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문제 정의
- 본 연구에서는 조피볼락에 발생하는 비정형 A. salmonicida에 대한 감염을 예방하기 위하여 A. salmonicida에 대한 포르말린 사균 백신(formalin killed cell; FKC) 및 보조제인 aluminum hydroxide과 squalene 첨가 백신을 제작하여 백신을 접종하고, 인위감염 실험을 통하여 그 효능을 평가하였다.
제안 방법
- 수온은 15±1℃로 유지하고, 시판용 배합사료를 3일에 1회 공급하였다.
- 시험 백신의 방어 효과를 조사하기 위하여 백신 접종후 44일과 58일째 공격 시험을 실시하였으며, BHIA에서 배양한 A. salmonicida KACC000P 균주를 5×10 5 및 6.5×10 5 colony forming unit (CFU)/ ml 농도로 조정하여 2개의 백신처리구와 대조구의 조피볼락에 각각 0.1 ml 씩 복강 주사하였다.
- salmonicida KACC000P 균주를 백신제 조에 사용하였다. 순수 분리된 세균 집락은 NaCl 이 1% 함유된 brain heart infusion agar (BHIA)에접종하여 15℃에서 3일간 배양하였으며, 멸균생리식염수에 세균 집락을 현탁한 후에 포르말린(37% formaldehyde)을 최종적으로 1% 농도가 되도록 처리하여 실온에서 2시간 반응시킨 후(30분 간격 voltex) 4℃에서 24시간 동안 두어 FKC를 제작하여 항원으로 사용하였다. FKC는 원심분리를 통해(12,000 rpm, 10분) 멸균생리심역수를 이용하여 3회 세척한 후 균체를 수거하여 10 mg/ml 농도로 현탁하여 백신 접종하였다.
- FKC는 원심분리를 통해(12,000 rpm, 10분) 멸균생리심역수를 이용하여 3회 세척한 후 균체를 수거하여 10 mg/ml 농도로 현탁하여 백신 접종하였다. 추가적으로 보조제를 섞은 백신을 제조하기 위해, 200 ml 기준으로 dulbecco minimum essential medium (DMEM) 48 ml (24%), glycerol 40 ml (20%), squalene 10 ml (5%), aluminum hydroxide 1 ml (0.5%), Tween 80 1 ml (0.5%), 백신 100 ml (농도: 20 mg/ml) (50%) 비율로 합성하여 보조제를 첨가한 백신을 제조하였다.
- 백신 접종은 시험용 수조에 사육중인 조피볼락 3 그룹으로 나누어, 각각 FKC 보조제가 첨가된 백신 및 멸균생리식염수(대조구)를 투여하였다. 시험 백신을 어체당 0.
- 백신 접종은 시험용 수조에 사육중인 조피볼락 3 그룹으로 나누어, 각각 FKC 보조제가 첨가된 백신 및 멸균생리식염수(대조구)를 투여하였다. 시험 백신을 어체당 0.1 ml씩 근육(포르말린 사균 백신) 및 복강(보조제가 첨가된 백신)에 주사하였으며 최종 농도가 1 mg/fish가 되도록 하였다. 시험 백신의 방어 효과를 조사하기 위하여 백신 접종후 44일과 58일째 공격 시험을 실시하였으며, BHIA에서 배양한 A.
- 1 ml 씩 복강 주사하였다. 각 실험구당 10마리씩 주사하였으며, 인위감염 후 2주 동안 누적폐사율을 조사하였다(Fig. 1). 인위감염 시험 후에 폐사어의 경우, BHIA 배지를 사용하여 세균 재분리하여 배양된 균을 확인하였다.
대상 데이터
- 시험어는 A. salmonicida의 감염이력이 없는 건강한 조피볼락(평균 체중: 20.3 g, 평균 길이: 10.9 cm)을 선정하여 실험에 사용하였다. 시험용 수조는 약 600 L 순환 수조를 사용하여 시험구당 100미씩 수용하여 관리하였다.
- 9 cm)을 선정하여 실험에 사용하였다. 시험용 수조는 약 600 L 순환 수조를 사용하여 시험구당 100미씩 수용하여 관리하였다. 수온은 15±1℃로 유지하고, 시판용 배합사료를 3일에 1회 공급하였다.
