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문제 정의
- 본 연구에서는 RGNNV genotype에 속하는 NNV에 대한 MAb를 생산하고자 하였다. 정제한 NNV를 사용하여 SDSPAGE를 실시한 결과, 약 41 kDa의 분자량이 확인되었다(data not shown).
- 본 연구에서는 RGNNV genotype에 속하는 SgNag05 분리주를 사용하여 MAb를 제작한 결과, 총 6개의 MAb를 생산하였다. 6개의 MAb는 NNV의 구조 단백질(41 kDa)을 인식하였고, NNV와 NNV에 감염된 뇌조직 마쇄액에 특이적으로 반응하였으며, SSN-1 세포, 5종의 어류바이러스(MABV, IPNV, VHSV,HIRRV, IHNV) 및 정상 능성어의 뇌조직 마쇄액에는 반응하지 않았다.
- 본 연구에서는 양식 현장에서 신속한 진단에 용이하게 적용될 수 있는 면역학적 진단법의 개선과 보급을 위한 목적으로 NNV에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody, MAb)를 제작한 후 항체의 특성을 평가하였다.
제안 방법
- 1차 항체로는 본 연구에서 제작한 MAb를 50μL씩 분주하였으며, 2차 항체는 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG serum (Youngin, Korea)을 5% skim milk로 1,000배 희석하여 well 당 50 μL씩 분주였다.
- 6개의 MAb는 NNV의 구조 단백질(41 kDa)을 인식하였고, NNV와 NNV에 감염된 뇌조직 마쇄액에 특이적으로 반응하였으며, SSN-1 세포, 5종의 어류바이러스(MABV, IPNV, VHSV,HIRRV, IHNV) 및 정상 능성어의 뇌조직 마쇄액에는 반응하지 않았다.
- 3. ELISA analysis using brain tissues of NNV-infected sevenband grouper (D1, 108.55TCID50/mL; D2, 108.55TCID50/mL; D3, 108.8 TCID50/mL) and uninfected sevenband grouper (C1, C2 and C3) and six monoclonal antibodies (2B1, 2B11, 2C12, 13C1-1, 13C1-2 and 14D11).
- ELISA 발색액(100 mM Na2HPO4, 50 mM citric acid, 1 mg/mL o-phenylenediamine, 0.03% H2O2)을 각 well에 50μL씩 분주하여 발색하였다.
- ELISA는 정제된 바이러스액을 96 wellplate에 50 μL (200 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 한 후 뒷부분에 설명된 방법에 따라 실시하였다.
- 정제된 NNV를 마우스에 면역시킨 후 마우스의 비장조직과 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 3회 클로닝하여 최종적으로 6개의 MAb를 선별하였다(2B1, 2B11, 2C12, 13C1-1, 13C1-2, 14D11). 6개의 MAb 와 정제된 NNV를 사용하여 Western blot을 실시한 결과, 6개 MAb 모두 NNV의 구조 단백질을(41 kDa) 인식하였다(Fig.
- NNV 투석액을 column에 넣고 15 mM Tris-HCl (pH 8.0)이 들어있는 500, 600, 700, 1000 mM의 NaCl 용액을 사용하여 1 mL씩 추출한 후, 700 mM의 NaCl 추출물을 사용하여 centrifugal ultrafiltration (104분획분자량, Vivaspin, Sartorius, Germany)으로 농축하였다.
- NNV를 SSN-1 세포에 접종하여 배양한 후 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 배양액내의 세포 잔유물질을 제거한 상층의 부유액을 채취하였다.
- 본 연구에서 제작된 MAb와 정제된 NNV, NNV (분리주,SgNag05와 Gemunodo06)에 감염된 SSN-1 세포와 정상 SSN1 세포를 사용하여 Laemmli (1970)과 Towbin et al. (1979)의 방법에 따라 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)와 Western blot ting을 실시하였다.
- 선별된 MAb의 isotyping은 pierce rapid ELISA mouse MAb isotyping kit (Thermo, USA)를 사용하여 결정하였다.
- 최종 면역 후 3일째, 마우스로부터 비장을 분리한 후 polyethylene glycol (Roche, Germany)을 사용하여 myeloma 세포(SP2/0-Ag14)와 융합시킨 후 fetal bovine serum이 10% 첨가된 hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)배지로 suspension 시킨 후 96 well plate에 분주하여 37℃로 설정된 CO2 배양기에서 배양하였다. 양성 hybridoma는 정제된 NNV를 사용하여 ELISA로 선별하였고 3회 이상 제한 희석법으로 클로닝하였다. ELISA는 정제된 바이러스액을 96 wellplate에 50 μL (200 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 한 후 뒷부분에 설명된 방법에 따라 실시하였다.
- 정제된 NNV (약 20 μg)와 complete Freund’s adjuvant (Gibco, USA)를 동량으로 섞어 BALB/c 마우스의 복강에 1차 접종한 후, 정제된 NNV (약 20 μg)를 사용하여 7일 간격으로 2회 접종하였다.
- 정제된 NNV를 마우스에 면역시킨 후 마우스의 비장조직과 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 3회 클로닝하여 최종적으로 6개의 MAb를 선별하였다(2B1, 2B11, 2C12, 13C1-1, 13C1-2, 14D11).
- 제작된 MAb의 특이도를 조사하기 위해 6종의 어류바이러스, NNV에 감염된 능성어의 뇌조직 마쇄액 및 정상 뇌조직 마쇄액을 항원으로 사용하여 ELISA를 실시하였다(Fig. 2, 3).
