[논문]TM-3 cell에서 eritadenine 함유 신령버섯균사체 액체배양물의 testosterone 생성 촉진효과

김영숙; 정재은; 정희정; 문연규; 김정옥; 하영래

doi:10.5352/jls.2018.28.6.648

TM-3 cell에서 eritadenine 함유 신령버섯균사체 액체배양물의 testosterone 생성 촉진효과
Enhancement of Testosterone in TM3 Leydig Cells by an Eritadenine-containing Agaricus blazei Mycelial Liquid Culture Extract 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.6 = no.218, 2018년, pp.648 - 655

김영숙 ((주)HK바이오텍 항노화연구소) , 정재은 ((주)HK바이오텍 항노화연구소) , 정희정 (안전성평가연구소 경남환경독성본부 경남생명자원연구센터) , 문연규 ((주)HK바이오텍 항노화연구소) , 김정옥 ((주)HK바이오텍 항노화연구소) , 하영래 ((주)HK바이오텍 항노화연구소)

초록
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신령버섯 액체배양추출물(Agaricus blazei mycelial liquid culture extract: ABMLCE)과 eritadenine (EA)의 mouse 정소 Leydig TM3 세포에서 testosterone (TS) 생성에 관한 연구를 정상 조건과 산화스트레스 조건에서 수행하였다. 정상 조건에서는 TM3 세포를 DMEM 배지에 배양하면서 EA (0~100 ppm)와 EA (0~50 ppm) + ABMLCE (10 ppm)를 24 hr처리하였다. 산화스트레스 조건에서는 TM3 세포를 $H_2O_2$ ($50{\mu}M$)를 4 hr 처리하고 정상 조건과 동일하게 처리하였다. DMEM 배양물에 함유된 TS 함량, HSD3B2 효소 활성, $5{\alpha}-R2$ 효소 활성과 NO 함량을 assay kit를 사용하여 측정하였다. EA는 정상 조건이나 산화스트레스 조건에서 TS 함량을 유의성 있게 증가시켰고, ABMLCE와 ABMLCE + EA도 TS의 함량을 증가시켰다. TS 전구체 생성에 관여하는 HSD3B2 효소 활성은 두 조건에서 모두 EA, ABMLCE, ABMLCE + EA에 의해서 증가되었다. 또한 TS를 DTH로 전환시켜 TS함량을 감소시키는 역할을 하는 $5{\alpha}-R2$ 효소활성은 정상 조건 및 산화스트레스 조건에서 ABMLCE에 의해서만 감소되었다. Free radical로 작용하는 NO의 함량은 두 조건 모두 EA, ABMLCE, ABMLCE + EA에 의해 감소되었다. 이 결과는 EA, ABMLCE, ABMLCE + EA 처리가 TM3 세포의 HSD3B2 효소 활성을 증가시키고, NO 생성을 억제하여 TS 함량을 증가시켰음을 의미하며 EA + ABMLCE 혼합물이 남성 성기능개선 물질로 사용될 수 있음을 의미한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Enhancement mechanistic actions of testosterone (TS) productions in mouse Leydig TM3 cells by the eritadenine (EA) and/or the Agaricus blazei mycelial liquid culture extract (ABMLCE). Productions of TS in TM3 cells were investigated in normal and oxidative-stressed culture conditions. In the normal culture condition, TM3 cells grown in a Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) were treated with EA (0~100 ppm) and ABMLCE (10 ppm) + EA (0~50 ppm) for 24 hr, and in the oxidative-stressed culture condition, the cells grown in DMEM containing $50{\mu}M$ $H_2O_2$ to induce oxidative stress for 4 h were treated with the same as those in the normal culture condition. TS content, $3{\beta}$-hydroxysteroid dehydrogenase 2 (HSD3B2) enzyme activity, $5{\alpha}$-reductase 2 ($5{\alpha}-R2$) enzyme activity, and free-radical nitric oxide (NO) content in the culture media were measured using their corresponding assay kits. EA, ABMLCE, and ABMLCE + EA significantly, p<0.05, enhanced TS productions in both cultural conditions, relative to control treatment. The activity of the HSD3B2 enzyme, which is involved in the production of precursors for TS production, was elevated by EA, ABMLCE, and ABMLCE + EA treatments in both culture conditions. The activity of the $5{\alpha}-R2$ enzyme, which converts TS to dihydroxytestosterone (DHT), was not significantly affected in either culture condition by EA, ABMLCE, or ABMLCE + EA treatments. The treatments included reduced NO content. These results indicate that EA, ABMLCE, and EA + ABMLCE treatments elevated TS in TM3 cells via the enhancements of HSD3B2 activity and the reduction of NO production, and also imply that EA and ABMLCE or EA + ABMLCE could be useful materials for the production of TS in humans.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

