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문제 정의
- 이러한 연구결과들로부터 이온교환수지 대신 고분자물질을 이용하여 분별침전을 수행할 경우 이온교환수지 첨가에 따른 비용과 제거 문제를 동시에 해결함으로써 보다 효율적으로 작은 입자의 (+)-dihydromyricetin을제조할 수있을 것으로예상된다. 따라서 본 연구에서는 분별침전 기법에 친수성 고분자 물질[HPMC 2910(hydroxypropyl methyl cellulose 2910), PVP-K90 (polyvinylpyrrolidoneK 90), PVA (polyvinyl alcohol, molecular weight 31,000-50,000)]을 도입하여 (+)-dihydromyricetin의 입자크기를 줄일 수 있는지를 조사하였다. 즉, 분별침전 시 고분자 물질의 종류와 농도를 달리하여 첨가하고 분별침전 시간에 따른 (+)-dihydromyricetin 입자 성장 양상을 조사함으로써 입자크기 감소 가능성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 (+)-dihydromyricetin의 분별침전 공정에 친수성 고분자 물질을 첨가하여 침전물의 입자크기 감소 가능성을 평가하였다. 고분자 물질의 종류(HPMC 2910, PVP K90, PVA)와 농도(0.
제안 방법
- (+)-Dihydromyricetin 분석을 위해 HPLC system (SCL-10 AVP,Shimadzu, Japan)과 Capcell Pak C18 (250 × 4.6 mm, 5 µm, Shiseido,Japan) 컬럼을 사용하였다.
- 세 종류의 고분자 물질(HPMC 2910, PVP-K90, PVA)를 이용한 분별침전 공정에서 zeta potential 값 변화를 측정하였다. ELS-Z(Photal, Japan)를 이용하여 zeta potential을 측정하였으며 측정된 zeta potential은 ELS-Z software를 사용해 확인하였다.
- 분별침전 용액은 저온(4 oC)의 항온항습기(KCL-2000W, EYELA, Japan)에 침전시간(6, 12, 18, 24 시간)을달리하여 (+)-dihydromyricetin의 침전물을 얻었다. 고분자 물질의 농도를 0.05, 0.1, 0.2% (w/v)로 변화시켜 동일한 방법으로 반복 실험을 수행하였고 침전물을 전자현미경을 이용하여 측정하였다. (+)-Dihydromyricetin의 분별침전 개략도를 Fig.
- 분별침전을 통해 얻은 (+)-dihydromyricetin 침전물을고배율(×200)에서관찰하였다. 관찰된 (+)-dihydromyricetin 침전물은 IT-Plus system (Some Tech, Korea)에서 동화상으로 확인하였으며 이를 통해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 형태와 크기를 확인하였다.
- 또한 분별침전 24 시간 이내에 대부분의 (+)-dihydromyricetin 회수가 가능하였다[9]. 따라서 본 연구를 위한 모든 분별침전은 최대 24 시간까지만 수행하였다.
- 반응기 부피는 20 ml이며 반응액 부피(working volume)는 6 ml이었다. 분별침전 용액은 저온(4 oC)의 항온항습기(KCL-2000W, EYELA, Japan)에 침전시간(6, 12, 18, 24 시간)을달리하여 (+)-dihydromyricetin의 침전물을 얻었다. 고분자 물질의 농도를 0.
- 분별침전공정에서 (+)-dihydromyricetin 침전물 형태 및 크기 측정을 위하여 전자현미경(SV-35 Video Microscope System, Some Tech,Korea)을 사용하였다. 분별침전을 통해 얻은 (+)-dihydromyricetin 침전물을고배율(×200)에서관찰하였다.
- 분별침전을 통해 얻은 (+)-dihydromyricetin 침전물을고배율(×200)에서관찰하였다.
- 생리활성물질인 (+)-dihydromyricetin 의 입자크기 감소를 위하여,기존 문헌[9,21,22]에서 원료의약품의 입자크기 감소에 효과적인 세 종류의 고분자 물질(HPMC 2910, PVP K90, PVA)를 이용하여 분별침전을 수행하였다. (+)-Dihydromyricetin 분별침전 공정에서 분별침전이 완료되는데 걸리는 시간에 많은 차이가 있을 뿐만 아니라 분별침전에 많은 시간이 소요되어 (+)-dihydromyricetin의 대량분리 및 정제에 많은 한계가 있었다[18,19].