- 채취된 상층액은 106의 분획분자량의 biotech cellulose ester membrane이 들어 있는 투석튜브(Spectrum Laboratories, USA)를 사용하여 15 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 10일간 투석한 후, Hi-trap Q column을 이용한 이온교환크로마토그래피(GE Healthcare, USA)와 고속단백질액체크로마토그래피(ÄKTAprime plus system, GE Healthcare, USA)를 사용하여 NNV 정제를 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 붉바리(Epinephelus akaara)로부터 분리한 SgNag05 분리주(RGNNV genotype)를 실험용 바이러스로 사용하였다(Oh et al., 2012).
- Western blot은 전기영동한 NNV를 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA)에 옮긴 후, 본 연구에서 제작한 MAb (1차 항체)와 alkaline phosphatase (AP)가 붙어 있는 goat anti-mouse IgG (Sigma, USA, 2차 항체)로 반응시키고 AP가 붙어 있는 substrate kit (Bio-Rad,USA)를 사용하여 발색하였다. 양성대조구로 본 연구실에서 보유하고 있는 항 NNV 토끼 항체를 사용하였다.
이론/모형
- NNV에 대한 MAb는 Gye et al. (2018)의 방법에 따라 제작하였다. 정제된 NNV (약 20 μg)와 complete Freund’s adjuvant (Gibco, USA)를 동량으로 섞어 BALB/c 마우스의 복강에 1차 접종한 후, 정제된 NNV (약 20 μg)를 사용하여 7일 간격으로 2회 접종하였다.
- , 2012). NNV의 배양과 정제는 Gye andNishizawa (2016)와 Gye et al. (2018)의 방법에 따라 실시하였다. NNV를 SSN-1 세포에 접종하여 배양한 후 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 배양액내의 세포 잔유물질을 제거한 상층의 부유액을 채취하였다.
- 제작된 MAb의 반응 특이성을 조사하기 위해 RGNNV genotype에 속하는 2개의 NNV 분리주(SgNag05, 108.55 TCID50/mL와 Gemunodo06, 108.3 TCID50/mL), 5종류의 어류바이러스[바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV: 108.05 TCID50/mL), 넙치랩도바이러스 (hirame rhabdovirus, HIRRV: 108.3 TCID50/mL), 전염성조혈 기괴사증바이러스(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV: 107.3 TCID50/mL), 전염성췌장괴사증바이러스(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV: 109.55 TCID50/mL), 해양 버나바이러스(marine birnavirus, MABV: 109.3 TCID50/mL)], NNV(분리주: Yeosu08)에 감염된 능성어의 뇌조직 마쇄액(3개체, 108.55-8.8 TCID50/mL) 및 정상 능성어의 뇌조직 마쇄액을 사용하여 Jeong et al. (2017)의 방법에 따라 ELISA를 실시하였다.
성능/효과
- Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 3회 클로닝하여 최종적으로 6개의 MAb를 선별하였다(2B1, 2B11, 2C12, 13C1-1, 13C1-2, 14D11). 6개의 MAb 와 정제된 NNV를 사용하여 Western blot을 실시한 결과, 6개 MAb 모두 NNV의 구조 단백질을(41 kDa) 인식하였다(Fig. 1). NNV (SgNag05와 Gemunodo06)에 감염된 SSN-1 세포와 정상 SSN-1 세포에 대한 MAb의 반응을 조사한 결과에서는 6개 MAb 모두 NNV에 감염된 SSN-1 세포에서만 41 kDa에서 밴드가 관찰되었다(data not shown).
- 6종의어류바이러스에 대해서는 6개의 MAb 모두 NNV (SgNag05와 Gemunodo06)에 강하게 반응(OD, 0.88-1.42)하였고, 5종의 어류바이러스(MABV, IPNV, VHSV, HIRRV, IHNV)에는 반응하지 않았다(OD, 0.06 이하) (Fig. 2).
- 1). NNV (SgNag05와 Gemunodo06)에 감염된 SSN-1 세포와 정상 SSN-1 세포에 대한 MAb의 반응을 조사한 결과에서는 6개 MAb 모두 NNV에 감염된 SSN-1 세포에서만 41 kDa에서 밴드가 관찰되었다(data not shown). 이상의 결과, 제작된 6개 의 MAb는 Western blot에서 NNV에 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.
- NNV (SgNag05와 Gemunodo06)에 감염된 SSN-1 세포와 정상 SSN-1 세포에 대한 MAb의 반응을 조사한 결과에서는 6개 MAb 모두 NNV에 감염된 SSN-1 세포에서만 41 kDa에서 밴드가 관찰되었다(data not shown). 이상의 결과, 제작된 6개 의 MAb는 Western blot에서 NNV에 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.
- 이상의 결과, 제작된 6개의 MAb는 ELISA에서 NNV에 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.
- 본 연구에서는 RGNNV genotype에 속하는 NNV에 대한 MAb를 생산하고자 하였다. 정제한 NNV를 사용하여 SDSPAGE를 실시한 결과, 약 41 kDa의 분자량이 확인되었다(data not shown). 베타노다바이러스의 캡시드는 42 kDa의 단일 구조 단백질로 구성되어 있어(Schneemann et al.
- 제작된 MAb의 isotyping을 분석한 결과, 6개 항체 모두 H chain은 IgG2a, L chain은 kappa로 확인되었다(data not shown).
후속연구
- A형에는 SJNNV genotype의 NNV, B형에는 TPNNV genotype의 NNV, C형에는 BFNNV와 RGNNV genotype의 NNV가 속한다. 따라서 향후 연구로서 본 연구에서 제작된 MAb를 사용하여 serotype이 다른 NNV 분리주에 대한 반응을 조사해야 할 것이다.
- 이상의 결과, 제작된 MAb는 Western blot과 ELISA에서 RGNNV genotype에 속하는 NNV 분리주들을 검출하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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