갱년기 남성의 TS 함량을 감소시키는 원인 중 가장 큰 원인은 노화와 산화스트레스이다[6]. 따라서 H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 유발한 TM3 세포에 EA 및 EA + ABMLCE가TS 함량과 남성 성기능과 관련된 biochemical marker 개선효과가 있는지를 조사하였다. TM3 cell에 H₂O₂ (50 μM)를 4hr 처리한 후, EA (0, 10, 50, 100 ppm)와 EA (0, 5, 10, 50 ppm)+ ABMLCE (10 ppm)를 24 hr 처리하여 얻은 DMEM 배양물의 TS, HSD3B2, 5α-R2, NO를 측정하였다.
정소의 Leydig 세포에서 TS의 함량을 증가시키기 위해서는 HSD3B2 효소 활성을 증가시켜야 한다[11]. 본 연구에서mouse 정소의 Leydig TM3 세포에 EA, ABMLCE 및 EA +ABMLCE 처리는 HSD3B2 효소활성을 증가시켰다.
본 연구에서는 ABMLCE와 EA의 남성갱년기 증상인 성기능개선 효과를 mouse 정소 Leydig 세포인 TM3를 사용하여연구하였다. EA, ABMLCE 및 EA와 ABMLCE 혼합물(EA + ABMLCE)은 정상적 배양조건과 H₂O₂로 야기한 산화스트레스 배양조건의 TM3 세포에서 TS 생성을 증가시켰다.

가설 설정

1)NO represents nitric oxide.
5)SC represents Sham control meaning no treatment.
6)NC represents the negative control treated with H₂O₂ only.