- 세 종류의 고분자 물질(HPMC 2910, PVP-K90, PVA)를 이용한 분별침전 공정에서 zeta potential 값 변화를 측정하였다. ELS-Z(Photal, Japan)를 이용하여 zeta potential을 측정하였으며 측정된 zeta potential은 ELS-Z software를 사용해 확인하였다.
- 시료는이동상인 distilled water와 acetonitrile 혼합용액(90/10, v/v)에 녹여 주입(주입양은 20 µl) 하였으며, 254nm에서 UV에 의해 검출하였다.
- 따라서 본 연구에서는 분별침전 기법에 친수성 고분자 물질[HPMC 2910(hydroxypropyl methyl cellulose 2910), PVP-K90 (polyvinylpyrrolidoneK 90), PVA (polyvinyl alcohol, molecular weight 31,000-50,000)]을 도입하여 (+)-dihydromyricetin의 입자크기를 줄일 수 있는지를 조사하였다. 즉, 분별침전 시 고분자 물질의 종류와 농도를 달리하여 첨가하고 분별침전 시간에 따른 (+)-dihydromyricetin 입자 성장 양상을 조사함으로써 입자크기 감소 가능성을 평가하였다.
- 1g/ml), 고분자 물질인 HPMC 2910, PVP-K90, PVA 31,000-50,000를각각 증류수에 미리 충분히 녹인 뒤 사용하였다. 증류수(distilled water/acetone solution ratio=5/1, v/v)를 교반(350 rpm)하에 5초에 한 방울씩 떨어뜨려 용해도 차이를 이용하여 (+)-dihydromyricetin 침전을 유도하였다. 반응기 부피는 20 ml이며 반응액 부피(working volume)는 6 ml이었다.
대상 데이터
- 시료는이동상인 distilled water와 acetonitrile 혼합용액(90/10, v/v)에 녹여 주입(주입양은 20 µl) 하였으며, 254nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준 정량곡선을 이용하였으며, 표준물질은 Guilin Natural Ingredient, Inc. (Guilin,China)에서 구입한 순도 98%의 제품을 사용하였다[18]. 각 시료는 3회 분석하여 평균값을 취하였다.
- 본 연구에 사용된 (+)-dihydromyricetin는 Guilin Natural Ingredient, Inc. (Guilin, China)에서 구입한 제품(순도: 80.0%)를 사용하였다.
데이터처리
- (Guilin,China)에서 구입한 순도 98%의 제품을 사용하였다[18]. 각 시료는 3회 분석하여 평균값을 취하였다.
성능/효과
- 2% (w/v)에서 각각 15-33,35-41, 20-27 µm 정도 감소하여 고분자 물질 PVA을 첨가한 경우가 대조군에 비해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자크기가 감소하였다. PVA의 농도 0.1% (w/v)에서 입자크기가 가장 많이 감소하였지만 고분자 물질 PVP K90에 비해 (+)-dihydromyricetin 침전물의입자크기 감소율은 작았다.
- 2% (w/v)에서 각각 29-41, 38-68, 34-46 µm 정도 감소하였다. 결과적으로 HPMC 2910의 농도 0.1% (w/v)에서 가장 작은 (+)-dihydromyricetin 침전물을 얻을 수 있었으며, 입자크기는 대조군의 32-40% 수준이었다. 고분자 물질 HPMC 2910 농도 0.
- 1% (w/v)에서 가장 작은 (+)-dihydromyricetin 침전물을 얻을 수 있었으며, 입자크기는 대조군의 32-40% 수준이었다. 고분자 물질 HPMC 2910 농도 0.1% (w/v)까지는 입자크기가 감소하다 이후 입자크기가 오히려 증가하는 경향을 보였다.
- 본 연구에서는 (+)-dihydromyricetin의 분별침전 공정에 친수성 고분자 물질을 첨가하여 침전물의 입자크기 감소 가능성을 평가하였다. 고분자 물질의 종류(HPMC 2910, PVP K90, PVA)와 농도(0.05, 0.1, 0.2%, w/v)를 달리하여 분별침전을 수행한 결과, 고분자물질의 종류와 농도에 따라 침전물의 입자크기에 차이를 보였으며 모든 경우 대조군에 비해 입자크기가 감소하였다. 특히 분별침전 시 HPMC 2910 (0.