- 2015년 1월 여수에 위치한 조피볼락 양식장에서 분리된 A. salmonicida KACC000P 균주를 백신제 조에 사용하였다. 순수 분리된 세균 집락은 NaCl 이 1% 함유된 brain heart infusion agar (BHIA)에접종하여 15℃에서 3일간 배양하였으며, 멸균생리식염수에 세균 집락을 현탁한 후에 포르말린(37% formaldehyde)을 최종적으로 1% 농도가 되도록 처리하여 실온에서 2시간 반응시킨 후(30분 간격 voltex) 4℃에서 24시간 동안 두어 FKC를 제작하여 항원으로 사용하였다.
성능/효과
- 시험백신을 접종한 후 44일째 5×104 CFU/fish의농도로 A. salmonicida균을 인위 감염 시험한 결과, 백신을 처리하지 않은 대조구(Cont)에서는 3일째부터 폐사어가 관찰되기 시작하였으며, 감염실험 후 6일째 100%의 누적폐사율을 나타내었다.
- 시험백신을 접종한 후 58일째 A. salmonicida로 6.5×105 CFU/fish로 인위감염을 실시한 결과, 백신을 처리하지 않은 대조구(Cont)에서는 3일째부터 폐사어가 관찰되기 시작하였고 감염실험 후 5일째 100%의 누적폐사율을 나타내었다.
- salmonicida가 분리 되었다(Data not shown). 이상의 결과, 대조구보다 백신처리구에서 A. salmonicida에 의한 폐사율이 낮게 나타나는 것으로 보아 백신 미처리구(대조구): 100%, 포르말린 사균백신: 80%, 보조제가 첨가된 백신: 30%), 본 연구에서 제작된 백신은 A. salmonicida에 대한 방어 효능이 있는 것으로 확인 되었다. 특히, 보조제가 첨가된 백신의 경우는 대 조구에 비해 70%의 상대생존율을 나타내는 것을 나타났다(Fig.
- salmonicida에 대한 방어 효능이 있는 것으로 확인 되었다. 특히, 보조제가 첨가된 백신의 경우는 대 조구에 비해 70%의 상대생존율을 나타내는 것을 나타났다(Fig. 2).
- 3). 비록 보조제가 첨가되지 않은 백신 처리구(Vac)에서 인위감염 실험 후 높은 폐사율을 나타내었으나, 보조제 첨가 유무에 관계없이 백신을 처리하였을 때 대조구보다 A. salmonicida의 인위감염에 의한 폐사율이 낮게 나타나는 것으로 보아 본 연구에서 제작된 백신은 포르말린 불활화 A. salmonicida 백신에 대한 방어 효능이 있을 것을 판단된다. 그러나 본 연구에서 결과처럼 A.
- , 2013). 본 연구에서도 squalene과 aluminum hydroxide 보조제를 사용한 실험구의 RPS가 백신 접종 후 44일째 70%, 58일째 50%로 나타나 보조제가 백신의 효능을 증진시키고, 지속성을 높여 주는 것으로 판단되었다. 일반적으로 squalene과 같이 유제를 활용한 면역보조제의 경우 과도한 면역반응과 독성이 있는 것으로 알려져 있으나, 본 연구에서 사용한 보조제의 경우 조피볼락의 독성은 없는 것으로 확인되었다.
- 본 연구에서도 squalene과 aluminum hydroxide 보조제를 사용한 실험구의 RPS가 백신 접종 후 44일째 70%, 58일째 50%로 나타나 보조제가 백신의 효능을 증진시키고, 지속성을 높여 주는 것으로 판단되었다. 일반적으로 squalene과 같이 유제를 활용한 면역보조제의 경우 과도한 면역반응과 독성이 있는 것으로 알려져 있으나, 본 연구에서 사용한 보조제의 경우 조피볼락의 독성은 없는 것으로 확인되었다.
후속연구
- salmonicida 백신에 대한 방어 효능이 있을 것을 판단된다. 그러나 본 연구에서 결과처럼 A. salmonicida 불활화 백신의 효능과 지속성을 높이기 위해서는 보조제가 꼭 필요할 것으로 판단된다. 본연구에서 사용되는 혼합한 백신 보조제는 aluminum hydroxide는 가장 일반적으로 사용하는 동물용 백신 보조제로써, 단백질 항원을 흡착하여 천천히 방출함으로써 면역증강을 유도하는 것으로 알려져 있다(Gudding et al.
- 일반적으로 조피볼락과 같이 가두리에서 사육하는 어종의 경우 육상 양식어종에 비해 백신 주사 접종의 어려움이 있다. 본 연구를 기점으로 하여 향후 조피볼락 등 가두리 어종에 대한 백신 연구와 개발이 지속적으로 이루어지기를 바란다.
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