제안 방법

AB버섯균사체를 삼각플라스크[500 ml; 배지(탈지대두 1.5%, 황백당 0.5% M_gSO₄ 0.05%, KH₂PO₄ 0.01%) 200 ml 함유]에서 7일간 배양(25℃, 200 rpm; Lab Tech LSI-3016R, Namyangju, Korea)하고, 원심분리(4℃, 7,000 rpm, 20 min;Labgene 1580R, Seoul, Korea)하여 상등액을 회수하였다. 상등액을 진공농축(<65℃, Brix 45; Rotavapor R-300, Buchi, Flawil, Switzerland)하여 AB버섯균사체 액체배양물 ABMLCE 시료를 조제하였다.
HSD3B2와 5α-R2 효소 활성 측정 assay kit의 각 well에 100 μl 시료를 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
NOassay kit의 각 well에 100 μl 시료를 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
TM3 cell에 H2O2 (50 μM)를 4hr 처리한 후, EA (0, 10, 50, 100 ppm)와 EA (0, 5, 10, 50 ppm)+ ABMLCE (10 ppm)를 24 hr 처리하여 얻은 DMEM 배양물의 TS, HSD3B2, 5α-R2, NO를 측정하였다.
TM3 세포를 정상과 산화적 스트레스 조건배양의 세포배양과 동일하게 배양한 후 Control 처리(DMEM 100 μl) 및 시료 처리(DMEM 75 μl + sample 25 μl)를 하고 다시 24 hr 배양(37℃,5% CO2 incubator; Thermo Fisher Scientific)하였다.
TS assay kit의 well에 시료 100 μl 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1Multi reader)를 측정하였다.
따라서 H2O2 (50 μM)에 의해 산화스트레스를 받은TM3 cell에서 EA (0, 10, 50, 100 ppm)와 EA (0, 10, 50 ppm)+ ABMLCE (10 ppm) 처리가 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다(Table 6).
산화스트레스를 받지 않은 TM3 세포에 EA (0, 10, 50, 100ppm: CCK-8 assay에 의한 EA의 TM3에 대한 무독성 농도)를24 hr 처리하여 얻은 DMEM 배양물에 대해 남성 성기능과 관련되는 biochemical marker (TS, HSD3B2, 5α-R2, DHT,NO)를 assay kit로 측정하였다. 또한 ABMLCE (10 ppm:CCK- 8 assay에 의한 ABMLCE의 TM3에 대한 무독성 농도)+ EA (0, 10, 50 ppm)를 처리하여 EA와 ABMLCE의 시너지효과도 조사하였다.
산화스트레스를 받지 않은 TM3 세포에 EA (0, 10, 50, 100ppm: CCK-8 assay에 의한 EA의 TM3에 대한 무독성 농도)를24 hr 처리하여 얻은 DMEM 배양물에 대해 남성 성기능과 관련되는 biochemical marker (TS, HSD3B2, 5α-R2, DHT,NO)를 assay kit로 측정하였다.
상등액을 진공농축(<65℃, Brix 45; Rotavapor R-300, Buchi, Flawil, Switzerland)하여 AB버섯균사체 액체배양물 ABMLCE 시료를 조제하였다.
생성된 DCF fluorescence를 490 nm (Synergy H1 Multi reader; BioTek, St, Louis)에서 측정하여 cell viability를 계산하였다.
시료를 TM3 cell에 처리하여 얻은 DMEM 배양물의 TS 함량은 TS assay kit (Bio Vision Inc., Mountain View, CA)로 분석하였다. TS assay kit의 well에 시료 100 μl 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1Multi reader)를 측정하였다.
시료를 처리한 TM3 cell로부터 얻은 DMEM 배양물의 HSD3B2 및 5α-R2 효소 활성은 HSD3B2 assay kit (MyBioSource) 및 5α-R2 assay kit (MyBioSource)로 분석하였다.
시료를 처리한 TM3 cell로부터 얻은 DMEM 배양물의 NO함량 측정은 NO assay kit (MyBioSource)로 분석하였다. NOassay kit의 각 well에 100 μl 시료를 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
여기에 Control 처리(DMEM 200 μl) 및 시료 처리(DMEM 150 μl+ sample 50 μl)를 하고 다시 24 hr 배양(37℃, 5% CO2 incubator; Thermo Fisher Scientific)하였다.
25% trypsin-EDTA 용액(1 ml) (GIBCO Life Science)을 실온에서 1분간 처리한 다음 원심분리(2,000 rpm, 10 min; Vision-1500N, Brushless DC Motor, Dallas, TX)하여 TM3 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 정상적인 배양조건과 H₂O₂를 처리한 산화적인 스트레스 배양조건의 실험 및 cell viability 실험에 사용하였다.
HSD3B2와 5α-R2 효소 활성 측정 assay kit의 각 well에 100 μl 시료를 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다. 효소활성은 외부표준곡선으로부터 계산하였다.

대상 데이터

따라서 EA + ABMLCE는 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다. AB버섯에는 EA가150~200 mg/100 g 함유되어 있지만[1], ABMLCE에는 아주소량 함유되어 있어, 본 연구에서는 고순도 EA 화합물을 사용하였다.
TM3는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받았다. TM3는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO Life Science, Great Island, NY) 배양액(FBS 10%, penicillin 100 μg/ml, streptomycin 100 μg/ml 함유: SigmaAldrich, St.
배양물은 회수하여 TS, HSD3B2, 5α-R2 및 NO 분석에 사용하였다.
배양물은 회수하여TS, HSD3B2, 5α-R2 및 NO 분석에 사용하였다.

데이터처리

Data는 Mean ± SD로 나타내었으며, GraphPad Prisam, version 5.01 (GraphPad Software, Inc., CA)을 이용하여 oneway ANOVA로 분석하다.
Mean간의 유의성 검증은 Tukey’sw test로 검증하였고, 유의성은 p<0.05 이상으로 나타내었다.

이론/모형

시료 처리에 의한 cell viability는 Cell Counting Kit-8(CCK-8; Dojindo, Japan)의 분석 manual에 따라 측정하였다. TM3 세포를 정상과 산화적 스트레스 조건배양의 세포배양과 동일하게 배양한 후 Control 처리(DMEM 100 μl) 및 시료 처리(DMEM 75 μl + sample 25 μl)를 하고 다시 24 hr 배양(37℃,5% CO₂ incubator; Thermo Fisher Scientific)하였다.