- 2% (w/v)를 첨가한 경우에는 90, 110,128, 137 µm이었다. 대조군과 비교해 보면 침전물의 모양은 비슷하지만 고분자 물질이 첨가된 경우 좀 더 원형에 가까운 형태의 침전물들이생기는경향이있었고침전시간이길어질수록입자크기가증가하는 것을 확인할수있었다. 전반적으로고분자물질 PVP K90을 첨가한 경우, 농도에 관계 없이 대조군에 비해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자크기가 감소하였음을 알 수 있었다.
- 기존 문헌에 의하면 침전 과정에서 고분자 물질 첨가에 의해 다양한 원료의약품(megestrol acetate, spironolactone, atorvastatin calcium)의 입자크기 감소에 대한 연구결과가 보고되었다[9,20,21]. 동일한 고분자 물질 첨가에서 원료의약품의 종류에 따라 입자크기 감소 효과에 차이를 보였다. 이러한 연구결과들로부터 이온교환수지 대신 고분자물질을 이용하여 분별침전을 수행할 경우 이온교환수지 첨가에 따른 비용과 제거 문제를 동시에 해결함으로써 보다 효율적으로 작은 입자의 (+)-dihydromyricetin을제조할 수있을 것으로예상된다.
- 1%, w/v)을 첨가할 경우, 대조군에 비하여 입자크기가 38~68 µm (32~40%) 정도 감소하여 입자크기 감소에 가장 효과적이었다. 또한 분별침전 시 침전물 (+)-dihydromyricetin의 입자크기와 침전용액의 제타전위 값은 반비례 관계를 나타내어 분별침전 용액의 제타전위 절대값이 증가할수록 분별침전을 통하여얻은(+)-dihydromyricetin 침전물의 입자크기가 감소하였다. 제타전위절대값이 큰 고분자물질은 상호간의 반발력이 강하여 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자 성장 과정에서 서로 뭉침 현상이 없이 안정되게 유지되어 더 효과적인 공간적 저해 요소 역할을 하기 때문으로 판단된다.
- (+)-Dihydromyricetin 분별침전 공정에서 분별침전이 완료되는데 걸리는 시간에 많은 차이가 있을 뿐만 아니라 분별침전에 많은 시간이 소요되어 (+)-dihydromyricetin의 대량분리 및 정제에 많은 한계가 있었다[18,19]. 본 연구에서 분별침전을 위해 (+)-dihydromyricetin (순도: 80%)을 아세톤에 녹인 후 증류수만을 이용하여 분별침전을 수행하였을 경우(고분자물질을 첨가하지 않은 경우), Fig. 3에서 보는 바와 같이 분별침전 24 시간 이상부터는 입자크기에 큰 차이가 없었다. 또한 분별침전 24 시간 이내에 대부분의 (+)-dihydromyricetin 회수가 가능하였다[9].
- 2%(w/v)를 첨가한 경우에는 90, 116, 140, 149 µm이었다. 부채꼴 모양으로 입자들이 조밀하게 침전되었고 PVP K90과 같이 농도와는 무관하게 침전시간이 길어질수록 입자크기가 증가하였다. 입자크기는대조군에 비해 PVA 농도 0.
- 21 mV로 나타났다. 분별침전 시 (+)-dihydromyricetin 의 입자크기와 용액의 제타전위 값을 비교해 보면, 입자크기가 작아질수록 제타전위 값이 커짐을 알 수 있었다. 분별침전에서 가장 작은 (+)-dihydromyricetin의 입자(108 µm)를 얻은 HPMC 2910 0.
- 분별침전 후 (+)-dihydromyricetin 순도(90.0±1.0%) 및 수율 (>83±2%)은 거의 변화가 없었으며 이러한 현상은 기존의 연구결과와도 유사함을 알 수 있었다[17-19].
- 2% (w/v)를 첨가한 경우에는 71, 102, 121, 130 µm이었다. 원형으로 입자들이 침전되었고 농도와는 무관하게 침전시간이 길어질수록 입자 크기가 증가하였다. 전반적으로 고분자 물질 HPMC 2910을 첨가한 경우가 대조군에 비해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자크기가 감소하였다.
