 안정한 물질로 변화시키고, 자신은 안정한 라디칼 구조를 형성할 수 있는 물질이라면 우수한 항산화물질로서 암의 예방 물질로 이용될 수 있을 것이다. 이 같이 인체의 활성산소 양을 줄일 수 있는 항산화물질이 약용식물과 버섯으로부터 발표되고 있다(Hong et al.
- 그리고 구강암세포주에 대한 세포사멸 효과는 물 추출물이 5배 이상의 높은 능력을 보였다. 이와 같은 연구 결과를 바탕으로 백작약 에틸아세테이트 분획물은 새로운 항산화제, 트롬빈억제제 및 암전이억제제의 개발을 위한 우수한 천연물 소재 후보 물질로서의 가능성을 제시하고 있다.
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