성능/효과

2)Mean ± SD of 3 measurements, and means with different small superscript letters represent significantly difference at p<0.05 by Tukey’s w test.
3)SC represents Sham control, meaning no treatment.
3)SC represents Sham control, meaning no treatment.
4)Concentration of ABMLCE in EA-ABMLCE treatments was a 10 ppm.
4)Concentration of ABMLCE in the EA + ABMLCE treatment was a 10 ppm.
4)Concentration of ABMLCE in the EA-ABMLCE treatment was a 10 ppm.
5)Concentration of ABMLCE in the EA + ABMLCE treatment was a 10 ppm.
그러나 EA + ABMLCE 처리의 HSD3B2 효소 활성은EA 농도간의 유의성은 없었다. ABMLCE 처리 및 EA +ABMLCE 처리는 Sham 처리 이상의 수준으로 HSD3B2 효소활성을 증가시켰다.
ABMLCE 처리의 TS 함량은 222 pg/ml이었는데,EA 50 ppm + ABMLCE 처리의 TS 함량은 330 pg/ml (149%)으로 증가하여(p<0.01) EA와 ABMLCE의 시너지효과가 있었다.
Control 처리의 HSD3B2 효소활성은 1,135 pg/ml이었지만EA 100 ppm 처리로 122% 증가되어(p<0.05), EA는 산화스트레스하의 TM3 세포에서 TS 함량을 증가시키는 효과가 있었다.
EA와 ABMLCE의 시너지 효과를 위한 EA + ABMLCE 처리에서 5α-R2 효소 활성은 Negative control 처리(1.05 pg/ml)보다 Control 처리인 ABMLCE 처리에 의해 0.73 pg/ml로 유의성 있게 감소되었다(p<0.05).
EA와 ABMLCE의 시너지효과를 위한 EA + ABMLCE 처리에서 Sham control의 5α-R2 효소 활성은 1.85 pg/ml이었고, ABMLCE 처리에 의해 1.13 pg/ml로 감소되었다(p<0.05).
H2O2만 처리하고EA를 처리하지 않은 Control 처리의 TS 함량은 152 pg/ml이었지만, 이 TS 함량은 EA 100 ppm 처리로 216% 증가하여(p<0.01), EA는 산화스트레스를 받은 TM3 세포에서 TS 함량을 증가시키는 효과가 있었다.
NO 함량은 EA를 처리하지 않은 Control에서 14.1 nmol/l이었지만, EA 100ppm 처리로 74%로 감소되어(p<0.05), EA는 NO 함량을 감소시키는 효과가 있었다.
Negative control 처리(H2O2만 처리)의TS 함량은 152 pg/ml이었는데, ABMLCE 처리로 TS 함량은192 pg/ml으로 192% 증가되어 ABMLCE의 효과를 확인하였다(p<0.05).
Negativecontrol 처리의 NO 함량은 ABMLCE 처리인 Control 처리에 의해 78% 수준으로 감소되어(p<0.05), ABMLCE의 NO 감소효과를 확인하였다.
결론적으로, EA 및 EA + ABMLCE는 정상적인 TM3 세포나 산화스트레스를 받은 TM3 세포에서 3β-HSD-2 효소의 활성을 증가시키고, free radical로 작용하는 NO 생성을 억제하여 TS 함량을 증가시킨다.
그러나 이 Control의 NO 함량은 EA 처리로 감소하여 EA 50 ppm 처리로Sham control 수준으로 감소되었고(p<0.05), EA 100 ppm 처리에 의해 65%인 15nmol/l로 감소되어(p<0.05), EA 처리는 NO의 생성을 억제하였다.
남성갱년기 원인은 스트레스나 노화에 의해 정소세포에서TS의 함량이 감소되기 때문이다[13, 15]. 따라서 본 연구에서 밝힌 산화스트레스를 받은 TM3 세포에서 TS 함량 증가에 대한 EA 단독 또는 EA + ABMLCE 효과를 확인하였다. 따라서EA, ABMLCE 또는 EA + ABMLCE는 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다.
또한 ABMLCE 처리는 Sham control 처리보다HSD3B2 활성을 156% 증가시켜(p<0.01) ABMLCE도 HSD3B2 효소 활성 증가 효과가 있었다.
또한 ABMLCE 처리에 의한 NO 함량은 12.7 nmol/l이었는데, EA 50 ppm + ABMLCE 처리로 9.0nmol/l로 감소되었으며(p<0.05), ABMLCE 처리는 Sham control 처리보다 NO 함량을 90% 수준으로 감소시켰지만 유의성은 없었다.
또한 ABMLCE 처리의 TS 함량은 ABMLCE를 처리하지 않은 Control 처리보다 528% 증가하여(p<0.001) ABMLCE의 TS 함량 증가효과도 있었다.
05). 또한 EA + ABMLCE 처리에서5AR2 효소활성은 EA 처리 농도 증가에 따라 증가하여 EA50 ppm 처리로 124%로 증가되었지만 유의성은 없었다. 이모든 처리에서의 5α-R2 효소활성은 Sham control보다 낮았다(p<0.
또한, ABMLCE 처리는 Sham control 처리의 61% 활성을 나타내었지만, EA + ABMLCE 처리는 Shamcontrol 처리 수준 이하로 감소시키지 못하여 EA와 EA +ABMLCE 처리는 5α-R2 효소 활성에 큰 영향을 미치지 못하였다.
남성갱년기 원인은 스트레스나 노화에 의해 정소의 Laydig세포에서 TS 생성이 감소되기 때문이다[13]. 본 연구에서mouse 정소의 Laydig 세포인 TM3 세포에 EA및 ABMLCE 처리로 TS 함량이 증가되었고, ABMLCE와 EA는 시너지효과가 있었다. 따라서 EA + ABMLCE는 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다.
본 연구의 TM3 세포에서 5α-R2 효소 활성은 EA 100 ppm까지의 처리에 의해 억제되었지만 유의성은 없었다.
산화스트레스를 받은 TM3 세포에서 EA 10 ppm 및ABMLCE 처리는 5α-R2 효소활성을 유의성 있게 낮추었지만,EA 50 ppm 이상 처리와 ABMLCE + EA 처리는 5α-R2 효소활성을 낮추는 효과가 없었다.
이 효소 활성은 ABMLCE 처리 시1,421 pg/ml이었지만, EA 50 ppm + ABMLCE 처리로 1,718pg/ml 로 121% 증가되어(p<0.01), EA + ABMLCE 처리의 효과가 있었다.
이모든 처리에서의 5α-R2 효소활성은 Sham control보다 낮았다(p<0.05).