- 이상의 결과로부터 고분자물질(PVP K90, PVA, HPMC 2910)을첨가한 경우 대조군에 비해 더 작은 입자의 (+)-dihydromyricetin을 얻을 수 있었다. 이러한 현상은 첨가된 고분자 물질이 고체-액체 계면의 표면장력을 낮추고 (+)-dihydromyricetin의 핵 생성 속도를 증가시키는 반면 핵 성장을 저해하여 입자크기가 작아지는 것으로 판단된다[22].
- 2%, w/v) 첨가할 경우 대조군에 비해 35% 정도 입자크기가 감소하였다[27]. 이처럼 동일한 고분자 물질을 첨가하여도 첨가 농도와 대상 제품, 침전 시 사용되는 용매에 따라 고분자 물질의 입자크기 감소 효과는 차이를 보였다. 또한 분별침전 시이온교환수지(Amberlite 200)를첨가한경우에도 (+)-dihydromyricetin 입자크기감소효과는고분자물질을첨가한경우와유사하나별도의추가 조업(분별침전 후 이온교환수지 제거) 및 비용(이온교환수지 비용)이 발생하는 문제점이 있다[18].
- 대조군과 비교해 보면 침전물의 모양은 비슷하지만 고분자 물질이 첨가된 경우 좀 더 원형에 가까운 형태의 침전물들이생기는경향이있었고침전시간이길어질수록입자크기가증가하는 것을 확인할수있었다. 전반적으로고분자물질 PVP K90을 첨가한 경우, 농도에 관계 없이 대조군에 비해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자크기가 감소하였음을 알 수 있었다. 입자크기는 대조군에 비해 PVP K90 농도 0.
- 73 mV)을 나타내었다[27]. 즉 (+)-dihydromyricetin의 입자크기와 제타전위 값의 크기는 반비례 관계를 나타내어 분별침전 용액의 제타전위 절대값이증가할수록 분별침전을 통하여 얻은 (+)-dihydromyricetin 침전물의 크기가 감소하였다. 제타전위 절대값이 큰 고분자 물질은 상호간의 반발력이 강하여 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자 성장 과정에서 서로 뭉침 현상이 없어 안정되게 유지되어 더 효과적인 공간적 저해요소 역할을 하기 때문으로 판단된다[9,21].
- 2%, w/v)를 달리하여 분별침전을 수행한 결과, 고분자물질의 종류와 농도에 따라 침전물의 입자크기에 차이를 보였으며 모든 경우 대조군에 비해 입자크기가 감소하였다. 특히 분별침전 시 HPMC 2910 (0.1%, w/v)을 첨가할 경우, 대조군에 비하여 입자크기가 38~68 µm (32~40%) 정도 감소하여 입자크기 감소에 가장 효과적이었다. 또한 분별침전 시 침전물 (+)-dihydromyricetin의 입자크기와 침전용액의 제타전위 값은 반비례 관계를 나타내어 분별침전 용액의 제타전위 절대값이 증가할수록 분별침전을 통하여얻은(+)-dihydromyricetin 침전물의 입자크기가 감소하였다.
후속연구
- 제타전위절대값이 큰 고분자물질은 상호간의 반발력이 강하여 (+)-dihydromyricetin 침전물의 입자 성장 과정에서 서로 뭉침 현상이 없이 안정되게 유지되어 더 효과적인 공간적 저해 요소 역할을 하기 때문으로 판단된다. 이러한 연구결과는 (+)-dihydromyricetin의 활용도 향상뿐만 아니라 효과적 건조에도 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 동일한 고분자 물질 첨가에서 원료의약품의 종류에 따라 입자크기 감소 효과에 차이를 보였다. 이러한 연구결과들로부터 이온교환수지 대신 고분자물질을 이용하여 분별침전을 수행할 경우 이온교환수지 첨가에 따른 비용과 제거 문제를 동시에 해결함으로써 보다 효율적으로 작은 입자의 (+)-dihydromyricetin을제조할 수있을 것으로예상된다. 따라서 본 연구에서는 분별침전 기법에 친수성 고분자 물질[HPMC 2910(hydroxypropyl methyl cellulose 2910), PVP-K90 (polyvinylpyrrolidoneK 90), PVA (polyvinyl alcohol, molecular weight 31,000-50,000)]을 도입하여 (+)-dihydromyricetin의 입자크기를 줄일 수 있는지를 조사하였다.
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