후속연구

본 연구에서mouse 정소의 Laydig 세포인 TM3 세포에 EA및 ABMLCE 처리로 TS 함량이 증가되었고, ABMLCE와 EA는 시너지효과가 있었다. 따라서 EA + ABMLCE는 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다. AB버섯에는 EA가150~200 mg/100 g 함유되어 있지만[1], ABMLCE에는 아주소량 함유되어 있어, 본 연구에서는 고순도 EA 화합물을 사용하였다.
따라서 본 연구에서 밝힌 산화스트레스를 받은 TM3 세포에서 TS 함량 증가에 대한 EA 단독 또는 EA + ABMLCE 효과를 확인하였다. 따라서EA, ABMLCE 또는 EA + ABMLCE는 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다.
그러나 TM3 세포에서 EA와 ABMLCE + EA 처리는 NO의 생성을 감소시켰다. 이와 같은 결과는 EA 및 EA +ABMLCE는 TM3 세포에서 NO 생성 억제시켜 세포의 노화를 방지함으로써 남성의 갱년기 장애를 개선 할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	EA의 장점은 무엇인가?	AB 버섯균사체 액체배양 추출물(Agaricus blazei mycelial liquid culture extract: ABMLCE)은 성기능개선 효과가 있다는 사례가 있다. 이들 이차대사산물 중 EA는 지방간 및 혈중 콜레스테롤개선에도 효과가 있고[9, 14], angiotensin converting enzyme(ACE) 효소 활성을 저해하여 혈압을 정상화하는 효과[4]와 성기능개선 효과[5]가 있다고 보고되었다.
	신령버섯의 특징은 무엇인가?	신령버섯(Agaricus blazei Murill: AB)은 β-glucan, eritadenine (EA) 등의 수많은 2차대사산물을 함유하고 있어, 항암성, 항산화성 등의 기능성이 뛰어나서 붙여진 이름이다[1]. AB 버섯균사체 액체배양 추출물(Agaricus blazei mycelial liquid culture extract: ABMLCE)은 성기능개선 효과가 있다는 사례가 있다.
	EA + ABMLCE가 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있는 이유는 무엇인가?	남성갱년기 원인은 스트레스나 노화에 의해 정소의 Laydig세포에서 TS 생성이 감소되기 때문이다[13]. 본 연구에서mouse 정소의 Laydig 세포인 TM3 세포에 EA및 ABMLCE 처리로 TS 함량이 증가되었고, ABMLCE와 EA는 시너지효과가 있었다. 따라서 EA + ABMLCE는 남성 갱년기 장애를 극복할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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